We thank Dr. Antonio Virgilio&#160;Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

1. pico de emisión y Cross-talk Determinación (véase también la Figura 2) <ol><li> Con el fin de determinar los picos de emisión y la cantidad de cross-talk entre el donante (cumarina derivado V450) y el aceptor (fluoresceína) colorantes, realizar análisis espectrales de células marcadas con ambos fluoróforos individuales en 405 nm de excitación. </li><li> Determinar un ancho de banda 10 nm dentro del pico de cada colorante que se utilizará para los canales de donante y aceptor (desde 455 hasta 465 nm y aquí 525-535 nm). Trazar la intensidad normalizada sobre la longitud de onda y calcular el porcentaje medio de diafonía del colorante donante en el canal aceptor y viceversa (Figura 2). </li></ol> 2. Preparación de Y. enterocolitica cepas de células Infección Cultura <ol><li> Utilice las siguientes cepas: WA-314-PMK óvulos (WA-314 transformada con los plásmidos PMK-bla 17 y PMK-ova 17, respectivamente) y WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE transformadas con el plásmido PMK-bla 17) </li><li> Al menos dos días antes de la infección por Y. racha enterocolitica cepas WA-314 PMK-óvulos, WA-314 PMK-bla y WA-314ΔE PMK Bla-de crio existencias en placas de agar LB que contenían los antibióticos necesarios (kanamicina para WA-314 PMK-bla y WA-314 PMK-ova ; kanamicina y tetraciclina para WA-314ΔE PMK-bla) y crecer O / N a 27 ° C. Posteriormente mantener las placas durante hasta una semana a 4 ° C. </li><li> Un día antes de la infección inocular 3 ml de medio LB que contienen los antibióticos necesarios con una colonia de las cepas respectivas e incubar O / N a 27 ° C en un agitador a 180 rpm. </li><li> En el día de la infección inocular 2 ml del cultivo O / N en 40 ml de medio LB fresco sin antibióticos y se incuba durante 90 min a 37 ° C en un agitador a 180 rpm para inducir la expresión del sistema de secreción de tipo III. </li><li> Transfiera las culturas en un tubo adecuado y mantener las culturas en hielo oa 4 ° Cde ahora en adelante. Centrifugar los cultivos durante 10 minutos a 5000 xg y 4 ° C. </li><li> Resuspender el sedimento bacteriano en 2-3 ml de PBS helado. Diluir la suspensión bacteriana a una concentración de 8 x 10 8 ufc / ml mediante el uso de un espectrofotómetro. Determinar la densidad óptica correspondiente individualmente. Mantenga esta suspensión en hielo hasta que la infección de las células HeLa. </li></ol> 3. Las células HeLa Chapado <ol><li> Un día antes de semilla de infección de 1,5 x 10 4 células HeLa en 200 l DMEM que contenía 10% de suero inactivado por calor fetal de ternera (FCS) en pocillos de una placa de 96 pocillos y cultivar en un incubador de CO2 al 5% a 37 ° C. Semillas tres pozos para cada cepa (tres tiempos de incubación diferentes). </li></ol> 4. Infección de células HeLa y cargar con CCF4 <ol><li> Infectar las células HeLa mediante la adición de 3,5 l de la suspensión bacteriana a medio y mezclar pipeteando suavemente el medio dos veces. Permitir que las bacterias se sedimentan ena las células a una MOI (fracción de infección) de alrededor de 100 bacterias por célula. Para un curso de tiempo de inicio infecciones a -90 min, -60 min y -30 min y se incuba a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% hasta 0 min para lograr un punto final común. </li><li> Cuando se ha completado la incubación, aspirar cuidadosamente el medio sin la eliminación de las células HeLa y añadir 50 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol para detener la expresión de efectores y probenecid 2,5 mM para reducir la exportación de CCF4. </li><li> En este punto, la transferencia de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y definir los lugares adecuados para su posterior análisis en cada pocillo. Termine este paso dentro de 10 minutos (para los detalles de la adquisición de ver sección 5.1). </li><li> Por pocillo, añadir 70 l de solución de CCF4 / AM de carga (solución de 0,24 l A, 1,2 l solución B, 18,56 l solución C (solución A, B, y C, siempre dentro de kit / AM carga CCF4) y 50 l de PBS (que contienen 20 g / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubar durante 5 min a TA. A partir de ahora el trabajo sin interrupciones. </li><li> Aspirar la solución de carga y añadir 100 l de PBS que contenía 20 mg / ml de cloranfenicol y probenecid 2,5 mM usando un multi pipeta. A continuación, traslado rápido de la placa de 96 pocillos en la platina del microscopio y comenzar la adquisición dentro de los 10 min de la aspiración de la solución de carga. </li></ol> 5. barrido láser microscopía y análisis de datos <ol><li> Adquisición de imágen <ol><li> Establecer las condiciones de formación de imágenes de una manera de maximizar el número total de fotones y minimizar fototoxicidad, photobleaching y cross-excitación. <ol><li> En un moderno microscopio láser confocal de barrido, utilice un alto objetivo de inmersión apertura numérica 20X, abrir el agujero de alfiler del detector de 2,5 unidades Airy (es decir, seccionamiento óptico gran angular), elija de alta sensibilidad GaAsP Detectores con donante y aceptor canales simultáneamente activas, profundidad de 8 bits , ~ 750 nm tamaño de píxel, 3 veces promediado marco y ExcitE con 10% de un láser de diodo de 405 nm. </li><li> Para garantizar la correcta cuantificación establecer la ganancia del detector de ambos canales en el mismo valor y evitar los píxeles saturados. Nota: En este caso, las ganancias se establecen en 150%. </li></ol></li><li> Asegúrese de inmersión continua por medio de difusión de la inmersión hasta el fondo de los pozos, por ejemplo, con una jeringa de 1 ml, y evitar la captura de burbujas de aire. </li><li> Activar la luz transmitida y encontrar un campo representante de vista en todos los pozos. Utilice una etapa automática calibrada correctamente y marcar la posición en el software. </li><li> Después de la eliminación de la placa para la tinción (ver sección 4.3), vuelva a insertar la placa y añadir un peso en la parte superior para evitar la deriva focal. Revise las posiciones guardadas con el modo de escaneo láser y ajustar el enfoque y la posición lateral correctamente. </li><li> Ajuste el lapso de tiempo de 2 minutos, la duración de 2 horas y comenzar la adquisición. </li></ol></li><li> Cuantificación de imagen (ejemplos se dan para Bitplane Softwson tales como Imaris) <ol><li> Importe el conjunto de datos en un software que permite a los cálculos aritméticos de matrices de píxeles. Para ello, arrastrar y soltar el archivo de origen que contiene tanto el donante como el canal aceptor en el icono del software. </li><li> Reste el fondo en ambos canales usando el mismo desplazamiento. Para ello, haga clic en Menú y luego haga clic en Imagen&gt; Tratamiento&gt; Base Resta. Seleccione cada canal e introduzca el valor basal. </li><li> Corregir el sangrado a través del canal de donante (Ch1) en el canal aceptor (CH2) con el factor de corrección f pre-determinado (véase 1.1), la creación de un nuevo canal: Ch2 &#39;= CH2 - Ch1 * f NOTA: Una purga a través del aceptor en el canal de donante no fue detectable por encima del nivel de ruido. <ol><li> Haga clic en Menú&gt; Procesamiento de Imágenes&gt; Canal Aritmética y entrar abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Posteriormente eliminar Canal 2 haciendo clic en Menú&gt; Editar&gt; Borrar Canales. Asegúrese de que elpurga a través del canal aceptor corregida queda como nuevo canal 2. Opcional: Cambie el canal de color del gris al color original, vaya a Menú&gt; Propiedades Editar&gt; Imagen. Seleccione el canal 4&gt; asignada color&gt; Color Base y cambiarlo a, por ejemplo, verde. </li></ol></li><li> Crear un nuevo canal con la siguiente operación para determinar el coeficiente relativo FRET: Ch3 = Ch2 &#39;/ (Ch1 Ch2 +&#39;) <ol><li> Vaya a Menú&gt; Procesamiento de Imágenes&gt; Canal Aritmética y entrar ch2 ./ (CH1 + CH2) </li></ol></li><li> Para la visualización correcta del canal de FRET en una imagen de 8 bits, crear un cuarto canal: Ch4 = 255 * Ch3 <ol><li> Vaya a Menú&gt; Procesamiento de Imágenes&gt; Canal Aritmética y escriba 255 * ch3. Cambie el color de canal por ir a Menú&gt; Propiedades Editar&gt; Imagen. Seleccione el canal 4&gt; asignada color&gt; Color Cuadro Archivo&gt; Jet. </li></ol></li><li> Aplicar un filtro de mediana de 3x3 a los canales CH3 y CH4 that reducirá el ruido en las imágenes. Para ello, haga clic a Menú&gt; Procesamiento de Imágenes&gt; Suavizar&gt; La mediana de filtro. Seleccione ambos canales y aplicar un tamaño de filtro &quot;3x3x1&quot;. </li><li> Para la cuantificación de señales celulares, detectar las células de CH4 configurando adecuadamente el desplazamiento y filtrar las estructuras por tamaño para excluir estructuras demasiado pequeñas. <ol><li> Seleccione el Surpass Ver y haga clic en el icono de &quot;Añadir nuevas superficies&quot;. Definir los parámetros del algoritmo de detección en la ventana de la superficie. Para un procesamiento más rápido, activar el dos casillas de verificación &quot;Segmento solamente una zona de interés&quot; y &quot;toda imagen del proceso, finalmente&quot;. Definir la región de interés mediante la edición de sus dimensiones. </li><li> Seleccione el canal 4 como canal de origen y establecer el umbral Umbral&gt; Sustracción de fondo (Contraste Local) y ajuste de diámetro a 10 micras. Ajuste el umbral de intensidad mínima manualmente a 0 y el umbral máximo a la intensificación máximadad. Filtre las estructuras por área y establecer el valor mínimo a, por ejemplo, 187 μm². Termine la detección superficie. </li></ol></li><li> Extraer los valores medios de intensidad de la fluorescencia del donante (Ch1) y el coeficiente de FRET relativa (CH3) y sus desviaciones estándar en la entidad celular. Para ello, vaya a las propiedades de la superficie. Cambiar el aspecto de las estructuras mediante la selección de superficies Estilo / Calidad&gt; Superficie. Seleccione todas las estructuras haciendo clic en la ficha filtros. Unificar las estructuras detectadas por ir al proceso de selección&gt; Unify. Exportar las estadísticas de superficie a MS Excel haciendo clic en la pestaña de estadísticas&gt; Exportar Estadísticas de archivo. </li><li> Trazar estos valores a través del tiempo. Identificar el intervalo de 10 min de máxima pendiente del incremento de fluorescencia del canal de donantes para cada condición como un parámetro razonable para representar la cantidad de efector translocado. Calcular la pendiente m = Δ como la intensidad de fluorescencia del donante / tiempo Δ (min). </li></ol></li&gt; </ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Estamos aquí, aplicado con éxito un ensayo basado TEM-1 reportero beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación efector por Y. enterocolitica. Muchas variaciones diferentes de esta técnica sensible, específico y relativamente sencillo han sido descritos en la literatura. En este estudio de microscopía de barrido láser se llevó a cabo para la detección más sensible y precisa de las señales de fluorescencia. Específicamente, la corrección para la diafonía entre el donant...

Tipo III sistemas de secreción son máquinas especializadas proteína de exportación utilizados por diferentes géneros de bacterias gram-negativas para entregar directamente proteínas efectoras bacterias codificados en las células diana eucariotas. Mientras que la maquinaria de secreción en sí está altamente conservada, conjuntos especializados de proteínas efectoras han evolucionado entre las diferentes especies bacterianas para manipular vías de señalización celular y facilitar estrategias de virulencia bacterianas específicas 1. En caso de Yersinia, hasta siete proteínas efectoras, llamados (proteínas externas de Yersinia) Yops, se translocan al entrar en contacto la célula huésped y actuar conjuntamente para subvertir las respuestas de células inmunes tales como la fagocitosis y producción de citoquinas, es decir, para permitir la supervivencia extracelular de las bacterias 2-4. El proceso de translocación está estrechamente controlada en las diferentes etapas 5. Se establece que la activación primaria de la T3SS se desencadena por su contacto con el ce objetivoll 6. Sin embargo, el mecanismo exacto de esta iniciación aún no se ha dilucidado. En Yersinia un segundo nivel de la llamada puesta a punto de la translocación se consigue altura o baja regulación de la actividad de las proteínas celulares Rho GTP vinculante Rac1 o RhoA. La activación de Rac1 por ejemplo invasina o citotóxico del factor necrosante Y (CNF-Y) conduce a una mayor translocación 7-9, mientras que el GAP (proteína activadora de GTPasa) Función de translocado YopE abajo-regula la actividad de Rac1 y en consecuencia disminuye la translocación por un tipo de retroalimentación negativa de mecanismo de 10,11. Métodos válidos y precisos son el requisito previo para investigar cómo se regula la translocación durante la interacción célula huésped Yersinia. Muchos sistemas diferentes se han utilizado para este propósito, cada uno con ventajas y desventajas específicas. Algunos enfoques se basan en la lisis de las células infectadas pero no bacterias por diferentes detergentes seguido por análisis de transferencia Western. The inconveniente común de estos métodos es que la lisis bacteriana menor pero inevitable potencialmente contamina el lisado celular con proteínas efectoras bacterias asociadas. Sin embargo, se propusieron tratamiento de células con proteinasa K para degradar las proteínas efectoras extracelulares y uso posterior de digitonina para la lisis selectiva de las células eucariotas para minimizar este problema 12. Es importante destacar que estos ensayos dependen crucialmente anticuerpos anti-efectoras de alta calidad, que en su mayoría no están disponibles comercialmente. Los intentos de utilizar fusiones traduccionales de las proteínas efectoras y las proteínas fluorescentes como GFP para controlar la translocación no tuvieron éxito debido probablemente a la estructura terciaria globular de las proteínas fluorescentes y la incapacidad del aparato de secreción a desplegarse antes de la secreción de 13. Sin embargo, varias etiquetas diferentes reportero como el cya (calmodulina dependiente adenilato ciclasa) dominio de la toxina Bordetella pertussis cyclolysin 14 o Flashetiqueta se utiliza con éxito para analizar la translocación. En el primer ensayo se usa la actividad enzimática de cya para amplificar la señal de la proteína de fusión intracelular, mientras que la etiqueta Flash, un tiempo muy corto de tetracisteína (4Cys) tag motivo, permite el etiquetado con el flash colorante biarsénico sin perturbar el proceso de la secreción 15. El enfoque aplicado aquí se informó por primera vez por Charpentier et al., Y se basa en la conversión intracelular de la transferencia de energía de resonancia Förster (FRET) colorante CCF4 por translocados efector TEM-1 beta-lactamasa fusiones 16 (Figura 1A). CCF4 / AM es un compuesto de células permeante en el que un derivado de cumarina (donante) y un resto de fluoresceína (aceptor) están unidas por un núcleo de cefalosporina. A la entrada pasiva en la célula eucariota, la no fluorescente esterificado compuesto CCF4 / AM es procesada por esterasas celulares a la CCF4 cargado y fluorescente y por lo tanto atrapadodentro de la célula. La excitación de la fracción de cumarina a 405 nm en los resultados de FRET a la fracción de fluoresceína, que emite una señal de fluorescencia verde a 530 nm. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina por la FRET beta-lactamasa se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul at460 nm. Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, se utilizó la técnica en un modelo de infección de ratón para identificar las poblaciones de leucocitos específicos para la translocación in vivo 17-19 de. Lectura de las señales puede llevarse a cabo utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. Es de destacar que el método también ofrece la posibilidad de controlar la translocación en tiempo real mediante microscopía de células vivas durante el proceso de infección 20,21. Aquí microscopía de fluorescencia de escaneo láser se aplicó durante readout de señales de fluorescencia, ya que proporciona mayor sensibilidad y precisión. En particular, la capacidad para ajustar la ventana de emisión con una precisión nanométrica en combinación con detectores de alta sensibilidad optimizada facilita la detección de fluorescencia y minimizar la diafonía. Además esta configuración microscopía puede ser adaptado para la monitorización en tiempo real de translocación y potencialmente permite para el análisis simultáneo de interacción huésped-patógeno a nivel celular. En este estudio, las tasas de translocación de una Y. Se analizaron ejemplarmente enterocolitica cepa de tipo salvaje y un mutante de deleción YopE exhibiendo un fenotipo hypertranslocator 10,11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1068">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:373px;">LB-Agar</td>
			<td style="width:209px;">Roth</td>
			<td>X969.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB-Medium</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X968.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate (black, clear bottom)</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td>
			<td>Gibco/Life Technologies</td>
			<td>31966-047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8761-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K1095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4895</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat anti-Mouse CD8a</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>560469</td>
			<td>Used for peak emission and cross-talk determination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol W immersion oil&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444969-0000-000</td>
			<td>Refractive index = 1.3339 @ 23 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP5 II confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td>2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 7.6 software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>Plugins included ImarisXT and MeasurementPro</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab compiler runtime</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism 5</td>
			<td>GraphPad software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of yersinia enterocolitica effector translocation into host cells using beta-lactamase effector fusions

Muchas bacterias gram-negativas, incluyendo patógenos Yersinia spp. Emplean tipo III sistemas de secreción de trasladar proteínas efectoras en células diana eucariotas. Dentro de la célula huésped proteínas efectoras manipular las funciones celulares en beneficio de las bacterias. Para comprender mejor el control de la secreción de tipo III durante la interacción célula huésped, sensible y ensayos precisos para medir la translocación son obligatorios. Se describen la aplicación de un ensayo basado en la fusión de un fragmento de proteína efectora Yersinia enterocolitica (proteína externa Yersinia; YopE). Con TEM-1 beta-lactamasa para el análisis cuantitativo de la translocación El ensayo se basa en la escisión de una célula permeante FRET de colorante (CCF4 / AM) translocado por fusión beta-lactamasa. Después de la escisión del núcleo de cefalosporina de CCF4 por la beta-lactamasa, FRET de cumarina a la fluoresceína se interrumpe y la excitación de la fracción de cumarina conduce a la emisión de fluorescencia azul.Diferentes aplicaciones de este método se han descrito en la literatura destacando su versatilidad. El método permite el análisis de la translocación in vitro y también in vivo en, por ejemplo, en un modelo de ratón. La detección de las señales de fluorescencia se puede realizar utilizando lectores de placas, análisis FACS o microscopía de fluorescencia. En la configuración descrita aquí, en la translocación vitro de fusiones efectoras en células HeLa por diferentes mutantes Yersinia es supervisado por microscopía de barrido láser. Grabación de la conversión intracelular de la reportero FRET por el efector de fusión beta-lactamasa en tiempo real proporciona resultados cuantitativos robustos. Aquí mostramos los datos de ejemplares, lo que demuestra una mayor translocación por una Y. enterocolitica YopE mutante en comparación con la cepa de tipo salvaje.

Para demostrar la capacidad del método descrito para analizar cuantitativamente efector translocación en las células diana, se estudiaron dos cepas de Yersinia con diferentes cinéticas de translocación: Y. enterocolitica cepa de tipo salvaje WA-314 (serogrupo O8, que alberga el plásmido de virulencia pYVO8 22) y su derivado WA-314ΔYopE (WA-314 albergar pYVO8ΔYopE 23). Trabajos anteriores mostraron que Y. mutantes que carecen enterocolitica exhibición Yop...

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Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Análisis de<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Efector translocación en las células huésped Usando beta-lactamasa Efector fusiones

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

analysis-yersinia-enterocolitica-effector-translocation-into-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

8.5K vistas.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

RNAi detección de los factores del huésped implicados en Vaccinia Infección del virus utilizando Drosophila Celdas

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

Investigación

Inmunología e Infección

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Ensayo in vitro para evaluar el impacto de inmunoreguladoras Caminos de CD4 T función específica para el VIH efector celular

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

Aplicación de Ensayo inmunoensayo de largo plazo culta Interferón-γ ligado a enzimas para la evaluación efectoras y de memoria T respuestas celulares en el ganado

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Desenredar la función de un efector bacteriana de una planta de patógenos no cultivables Uso de una levadura de dos híbridos pantalla

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable dry eye animal model to test novel therapeutics to treat autoimmune dry eye conditions. This protocol describes a chronic autoimmune dry eye rat model. Lewis rats were immunized with an emulsion containing lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund&#39;s adjuvant. A second immunization with the same antigens in incomplete Freund&#39;s adjuvant was administered two weeks later. These immunizations were administered subcutaneously at the base of the tail. To boost the immune response at the ocular surface and lacrimal glands, lacrimal gland extract and ovalbumin were injected into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands 6 weeks after the first immunization. The rats developed dry eye features, including reduced tear production, decreased tear stability, and increased corneal damage. Immune profiling by flow cytometry showed a preponderance of CD3+ effector memory T cells in the eyeball.

This report describes a method to induce chronic experimental autoimmune dry eye in Lewis rats through immunization with an emulsion of rat lacrimal gland extract, ovalbumin, and complete Freund's adjuvant, followed by the injection of lacrimal gland extract and ovalbumin into the forniceal subconjunctiva and lacrimal glands six weeks later.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

Un método para evaluar las funciones efectoras mediadas por Fc inducidas por los anticuerpos específicos de la hemaglutinina de la gripe

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal