Investigación en el laboratorio Spagnoli. es un proyecto financiado por la Asociación Helmholtz, subvención del 7 º PM-IRG-2008-ENDOPANC y ERC-2009-Starting Grant hepatopáncreas.

El protocolo descrito aquí es una adaptación de la técnica originalmente descrita en Percival y Slack 9 y optimizado para la microscopía confocal. 1. Recubrimiento de platos de cristal cultivo de fondo Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. <ol><li> Explantes pancreáticos se cultivan en 35-mm placas de Petri con 20-mm de diámetro con fondo de vidrio micropocillo (por ejemplo MatTek Corporation). Use un plato con fondo de cristal por explante cultura y para toda la duración del cultivo. En el día antes de la disección y el aislamiento de las yemas de páncreas, capa de los micropocillos de fondo de cristal con fibronectina. </li><li> Diluir la fibronectina estéril en cultivo celular de agua de grado a un 50 mg / ml de concentración final y añadir un volumen mínimo de él (~ 150 l) en los pocillos de 20-mm de las placas de MatTek cubren toda la superficie de vidrio (Figura 1E). Coloque los platosen un refrigerador a 4 º C para la incubación durante la noche. </li><li> En el día de la disección, aspirar la fibronectina, enjuague la microplaca de cultivo celular con agua de grado y añadir un volumen mínimo de 150 l de BME (Medio Basal de Eagle) suplementado con Pen / Strep (1%), glutamina (1% ) y 50 ug / ml de gentamicina [Medio Disección]. Dejar los platos recubiertos en la campana de flujo laminar hasta que esté listo para la placa de los explantes. </li></ol> Si no todos los platos recubiertos de fibronectina se utilizan, pueden ser almacenados durante un máximo de 1 semana a 4 ° C. No dejes secado de la vajilla, los llenan de Medio Disección y colocarlos en el refrigerador. Además de la fibronectina, los explantes pancreáticos se han cultivado con éxito en varios sustratos, como la laminina 9, 10,11 matrigel o membranas microporosas 12. Debido a sus efectos sobre la ramificación, se utiliza fibronectina 9 como sustrato. 2. Disección de DBud páncreas Orsal de E11.5 - E12.5 embriones de ratón <ol><li> Programado embarazadas ratones hembra en el día embrionario (E) 11,5 o 12,5 embriones son sacrificados y se recogieron usando instrumentos de disección previamente limpiados con un 70% de etanol. Coloque el útero diseccionado en 10-cm placas que contenían PBS enfriado en hielo suplementado con 50 g / ml de gentamicina. </li><li> Bajo un microscopio estereoscópico con iluminación desde arriba, separada del útero en segmentos de embriones individuales utilizando pequeñas tijeras o fórceps Dumont, que separar el músculo del útero y la toma de embriones individuales, que están rodeados por la decidua. Utilizar técnicas estándar de disección de embrión de 13 para exponer los embriones y quitar el saco vitelino y el amnios. Posteriormente, retirar la parte superior del cuerpo del embrión (por encima del hígado) y la región de la cola. Esto permitirá que la exposición de órganos internos (Figura 1B). Transferir el cuerpo mediados de los embriones en 10-cm placas que contienen medio enfriado con hielo disección BME. </li><li> Ahorautilizar transiluminación sólo desde abajo para visualizar y analizar el brote pancreático dorsal bajo el microscopio estereoscópico. Suavemente, abra la mitad del cuerpo del embrión mediante una incisión lateral con fórceps. Localice el estómago y el bazo. El brote pancreático dorsal está unida lateralmente a la región posterior del estómago (Figura 1C). Utilizando pinzas Dumont, diseccionar el brote pancreático dorsal de las estructuras adyacentes, tales como el estómago y el bazo, pero dejando algo de mesénquima alrededor del epitelio (Figura 1D). Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir la yema aislado en una placa de 35-mm de Petri que contenía medio frío disección BME suplementado con 10% suero de ternera fetal [Medio de cultivo]. Repita estos pasos hasta que todos páncreas están aislados. Si páncreas de diferentes genotipos son aislados, manténgalos separados utilizando Nunc de 4 pocillos. </li></ol> 3. Revestimiento y Cultura de explantes de páncreas Final de platción de los explantes se lleva a cabo en la sala de cultivo de tejidos y / o en las proximidades de la incubadora de cultivo de tejido para reducir al mínimo el movimiento físico de las culturas. <ol><li> En condiciones estériles en una campana de flujo laminar sustituir el medio Disección BME en los platos recubiertos de fibronectina MatTek con ~ 150 l de medio de cultivo BME pre-calentado a 37 ° C. </li><li> Con cuidado, transferir los explantes pancreáticos en platos recubiertos Mattek (un explante por plato) para cultivo a largo plazo utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. Para asegurar la difusión durante el cultivo, el mesénquima que rodea los explantes pueden ser ligeramente rasgado, si es necesario, con una aguja fina. </li><li> Con cuidado, coloque las culturas en un cultivo de tejidos incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante algunas horas para permitir que los explantes se adhieren a los pocillos con fondo de cristal. Una vez que están unidos, se llenan los platos MatTek ml con 1,5 ml de medio de cultivo 2 de BME precalentado a 37 ° C. El día de la disección se refiere como día 0. </li><li> Hombreipulation de los cultivos de explantes pancreáticos se lleva a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. El medio de cultivo BME se cambió cada dos días, a menos que los requisitos experimentales dictar diferentes momentos (por ejemplo, la incubación de los explantes con agentes químicos). Los explantes pueden cultivarse en esta condición durante 5 días hasta una semana. </li></ol> 4. Todo el montaje Protocolo de tinción de inmunofluorescencia para explantes de páncreas Todas las etapas del protocolo de inmunofluorescencia (de fijación para formación de imágenes) se llevan a cabo en el mismo plato MatTek, que conduce a mejores imágenes de una placa de plástico de fondo. Después de la fijación, los cultivos de explantes pancreáticos no necesitan mantenerse en condiciones estériles. <ol><li> Aspirar el medio BME cultura y lavar el explante de una vez con 2 ml de PBS 1X. </li><li> Para la fijación explante sustituir PBS con 2 ml de helado de paraformaldehído al 4% (PFA) y colocar la cápsula en hielo durante 20 min. Agitar la placa suavemente de vez entiempo, pero evita las plataformas oscilantes, ya que el explante puede separar. </li><li> Eliminar PFA y lavar los explantes tres veces con 2 ml de 1X PBS durante 10 min cada uno a temperatura ambiente (RT). </li><li> Bloquear con 2 ml de solución de bloqueo (1X PBS + 0,1% de Triton-X + 3% burro suero) durante al menos 30 min a TA. </li><li> Diluir el anticuerpo primario en la solución de bloqueo y añadir 150 ~ l de la dilución directamente en la microplaca de 20-mm de las placas de MatTek que cubre la superficie entera de explante para la incubación durante la noche a 4 ° C. Para reducir al mínimo los movimientos físicos, añadir el anticuerpo primario a los explantes directamente en la habitación fría (4 ° C). Para evitar la evaporación, antes de añadir el anticuerpo, colocar las placas Mattek en una cámara húmeda. </li><li> El día siguiente se retira la solución de anticuerpo y lavar tres veces con 2 ml de PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) durante 30 minutos cada uno a TA. </li><li> Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo [de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; usamos burro Alexa Fluor tintes secundaria contracuerpos en dilución 1:750] y añadir 150 ~ l de la dilución directamente en la microplaca de 20-mm de las placas de MatTek, que cubre la superficie entera de explante, por 1-2 horas de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad. Para la contratinción nuclear, incluyen Hoechst junto con dilución de anticuerpo secundario. Para evitar la evaporación, antes de añadir el anticuerpo, colocar las placas Mattek en una cámara húmeda. </li><li> Lavar tres veces con 2 ml de PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) durante 30 minutos cada uno a TA. </li><li> Antes del montaje, lavar una vez con 1X PBS para eliminar el Tween-20. Montar al añadir una gota de medio de montaje acuoso (con anti-fading) en el micropocillo 20-mm de las placas de MatTek. Suavemente, cubra el explante con un cubreobjetos de vidrio. Evitar burbujas de aire. </li><li> Los explantes en las placas de MatTek puede ser visto bajo microscopía de contraste de fase estándar o microscopia confocal, dependiendo de los objetivos del experimento. Para el análisis por microscopía confocal se utiliza un Zeiss LSM 700 ajuste invertido. Configure los láseres apropiados para fluoróforos nosotrosed. Seleccionar un objetivo que será la imagen de la zona deseada del explante de páncreas. A 10 veces de agua objetivo de inmersión es adecuado para mantener el explante entero en el campo de visión. A 40x agua o en aceite de inmersión son adecuados para concentrarse en regiones específicas del explante de páncreas con una mayor resolución. Los explantes pueden ser ópticamente seccionado y luego adquirió el Z-pilas reconstruidos en 3D, usando el software apropiado. </li></ol> 5. En vivo imágenes de células Protocolo de explantes de páncreas <ol><li> Configuración de la cámara del medio ambiente: utilizar un recinto ambiental y una pequeña cámara de incubación [con la temperatura y CO 2 control] que se encuentra en la platina del microscopio. Cultivo adecuado del páncreas embrionario requiere una temperatura estable de 37 ° C y una atmósfera controlada de CO 2 humidificado 5%. Cámaras adecuados están disponibles de varios proveedores (Por ejemplo, Zeiss, Nikon, Olympus). Montar la caja del calentador y convertirlo en unl menos 1 hora antes de la formación de imágenes se inicia para permitir que el equipo se caliente y equilibrar contenido de CO 2 al 5%. </li><li> Para imágenes de lapso de tiempo de cultivos de explantes de páncreas, se utiliza un Zeiss LSM 700 microscopio invertido. Para los láseres y la selección objetiva véase el punto 4.10. </li><li> Deje que el páncreas explante un buen agarre al plato con fondo de vidrio antes de iniciar la formación de imágenes en directo. [Por lo general, realizar imágenes en directo a partir del día 1]. En una campana de flujo laminar, aspirar y sustituir el medio con medio fresco explante cultura BME a comenzar con las condiciones óptimas de nutrientes. </li><li> Suavemente transferir los explantes a la sala de microscopio y colocar el plato MatTek en la cámara de incubación en el portamuestras del microscopio confocal. </li><li> Preparar el objetivo (por ejemplo, añadir aceite o agua a medio de acuerdo con la elección del objetivo de inmersión) y se centran en la región de interés en el explante. Cierre la cámara ambiental adecuada. Para evitar la evaporación durante el tiempo de lapsoadquisición con los objetivos de inmersión en agua, en lugar de agua, se recomienda utilizar los fluidos viscosos de inmersión que están disponibles comercialmente (por ejemplo, Zeiss Immersol W). </li><li> Configure la intensidad del láser, Z-stack parámetros de adquisición y el intervalo de tiempo (véase también la discusión de resolución de problemas). Iniciar el experimento. </li><li> Después de obtención de imágenes, exportación Z pilas y todos los momentos y analizarlos con el software apropiado (por ejemplo ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens). </li></ol> 6. Los resultados representativos Papilas dorsales pancreáticas (junto con el mesénquima circundante) se diseccionaron de embriones de ratón de entre E11.5 y E12.5 y se sembraron directamente en placas de cultivo con fondo de vidrio (figura 1). Los vasos sanguíneos están presentes en el mesénquima que rodea el epitelio y pueden ser visualizadas mediante inmunotinción para el marcador endotelial PECAM 12 (datos no mostrados). Después de dos días de cultivo, los explantes de páncreas underwent crecimiento significativo y empezó a organizarse en estructuras ramificadas epiteliales, cuyos núcleos fueron positivos para el factor de transcripción pancreático, Pdx1 (Figura 2A-C). El promedio z de grosor de explantes pancreáticos en el día 3 de cultivo es 60-80 micras. La superficie y el volumen de los explantes se puede medir utilizando softwares apropiados (por ejemplo, Huygens). Morfología y análisis de inmunofluorescencia mostró que los explantes pancreáticos cultivaron usando este protocolo se recapitula en la diferenciación in vivo pancreático temprano y eventos morfogenéticos 5,10,11,14 (Figura 2). Explantes de páncreas el día 4 de cultivo se sometió típico &quot;punta y el tronco&quot; segregación del epitelio 8, mostrando CPA1 + células progenitoras en las puntas de las ramas epiteliales (Figura 2 C) y + insulina diferenciadas y las células de glucagón + organizados como grupos en el interior del tronco (Figura 2D ). Además, la pancreatitisc epitelio en los cultivos ex vivo mostraron la organización del citoesqueleto y la polaridad celular, con la localización apical de F-actina (2E Figura, en verde) y b1 integrina en las membranas basales (2E figura, en rojo). Para estudiar pancreático ramificación en tiempo real, los explantes de embriones pancreáticos se aislaron a partir de la cepa de doble color fluorescente reportero ratón membrane-Tomato/membrane-Green 15 (mT / mg; cepa de ratón está disponible en el Laboratorio Jackson) (Figura 3). Aún cuadros de un vídeo de lapso de tiempo de explantes pancreáticos mT / mg crecidas en cultivo se muestra en la Figura 3. La localización de la proteína fluorescente mT a estructuras de membrana describe la morfología celular y permite la resolución de finos procesos celulares, lo que permite realizar un seguimiento de remodelación celular y la migración con el tiempo. Después de un 12-hora de lapso de tiempo experimento la señal de fluorescencia mT sigue siendo viable y deteCTable, aunque su intensidad se reduce, muy probablemente debido a fotodaño (Figura 3). Soluciones técnicas para evitar o reducir el daño solar y fototoxicidad se discuten en la sección de debate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" /> Figura 1. Representación esquemática de la disección páncreas brote dorsal de embrión de ratón E12.5. (A) Imagen de campo claro embrión de ratón E12.5. La parte superior del cuerpo del embrión (por encima del hígado) y la región de la cola se eliminan para aislar la parte media del cuerpo (B). Las incisiones se muestra por líneas rojas punteadas. (C) Resultados de la disección adicionales en la exposición del estómago y del duodeno región (indicada por la casilla punteada). El brote pancreático dorsal (véase el círculo punteado rojo) está en la base del estómago y al lado del primordio bazo. El brote pancreático dorsal disecados (D) se transfiere con una pipeta Pasteur en el pocillo de una placa inferior de vidrio que contiene medio de cultivo BME (E, F). Abreviaturas: STO (estómago), sp (bazo), dp (brote pancreático dorsal), dúo (duodeno). Barras de escala, 1000 m (A, C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" /> Figura 2. Todo el montaje análisis de inmunofluorescencia confocal de cultivos de explantes de páncreas. (A) campo luminoso imágenes de explantes de páncreas el día 1 y el día 2 de cultivo ex vivo. Línea roja punteada indica el inicio de la ramificación del epitelio. (B) la reconstrucción en 3D de todo el montaje inmunoticción para Pdx1 en la cultura de páncreas día 3. Explantes de páncreas mostró túbulos de Pdx1 + células se someten a extensas ramificaciones por 48 horas de las culturas. (C) Todo el montaje inmunotinción de explante de páncreas 3 días con anticuerpos contra el marcador de membrana basolateral E-cadherina (ECAD), marcador progenitor punta, carboxipeptidasa 1 (CPA1) y fosfo-histona H3 (phh3). La mayor parte de la mitosis activa phh3 + células colocalize en las puntas periféricas con CPA1 + células. L puntosines indicar la punta de las ramas. (D) Todo el montaje inmunotinción para marcadores de linaje endocrinas, insulina (Ins) y glucagón (Gluca) en el día 3. Las flechas amarillas indican las agrupaciones de Ins + y células Gluca +. Inserción (D &#39;), de mayor magnificación de una de la agrupación de células endocrinas. (E) Todo el montaje inmunoticción de explantes de páncreas día 3 de Pdx1, β1 integrina (β1int) y F-actina (Hecho). Las células mesenquimales (asteriscos) intercalados entre Pdx1-positivas las células epiteliales. Las imágenes mostradas en C, D y E son simples secciones confocales ópticas de la serie Z. Barras de escala, 100 micras (A, B); 50 micras (CE). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" /> Figura 3. Representante en directo imágenes de células de páncreas explante ex vivo culta. (AD), imágenes de un vídeo time-lapse de un explante de páncreas de un embrión mT / mG ratón transgénico. Tiempo de formación de imágenes se muestra en horas: minutos. El explante se formó una imagen a partir de día 1. Z-Stack imágenesse adquirieron con un objetivo de inmersión en aceite 40X cada 12 minutos por un total de 15 h. Las líneas discontinuas indican la punta de las ramas y las fronteras entre el epitelio y el mesénquima. Barra de escala, a 50 m.

<ol>
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No hay conflictos de interés declarado.

Una vez que el destino de páncreas se especifica, las células progenitoras de páncreas experimentan una proliferación extensa, la diferenciación y la morfogénesis para formar finalmente un órgano funcional madura y 2,4. En la actualidad, la forma de ramificación tiene lugar en el páncreas y cómo está conectado a la proliferación y diferenciación de progenitor es en gran parte desconocida. Cultivos de explantes pancreáticos representan un sistema ideal para aclarar estos procesos ex vivo...

<table border="1"><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Anticuerpos: La carboxipeptidasa E-cadherina F-actina El glucagón Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfato histona H3 </td><td> AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Banco hibridoma Señalización Celular </td><td> 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 </td><td></td></tr><tr><td> Basal Medium Eagle (BME) </td><td> Sigma </td><td> B1522-500ML </td><td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> Cultivo de células agua de calidad </td><td> PAA </td><td> S15-012 </td&gt; <td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> Las placas de cultivo (con fondo de cristal), de 35 mm </td><td> MatTek Corporación </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr><tr><td> Burro Suero </td><td> Chemicon </td><td> S30-100 ml </td><td></td></tr><tr><td> Suero de ternero fetal Oro </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> La fibronectina </td><td> Invitrogen </td><td> 330100-8 </td><td> Stock sol. 1 mg / ml en agua de grado de cultivo celular </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15750-037 </td><td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> Glutamina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-024 </td><td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> 4-así multiplacas </td><td> Nunc </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopios: Microscopio Confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscopio (Discovery V12) </td><td> Zeiss Zeiss </td><td></td><td> Objetivos: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (trabajo. dist 1,8 mm;. Profundidad de imagen ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Corr. M27 (trabajo. dist 0,28 mm;. ~ Profundidad de imagen 50 micras) La transiluminación de abajo y la iluminación de fibra óptica desde arriba </td></tr><tr><td> Paraformaldehído </td><td> Roth </td><td> 0335.3 </td><td> De la solución al 20% </td></tr><tr><td> Pasteur Pipeta (Glass), 150 mm </td><td> VWR </td><td> HECH567 / 1 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td> Se mantuvo en estéril condiciones </td></tr><tr><td> Placas de Petri de 60 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 628102 </td><td></td></tr><tr><td> Placas de Petri, 35 mm </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 627161 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS, pH 7,4 </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Se mantuvo en condiciones estériles </td></tr><tr><td> Spring Tijeras 8 mm cuchilla curvada </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15023-10 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td> Roth </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> Relojería foreceps Dumont # 5 </td><td> Roth </td><td> K342.1 </td><td></td></tr></table>

a system for ex vivo culturing of embryonic pancreas

El páncreas controla las funciones vitales de nuestro cuerpo, incluyendo la producción de enzimas digestivas y la regulación de los niveles de azúcar en la sangre 1. Aunque en la última década, muchos estudios han contribuido a una base sólida para la comprensión de la organogénesis pancreática, persisten importantes lagunas en nuestro conocimiento de la formación de páncreas temprano 2. Una comprensión completa de estos eventos tempranos proporcionará información sobre el desarrollo de este órgano, sino también en enfermedades incurables que se dirigen el páncreas, tales como la diabetes o el cáncer de páncreas. Finalmente, esta información se generará un modelo para el desarrollo de terapias de reemplazo de células en el contexto de la diabetes. Durante la embriogénesis, el páncreas se origina en distintas derivaciones embrionarias endodermo del intestino anterior dorsal y ventral en el día embrionario (E) 9,5 en el embrión de ratón 3,4. Ambos crecimientos evaginar en el mesénquima circundante como sólido epiteliosyemas L, que se someten a la proliferación, diferenciación y de ramificación para generar un órgano completamente maduro 2,5,6. Evidencias recientes han sugerido que el crecimiento y la diferenciación de los linajes de células pancreáticas, incluyendo los que producen insulina-β-células, depende adecuada de tejido arquitectura, remodelación epitelial y posicionamiento de células en el epitelio pancreático ramificación 7,8. Sin embargo, como la morfogénesis de ramificación se produce y se coordina con la proliferación y diferenciación en el páncreas es en gran parte desconocida. Esto es en parte debido al hecho de que el conocimiento actual sobre estos procesos de desarrollo se ha basado casi exclusivamente en el análisis de muestras fijadas, mientras que los eventos morfogenéticos son muy dinámicas. Aquí, se presenta un método para la disección y el ratón cultivo de brotes de páncreas embrionario ex vivo en los platos inferiores de cristal, que permiten la visualización directa del desarrollo del páncreas (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente diseñado para la microscopía confocal de barrido láser y, en particular, de células vivas de imágenes. Explantes pancreáticos se pueden preparar no sólo a partir de embriones de ratón de tipo salvaje, sino también a partir de cepas de ratones genéticamente modificados (transgénicos o knockout por ejemplo), lo que permite estudios en tiempo real de fenotipos mutantes. Además, este sistema de cultivo ex vivo es valiosa para estudiar los efectos de los compuestos químicos en el desarrollo de páncreas, lo que permite obtener datos cuantitativos sobre la proliferación y el crecimiento, la elongación, la ramificación, tubulogénesis y diferenciación. En conclusión, el desarrollo de un método in vivo de páncreas ex explante cultura combinada con imágenes de alta resolución proporciona una sólida plataforma para la observación de los eventos morfogenéticos y la diferenciación que se producen en el embrión de ratón en desarrollo.

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A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un excelente<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema para el estudio de diversos aspectos del desarrollo pancreático, incluyendo la morfogénesis, la diferenciación y el crecimiento. Explantes pancreáticos brote pueden cultivarse durante varios días y se utiliza en una serie de aplicaciones diferentes, incluyendo todo el montaje de inmunofluorescencia y de imágenes en directo.

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

13.6K vistas.  Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un excelente Ex vivo Sistema para el estudio de diversos aspectos del desarrollo pancreático, incluyendo la morfogénesis, la diferenciación y el crecimiento. Explantes pancreáticos brote pueden cultivarse durante varios días y se utiliza en una serie de aplicaciones diferentes, incluyendo todo el montaje de inmunofluorescencia y...

Video: A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Método para la Cultura de primeros embriones del polluelo ex vivo (Nueva Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Investigación

Biología

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for discovering new therapeutic strategies. Advancements in imaging technology have enabled quantitative investigation of the organization and maturing of the body plan, but later stage embryonic morphogenesis is less clear. Chicken embryos are an attractive vertebrate animal model system for this application because of its ease of culture and surgical manipulation. Early embryos can be cultured for a short time on filter paper rings, which enables complete optical access for cell patterning and fate studies1,2. Studying advanced developmental processes such as cardiac morphogenesis are traditionally performed through a window of the eggshell3-5, but this technique limits optical access due to window size. We previously developed a simple method to culture whole embryos ex-ovo on hexagonal weigh boats for up to 10 days, which enabled high resolution imaging via ultrasonography6,7. These cultures were difficult to transport, limiting the types of imaging tools available for live experiments. We here present an improved shell-less culture system with a cost-effective, portable environmental chamber. Eggs were cracked onto a hammock created by a polyurethane membrane (cling wrap) affixed circumferentially to a plastic cup partially filled with sterile water. The dimensions of the circumference and depth of the hammock were both critical to maintain surface tension, while the mechanics of the hammock and water beneath helped dampen vibrations induced by transportation. A small footprint circulating water bath was also developed to enable continuous temperature control during experimentation. We demonstrate the ability to culture embryos in this way for at least 14 days without morphogenic defect or delay and employ this system in several microsurgical and imaging applications.

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

In this article, we present a simple methodology to enable long-term ex-ovo avian embryo culture. This technique is ideal for longitudinal experimentation requiring complete optical accessibility and/or sterile transportation in avian embryos.

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

Un sistema para el cultivo de células epiteliales del pigmento del iris para el Estudio de Regeneración del objetivo de Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not regenerate very efficiently in vivo; and as a result, osteoarthritis leads to irreversible cartilage loss and is accompanied by chronic pain and immobility 1,2. Cartilage tissue engineering offers promising potential to regenerate and restore tissue function. This technology typically involves seeding chondrocytes into natural or synthetic scaffolds and culturing the resulting 3D construct in a balanced medium over a period of time with a goal of engineering a biochemically and biomechanically mature tissue that can be transplanted into a defect site in vivo 3-6. Achieving an optimal condition for chondrocyte growth and matrix deposition is essential for the success of cartilage tissue engineering. 
 In the native joint cavity, cartilage at the articular surface of the bone is bathed in synovial fluid. This clear and viscous fluid provides nutrients to the avascular articular cartilage and contains growth factors, cytokines and enzymes that are important for chondrocyte metabolism 7,8. Furthermore, synovial fluid facilitates low-friction movement between cartilaginous surfaces mainly through secreting two key components, hyaluronan and lubricin 9 10. In contrast, tissue engineered cartilage is most often cultured in artificial media. While these media are likely able to provide more defined conditions for studying chondrocyte metabolism, synovial fluid most accurately reflects the natural environment of which articular chondrocytes reside in.
 Indeed, synovial fluid has the advantage of being easy to obtain and store, and can often be regularly replenished by the body. Several groups have supplemented the culture medium with synovial fluid in growing human, bovine, rabbit and dog chondrocytes, but mostly used only low levels of synovial fluid (below 20&#37;) 11-25. While chicken, horse and human chondrocytes have been cultured in the medium with higher percentage of synovial fluid, these culture systems were two-dimensional 26-28. Here we present our method of culturing human articular chondrocytes in a 3D system with a high percentage of synovial fluid (up to 100&#37;) over a period of 21 days. In doing so, we overcame a major hurdle presented by the high viscosity of the synovial fluid. This system provides the possibility of studying human chondrocytes in synovial fluid in a 3D setting, which can be further combined with two other important factors (oxygen tension and mechanical loading) 29,30 that constitute the natural environment for cartilage to mimic the natural milieu for cartilage growth. Furthermore, This system may also be used for assaying synovial fluid activity on chondrocytes and provide a platform for developing cartilage regeneration technologies and therapeutic options for arthritis.

A 3D system of culturing human articular chondrocytes in high levels of synovial fluid is described. Synovial fluid reflects the most natural microenvironment for articular cartilage, and can be easily obtained and stored. This system thus can be used for studying cartilage regeneration and for screening therapeutics for treating arthritis.

Un sistema 3D para los condrocitos articulares humanos cultivo de líquido sinovial

Cartilage destruction is a central pathological feature of osteoarthritis, a leading cause of disability in the US. Cartilage in the adult does not ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Preparación de las células embrionarias de fibroblastos de ratón adecuados para el cultivo de células estaminales embrionarias humanas pluripotentes inducidas, y

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

A Novel<em&gt; Ex vivo</em&gt; Método de la cultura para el corazón de embriones de ratón

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Un método para cultivar embrionarias<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Cultura de embriones de ratón con la piel y en vivo de imágenes de melanoblasto Migración

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema de Cultura para estudiar el desarrollo de la tiroides

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...