Este protocolo se puede utilizar para formular nanopartículas lipídicas consistentes que encapsulan MRA. Los parámetros de formulación se pueden ajustar y las diversas nanopartículas lipídicas se pueden evaluar en cuanto a su potencia y biodistribución. Se puede utilizar un protocolo estandarizado para la formulación de nanopartículas lipídicas y pruebas in vitro e in vivo para formular nanopartículas lipídicas consistentes que puedan compararse entre sí.
Hay muchos pequeños detalles a tener en cuenta a la hora de formular y evaluar la potencia de las nanopartículas, pero ¿qué detalles se tienen en cuenta? La preparación de la formulación no debería ser difícil. Comience llenando un vaso limpio de cuatro litros con 200 a 300 mililitros de PBS fresco 10X y diluyéndolo a 1X con agua ultrapura.
Asegúrese de que el volumen final de PBS esté entre dos y tres litros. Coloque casetes de diálisis de la capacidad adecuada para la nanopartícula lipídica, o formulación de LNP, en el vaso de precipitados de campo. Realice la dilución diez veces mayor de un tampón de ácido cítrico de 100 milimolares utilizando agua ultrapura para crear un tampón de ácido cítrico de 10 milimolares para la dilución de ARNm.
A continuación, haga C 12 200 lipídico ionizable, lípidos auxiliares, colesterol y soluciones madre de PEG ancladas a lípidos o PEG lipídicos disolviendo cada lípido en etanol al 100%. Asegúrese de que las soluciones madre se disuelvan por completo calentándolas y mezclándolas a 37 grados centígrados. Combinar los volúmenes calculados de los diferentes componentes lipídicos en un tubo cónico.
Diluir los lípidos con etanol al 100% hasta el volumen final de V, que representa el 25% del volumen final de LNP. Calcule la cantidad de ARNm necesaria para la formulación en función de la relación entre el peso de los lípidos ionizables y el ARNm y el volumen total de ARNm-LNP. A continuación, descongele la luciferasa de luciérnaga que codifica el ARNm en hielo.
A continuación, diluya el ARNm hasta un volumen final tres veces superior al de la fase orgánica utilizando el tampón de ácido cítrico de 10 milimolares. Rocíe una toallita delicada con un descontaminante de superficie para ARN y ADN, y limpie a fondo el interior del instrumento microfluídico. A continuación, abra un nuevo cartucho microfluídico e insértelo con los canales de entrada hacia abajo y hacia afuera.
Coloque dos tubos cónicos estériles de 15 mililitros en el soporte sin tapas. Una vez hecho esto, llene una jeringa de cinco mililitros con la solución de ARNm que contiene ARNm diluido en tampón de ácido cítrico de 10 milimolares. A continuación, llene una jeringa de tres mililitros con la solución lipídica que contiene los lípidos diluidos en etanol al 100%.
Asegúrese de eliminar el aire de las jeringas. Luego, sin la aguja, inserte la jeringa de cinco mililitros que contiene la solución de ARNm en la entrada izquierda del cartucho e inserte la jeringa de tres mililitros que contiene la solución lipídica en la entrada derecha del cartucho. Encienda el instrumento microfluídico y seleccione ejecución rápida.
Después de seleccionar los tipos de jeringa correctos para las jeringas de cinco y tres mililitros insertadas, ingrese los parámetros para la formulación de LNP en una relación de flujo acuoso a orgánico de tres a uno, antes de presionar el botón de inicio para formular los ARNm-LNP. Cargue los ARNm-LNP recogidos en el tubo cónico derecho en los casetes de diálisis previamente hidratados con una jeringa sin perforar ni tocar la membrana del casete, vuelva a colocar los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP en el vaso de precipitados que contiene PBS y déjelos dializar durante al menos dos horas. Después de la diálisis, lleve los casetes de diálisis que contienen los ARNm-LNP a un gabinete de bioseguridad estéril y extraiga los ARNm-LNP con una jeringa con una aguja.
Filtrar los ARNm-LNP con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y recogerlos en un tubo cónico estéril. A continuación, coloque 65 microlitros de la solución de ARNm-LNP en un microtubo de 1,5 mililitros para su caracterización. Coloque 5.000 células HepG2 en una placa de pared blanca, fondo transparente, 96 pocillos en 100 microlitros de medio de cultivo celular completo e incube las células durante la noche en una incubadora controlada a 37 grados centígrados que contenga un 5% de dióxido de carbono.
Antes del tratamiento de las células con ARNm-LNP, retire el medio completo de los pocillos. A continuación, trate las células con 100 microlitros de ARNm-LNP diluidos en un medio de cultivo celular completo a las dosis deseadas, o 100 microlitros de medio completo antes de una incubación de 24 horas. Después de la incubación, retire el medio de cultivo celular de la placa de 96 pocillos, agregue 20 microlitros de tampón de lisis a cada pocillo seguido de 100 microlitros de los reactivos del ensayo de luciferasa.
Proteja la placa de la luz y colóquela en un lector de placas para medir la señal bioluminiscente. Diluir la solución de ARNm-LNP utilizando PBS estéril de modo que haya dos microgramos de ARNm total en 100 microlitros del volumen de inyección de la vena de cola. Llene una jeringa de insulina de calibre 29 con 100 microlitros de ARNm-LNP o 100 microlitros de PBS y elimine las burbujas de la jeringa.
Inserte la aguja con el bisel hacia arriba en la vena lateral de la cola del ratón e inyecte lentamente los 100 microlitros de ARNm-LNP o PBS. Seis horas después de la inyección, prepare una solución madre de 15 miligramos por mililitro de sal potásica D-luciferina en PBS estéril. En el software de adquisición de imágenes para el sistema de adquisición de imágenes in vivo, o IVIS, seleccione la casilla junto a luminiscencia antes de pulsar inicializar para preparar el instrumento para la adquisición de datos.
A continuación, administre 200 microlitros de D-luciferina por vía intraperitoneal a los ratones previamente tratados y espere 10 minutos mientras la señal de luciferasa se estabiliza antes de anestesiar a los ratones. Transfiera a los ratones anestesiados a los conos de la nariz dentro del sistema de imágenes in vivo, asegurándose de que estén boca arriba con el abdomen expuesto, antes de cerrar la puerta de la cámara. En el software de imágenes, asegúrese de seleccionar el campo de visión correcto y establezca el tiempo de exposición en automático, haga clic en el botón adquirir en el software para obtener imágenes de bioluminiscencia.
La eficiencia de encapsulación de los ARNm-LNPs se determinó en un 92,3% utilizando el ensayo de fluorescencia modificado y la ecuación que se muestra aquí. Se observó un aumento de la bioluminiscencia tras el tratamiento de 5.000 células HepG2 con dosis crecientes de ARNm-LNP. La expresión de luciferasa se detectó fácilmente con la dosis más baja de este estudio de cinco nanogramos por pocillo.
Se observó una fuerte señal de bioluminiscencia en la parte superior del abdomen de los ratones tratados con LNP formulados. Se dibujaron regiones de interés alrededor de las señales hepáticas para calcular el flujo luminiscente total. El flujo luminiscente total fue de aproximadamente cinco veces 10 a la 9ª.
Mantenga siempre la relación entre el peso de los lípidos ionizables y los ácidos nucleicos al formular LNP. Cada volumen de la fase orgánica debe contener lípidos ionizables correspondientes al ARNm en tres volúmenes de la fase acuosa.
