Los autores desean reconocer el Dr. Isaac Zambrano y el personal en el Manchester Ojo Hospital de Banco de Ojos para el suministro de tejido ocular donante humano, y el Sr. Pete Walker, de la Facultad de Ciencias de la Vida Histología instalaciones para las imágenes de H &amp; E manchadas. Especial agradecimiento al Sr. Roger Meadows por su ayuda con la microscopía. SJC es un receptor de un Consejo de Investigación Médica (MRC) Carrera Desarrollo de la Confraternidad (MR / K024418 / 1) y los autores también reconocen otra financiación de la investigación reciente del MRC (G0900538 y K004441), Lucha for Sight (1866) y La Sociedad macular.

Tejido del ojo humano dado su consentimiento para fines de investigación se obtuvo de la Manchester Royal Hospital Oftalmológico Banco de Ojos después de la eliminación de la córnea para el trasplante. La utilización de tejidos humanos para la investigación estaba en conformidad con la Ley de Tejidos Humanos (2004) Directrices, y con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la Universidad (Referencia 11305). 1. Enriquecimiento de la membrana de Bruch entero <ol><li> Limpiar el espacio de trabajo alrededor y debajo del microscopio de disección con 1% desinfectante (v / v) y luego limpie con 70% (v / v) de etanol. </li><li> Asegúrese de lo siguiente están a mano: un nuevo bisturí desechable, dos raspadores estériles celulares (comúnmente utilizados en el cultivo de tejidos) y tres pares de pinzas (enumerados aquí como A, B, y C, consulte la lista de materiales). </li><li> Coloque el globo ocular en una placa petri desechable, reteniendo la tapa para su uso posterior. Usando una nueva bisturí desechable, eliminar cualquier nervio óptico residual, lo que puede interferir con la creación de un mo planaunt del tejido. A continuación, hacer cuatro incisiones igualmente espaciados para crear cuatro cuadrantes, en caso de proceder a la parte 3 (enriquecimiento de la membrana de Bruch macular) no corte a través de la región de la mácula. <ol><li> Asegúrese de que las incisiones se extienden a través de toda la profundidad del tejido ocular - a partir de la retina neurosensorial más interna (NSR), a través de la coroides y la esclerótica (blanco del ojo). Continuar la incisión todo el camino alrededor del ojo desde el margen de la ojera al nervio óptico. Esto permitirá que el ocular que se aplana (ver Figura 1B). </li></ol></li><li> La celebración de un cuadrante de ojera aplanada usando pinzas A (para evitar el desprendimiento coroideo), utilice el mayor pinza B para agarrar la NSR vítreo y subyacente y tire de este tejido lejos del epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de la periferia, se mueve hacia el centro de la ojera abierto y luego hacia el lado opuesto. Por lo general, pero no siempre tanto vítreo y despegar todo lo NSR una. Utilice la scalpel para extirpar cualquier NSR residual anclado en el disco óptico. </li><li> Una vez más, mientras que la celebración de un cuadrante de tejido en su lugar usando pinzas A, utilizar el raspador de células estéril para desalojar suavemente la monocapa RPE de toda la superficie interior de la copa ocular. Estas células se desprenden con facilidad y se puede ver grumos de color marrón-pigmentadas oscuras. Enjuague con PBS para lavar suavemente las células RPE distancia desalojados de la ojera. </li><li> A continuación, utilice las pinzas de A a pelar suavemente el tejido de color rojo oscuro que recubre (que comprende tanto la membrana de Bruch y la coroides) a partir de los 4 cuadrantes del ojo. Coloque el tejido extirpado en un plato limpio. </li><li> Con el borde aplanado de un solo rascador de células para mantener el tejido extirpado en su lugar, utilice el segundo raspador para raspar suavemente el tejido. Gire el tejido y repita, eliminando tanto el exceso de material posible. Eventualmente, una membrana traslúcida se mantendrán: esta es la membrana de Bruch crudamente enriquecido. El uso del microscopio de disección en un mínimo de magnificación 20X esesencial en la ayuda a la eliminación de la coroides y el enriquecimiento de la membrana de Bruch. </li><li> Utilizando una pipeta Pasteur, enjuagar brevemente la membrana de Bruch con agua ultrapura para eliminar coroides residual y la sangre antes de colocar la membrana en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Suspender la membrana de Bruch enriquecida en aproximadamente 1 ml de agua ultrapura y agitar brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante (ver Figura 2). Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante. Nota: La membrana de Bruch enriquecido restante ya está listo para la solubilización (como se describe en la sección 2 abajo) o el almacenamiento a -80 ° C para su uso posterior. </li></ol> 2. La solubilización de Análisis de membrana y Western Blot de Whole Enriquecido Bruch <ol><li> Extracto de proteínas de la membrana de Bruch enriquecido por inmersión del tejido en 500 l 8 M urea durante 6 horas a temperatura ambiente en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga (Figura 3A). </li><li> Centrifugar las muestras solubilizadas a 10.000 xg durante 10 min para sedimentar cualquier asunto extracelular restante. Eliminar el sobrenadante y transferirlo a 3500 Da MWCO membrana de diálisis, a continuación, colocar la muestra en 1 l de PBS para dializar durante 16 horas a 4 ° C. </li><li> Para cada muestra, añadir 40 l de perlas de aislamiento de proteínas, y rotar la muestra / mezcla de perlas (20 rpm en un mezclador rotatorio) a TA durante 30 min. </li><li> Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas. Eliminar el sobrenadante y solubilizar proteína unida a las perlas en 30 l 2x tampón de carga de muestra (Tris-HCl 65,8, pH 6,8, 2,1% de SDS, 26,3% (w / v) de glicerol, 0,01% azul de bromofenol, 3% β-mercaptoetanol). </li><li> Incubar las muestras a 100 ° C durante 10 min, y luego centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar las perlas restantes. </li><li> Cargue el sobrenadante que contiene las proteínas liberadas en un prefabricado SDS-gel de gradiente de la página (véase la lista de materiales) para la separación de proteínas. </li><li> Visualizar bandas de proteínas separadas mediante un protocolo de tinción común, por ejemplo, azul de Coomassie. <ol><li> En resumen, añadir 20 ml de la mancha azul brillante (0,1% azul brillante (w / v), 50% de metanol, ácido acético glacial 10%, 40% de agua) al gel, y se incuba durante 30 min a TA con agitación suave . </li><li> Deseche la solución de tinción y lavar el gel teñido con agua desionizada hasta que la tinción de fondo es suficientemente reducida para permitir la visualización banda de proteína de colores. </li><li> Alternativamente, la transferencia separa bandas de proteínas a nitrocelulosa para el análisis Western, como se describe a continuación. </li></ol></li><li> Transferencia separa bandas de proteínas a una membrana de nitrocelulosa a 80 mA durante 2,5 horas usando aparato de transferencia semiseco en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanol). </li><li> Bloquear la membrana en 10 ml de PBS, 10% (w / v) de leche, y 0.02% (w / v) de BSA durante 16 horas a 4 ° C antes de THe adición de los anticuerpos primarios deseados para la detección de proteínas. Nota: Como un ejemplo aquí, la Figura 3C muestra un inmunoblot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de tres donantes distintos probaron para un regulador de la cascada del complemento, el factor de proteína-H como 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Enriquecimiento de la membrana de Bruch Macular <ol><li> Siga los pasos 1,1 a 1,3 como se describió anteriormente. </li><li> Mientras que la NSR es todavía en su lugar, busque la coloración foveal amarillo que representa la región macular central (ver Figura 4). El uso de un 6 mm punzón de biopsia estéril, colóquela encima de la región foveal y firmemente cortar en la mácula. <ol><li> Mantener el punzón de biopsia en su lugar, hacer una incisión separada con un bisturí desde el borde de la copa ocular hasta el borde de la hoja punzón de biopsia, y luego usando pinzas B, pelar lejos el material que rodea los ojos para lograr una biopsia limpia. </li></ol></li><li> Usando pinzas C, retireel disco de 6 mm de tejido del punzón y el lugar en la tapa placa de Petri limpia. Coloque la tapa placa de Petri y el punzón macular bajo el microscopio de disección. </li><li> Extraiga el disco NSR delgada (marque para la tinción foveal amarilla para inferir la precisión de la biopsia). Use un raspador celular estéril para eliminar suavemente las células del EPR. </li><li> Asegure el disco macular a través de la esclerótica utilizando las puntas de las pinzas A, y lentamente retire la coroides y complejo de la membrana de Bruch usando pinzas C. Una vez más, utilice el rascador de células para eliminar coroides no deseado y la materia de sangre de la membrana de Bruch. </li><li> Coloque la membrana de Bruch macular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y suspender en 1 ml de agua ultrapura. Vortex brevemente (aproximadamente 15 segundos) para ayudar a lisar cualquier materia celular contaminante. Centrifugar la muestra a 500 xg durante 30 seg para sedimentar la membrana y aspirar el sobrenadante. Nota: La membrana de Bruch enriquecida aislada de la mácula ahora se puede utilizar para una proteómicoálisis utilizando protocolos de digestión preferidas del usuario. </li></ol>

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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Aquí se describe el enriquecimiento de la membrana de Bruch para su posterior análisis permitiendo que los análisis posteriores, incluyendo el Western Blot 11, espectrometría de masas y las propiedades de difusión de la membrana de Bruch utilizando cámaras Ussing modificada 11,14. Los pasos críticos incluyen a) el raspado a fondo y el lavado de la superficie interna del ojo para eliminar todas las células del EPR b) el raspado repetido y cuidadoso de la coroides subyacente sin causar del Bruch a desintegrarse y c) lavado de la Bruch extirpado de en agua ultrapura para asegurar la lisis de las células residuales. Además, si la membrana de Bruch enriquecido se va a utilizar para el análisis proteómico, la extracción de proteínas por el tratamiento urea es el más eficaz en la descomposición de este tejido elástico en comparación con otros métodos tales como la homogeneización mecánica. Histología de la membrana de Bruch enriquecido indica el ECM del coriocapilar no se elimina. Esto es ser exesperadas como la capa exterior de la membrana de Bruch la pentilaminar está formado por coriocapilares membranas basales de células endoteliales. De hecho, puede ser ventajoso que el ECM del coriocapilar permanece cuando se producen cambios en este en AMD incluido el depósito de complemento terminal complejo complejo de ataque / membrana (MAC) 15. Cabe señalar que para el análisis histológico detallado de la membrana de Bruch, su estructura se conserva mejor si seccionada en presencia de la esclerótica, la coroides, y la membrana de Bruch. De hecho, la histología presentado en la Figura 2 está destinado exclusivamente para demostrar el grado de enriquecimiento resultante de la técnica descrita en este manuscrito. El enriquecimiento de macular Bruch de requiere una cuidadosa disección de la ojera, asegurando que la NSR y en particular la fóvea no están dañados; de otro modo la identificación y por lo tanto el aislamiento de la mácula no son posibles. La integridad de la tissuE también es importante en este proceso y por lo tanto se recomienda el uso de muestras en 48 horas el tiempo post-mortem. El grado de enriquecimiento requerido varía entre los donantes y puede verse afectada por la edad del donante, el tiempo post-mortem, y la presencia de cualquier patología ocular. El uso del término enriquecido es deliberada en el reconocimiento de una limitación de la técnica, esto siendo que &quot;purificación&quot; o &quot;aislamiento&quot; de la membrana de Bruch con este método, simplemente no es posible. De hecho, dado que el ECM del coriocapilar se funde en la membrana de Bruch hay separación completa no es factible. La comprensión de los cambios bioquímicos de los tejidos oculares respectivos es esencial para comprender la progresión de la enfermedad ocular. Este enriquecimiento única de la membrana de Bruch facilita esta comprensión; estudios en curso están investigando el proteoma de la mácula enriquecido la membrana de Bruch mediante espectrometría de masas en diferentes etapas de AMDy en muestras procedentes de sujetos con diferentes genotipos para mejorar la comprensión de la patología molecular de AMD. Ya la técnica descrita aquí se ha utilizado para identificar con éxito FHL-1 como regulador del complemento predominante en la membrana 11 y más estudios de Bruch en la membrana de Bruch enriquecido es probable que resulte en más nuevos conocimientos sobre la patología molecular de AMD.

El uso de post mortem del tejido del ojo humano en la investigación oftálmica es un recurso inestimable para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de los ojos. Análisis de los ojos de donantes humanos ha hecho importantes contribuciones a discernir los mecanismos que sustentan la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), que es la principal causa de ceguera en el mundo occidental 1. A nivel mundial, AMD representa aproximadamente el 8,7% de los casos de ceguera y con una población que envejece cada vez más, se prevé que afectará a 196 millones de personas por los resultados de 2020 2. AMD en la pérdida de la visión central y tiene un profundo impacto en la independencia y la calidad de vida del paciente 3. Temprano AMD se caracteriza por la formación de drusas y puede progresar a la atrofia geográfica (a veces conocido como AMD &quot;seca&quot;), o la neovascularización coroidea (también conocida como neovascular o &quot;húmeda&quot; AMD). Mientras anti-VEGF inyecciones pueden estabilizar o mejorar la visión en DMAE neovascular que iNo es curativa, y en la actualidad, no existe un tratamiento para la atrofia geográfica. Aunque se han mostrado ciertas variantes genéticas de modificar AMD riesgo 4-8, se sabe menos acerca de cómo estas variantes afectan a la mácula en un nivel bioquímico. Un sitio importante en la patogénesis de AMD es la membrana de Bruch. Forma drusas dentro de esta estructura y varios estudios han proporcionado pruebas de la activación del complemento en y alrededor de la membrana de Bruch en AMD 9. La membrana de Bruch es una lámina de matriz extracelular que separa las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la coroides, y es de aproximadamente 4 m de espesor. La membrana de Bruch se funde en los coriocapilar, una capa de la coroides que contiene capilares fenestrados y externa a esto son capas que contienen vasos sanguíneos más grandes 10 (Figura 1A). La membrana de Bruch es una hoja de pentilaminar adicionalmatriz celular (ECM), y esta metodología se detalla cómo aislar la membrana de Bruch, junto con el ECM de los coriocapilar subyacentes (en adelante enriquecido la membrana de Bruch), que es en gran parte descelularizado y libre de células rojas de la sangre. A continuación, la membrana de Bruch enriquecido se utilizó para la transferencia y la histología experimentos occidentales. Además, la metodología para enriquecer la membrana de Bruch únicamente a partir de la región mácula del ojo se describe, que será de particular interés para los que investigan los aspectos bioquímicos de la AMD.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Degeneración macular (AMD) relacionada con la edad es la principal causa de discapacidad visual en el mundo desarrollado. La enfermedad se manifiesta por la destrucción del centro de la retina, llamada mácula, dando como resultado la pérdida de la visión central. Temprano AMD se caracteriza por la presencia de lesiones pequeñas, amarillentas llamados drusas blandas que pueden progresar hacia finales de AMD como atrofia geográfica (AMD seca) o neovascularización (DMAE húmeda). Aunque los cambios clínicos están bien descritos, y la comprensión de las influencias genéticas en conferir riesgo de AMD son cada vez más detallada, una zona que carece de un gran avance es la comprensión de las consecuencias bioquímicas de riesgo genético. Esto es debido en parte a las dificultades en la comprensión de la bioquímica de la membrana de Bruch, una matriz extracelular muy delgada que actúa como un filtro biológico de material desde el suministro de sangre y un andamio en el que reside el epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células. Las drusas fORM dentro de la membrana de Bruch y su presencia altera el flujo de nutrientes a las células del EPR. Sólo mediante la investigación de la composición de proteínas de la membrana de Bruch, y de hecho cómo otras proteínas interactúan con él, pueden investigadores esperan para desentrañar los mecanismos bioquímicos que sustentan la formación de drusas, el desarrollo de la AMD y la pérdida de visión posterior. Este documento detalla metodologías para enriquecer ya sea membrana de Bruch entera, o simplemente de la región mácula, de modo que se puede utilizar para el análisis bioquímico aguas abajo, y proporcionan ejemplos de cómo esto ya está cambiando la comprensión de la bioquímica membrana de Bruch.

El protocolo descrito anteriormente para producir resultados enriquece la membrana de Bruch en el aislamiento de la membrana de Bruch, el ECM del coriocapilar y elimina la mayor parte de las células / residuos celulares, incluyendo la totalidad de la RPE (Figura 2). El lavado de membrana, el enriquecido de Bruch en el agua es un paso clave en la lisis de las células de la coroides restantes. La presión ejercida durante el desguace de la coroides aparece para compactar algunos de los pocos núcleos de las células restantes en la región definida como la membrana de Bruch (Figura 2B). La solubilización de la membrana de Bruch enriquecido permite el análisis aguas abajo de su contenido de proteínas. La separación de bandas de proteína solubilizada enriquecido de la membrana de Bruch usando un 4 - gel de gradiente de SDS-PAGE 12%, mientras que no es útil en su propio derecho para identificar el contenido de proteína, hace demostrar la capacidad de esta técnica para reducir al mínimo las proteínas sanguíneas contaminantes que la ARcorreo no específicamente unido (Figura 3B). En este sentido, una ausencia notable de la carrera de gel de proteína es una banda considerable de albúmina de suero humano (~ 66 kDa) que de otro modo pueden hacer posteriores Western Blot más difíciles de interpretar: el análisis histológico de membrana enriquecida de Bruch muestra en la Figura 2 también soporta esta. De hecho, como parte del trabajo se ha descrito previamente 11, la membrana de Bruch solubilizado a partir de una serie de donantes individuales se probaron para un número de proteínas usando anticuerpos específicos a través de Western Blot (Figura 3C). En el caso mostrado aquí, un anticuerpo (denominada OX23) 12 dirigido contra un kDa regulador de la inmunidad innata 155, llamada factor H del complemento (FH) se utilizó, y demostró la presencia de una banda de menor peso molecular en las muestras de la membrana de Bruch entre tres separada donantes (Figura 3C). Esto posteriormente resultó ser factor de la proteína-H como 1 (FHL-1), Una proteína de 49 kDa relacionada con FH y derivado de una variación de empalme del mismo gen 13. FHL-1 parece ser el principal regulador de complemento presente en la membrana de Bruch 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figura 1. Disección del ojo humano y el enriquecimiento de la membrana de Bruch. (A) de la membrana de Bruch es una barrera matriz extracelular. La coroides contiene una capa de capilares fenestrados que se fusionan de forma continua en la membrana de Bruch (llamado el coriocapilar) y estos separar el resto de la coroides (que contiene vasos sanguíneos grandes) a partir del epitelio pigmentario de la retina (RPE) monocapa de células, que fisiológicamente compatible con las células fotorreceptoras de la retina neurosensorial (NSR). (B) Cuatro incisiones en el ocular humanos están hechos lo que le permite ser abierto para crear un montaje plana. losvítreo se puede quitar con el uso de pinzas. La NSR se podría salir junto con el humor vítreo, pero también puede ser eliminado con pinzas. Un rascador de células se utiliza para eliminar la capa de células RPE de la membrana de Bruch, mientras que todavía está anclada a la coroides y la esclerótica. Complejo de membrana / coroides del Bruch se puede despegar de la esclerótica y el uso de un nuevo raspador de células, la coroides exterior se puede quitar. Un lavado final en agua ultrapura lisa cualquier materia celular restante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figura 2. Histología de la membrana de Bruch y las secciones coroideo. H &amp; E manchadas antes (A) y después (B) raspar las estructuras coroides exteriores de la membrana y el lavado de Bruch en wa ultrapurater para generar enriquece la membrana de Bruch. Las barras de escala representan 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figura 3. La solubilización de la membrana de Bruch Enriched para el análisis de proteínas de contenido. (A) Protein puede ser extraído de la membrana de Bruch enriquecido mediante la incubación en urea 8 M durante 6 h a TA, antes de ser dializada contra PBS. Para el análisis Western, las proteínas de todo el dializado de la membrana de Bruch se pueden aislar usando perlas de aislamiento de proteínas y se eluyeron por ebullición con Laemmli tampón de muestra reductor de carga. Azul de Coomassie (B) Un representante gel teñido con SDS-PAGE, mostrando tanto ordenada y se diluyó solubilizaron la membrana de Bruch (BM) usando el método d. escribed en (A) (C) Un western blot representativo de la membrana de Bruch solubilizado a partir de 3 donantes individuales (carriles 1-3). sondeado para el factor de la proteína H como 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figura 4. Aislamiento de la membrana de Bruch Enriched de la mácula. La región mácula de la retina es un área de 5 mm que se puede identificar fácilmente por la coloración amarilla de la fóvea suprayacente, y su proximidad a la papila óptica adyacente. El uso de la fóvea como guía, coloque un punzón de biopsia de 6 mm en el ojo humano montada plana para extirpar un bloque de tejido mácula 6 mm. Retire la NSR suprayacente y raspar células del EPR de la mácula extirpado. Complejo de membrana / coroides del Bruch restante puede eln pelar lejos de la esclerótica y completamente raspado para eliminar coroides, permaneciendo lisis material celular por inmersión en agua ultrapura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Enrichment of Bruch&#039;s Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Enriquecimiento de la membrana de Bruch de Ojos donante humano

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

11.9K vistas.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Aislamiento, enriquecimiento y mantenimiento de las células madre meduloblastoma

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Investigación

Neurociencias

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Análisis cuantitativo de Reposición Synaptic piscina vesículas en cultivos de neuronas granulares del cerebelo con tintes FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Membrane Potential Dye Imaging of Ventromedial Hypothalamus Neurons From Adult Mice to Study Glucose Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with increasing connective tissue and decreased neuronal viability that occur with age. Here, we describe a methodology for the dissociation of healthy hypothalamic neurons from adult-aged mice. The ability to study neurons from adult-aged mice allows the use of disease models that manifest at a later age and might be more developmentally accurate for certain studies. Fluorescence imaging of dissociated neurons can be used to study the activity of a population of neurons, as opposed to using electrophysiology to study a single neuron. This is particularly useful when studying a heterogeneous neuronal population in which the desired neuronal type is rare such as for hypothalamic glucose sensing neurons. We utilized membrane potential dye imaging of adult ventromedial hypothalamic neurons to study their responses to changes in extracellular glucose. Glucose sensing neurons are believed to play a role in central regulation of energy balance. The ability to study glucose sensing in adult rodents is particularly useful since the predominance of diseases related to dysfunctional energy balance (e.g.&#160;obesity) increase with age.

The activity of single neurons from adult-aged mice can be studied by dissociating neurons from specific brain regions and using fluorescent membrane potential dye imaging. By testing responses to changes in glucose, this technique can be used to study the glucose sensitivity of adult ventromedial hypothalamic neurons.

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Studies of neuronal activity are often performed using neurons from rodents less than 2 months of age due to the technical difficulties associated with ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivación-Feeder libres de Células Progenitoras de la cresta neural Pluripotentes Células Madre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivación de las leptomeninges de explantes de culturas postmortem Humanos Los donantes de cerebro

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Aislamiento de los capilares cerebrales del cerebro humano fresco tejido

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular pressure (IOP) which&#160;can identify various pathogenic paradigms related to the glaucoma pathogenesis. Ex vivo human anterior segment perfusion organ culture models have previously been successfully utilized and applied as effective technologies for the discovery of glaucoma pathogenesis and testing of therapeutics. Preclinical drug screening and research performed on ex vivo human organ systems can be more translatable to clinical research. This article describes in detail the generation and operation of a novel ex vivo human translaminar pressure model called the translaminar autonomous system (TAS). The TAS model can independently regulate ICP and IOP using human donor posterior segments. The model allows for studying pathogenesis in a preclinical manner. It can reduce the use of living animals in ophthalmic research. In contrast to in vitro experimental models, optic nerve head (ONH) tissue structure, complexity, and integrity can also be maintained within the ex vivo TAS model.

We describe and detail the use of the translaminar autonomous system. This system utilizes the human posterior segment to independently regulate the pressure inside the segment (intraocular) and surrounding the optic nerve (intracranial) to generate a translaminar pressure gradient that mimics features of glaucomatous optic neuropathy.

Modelo de sistema autónomo translaminar para la modulación de la presión intraocular e intracraneal en segmentos posteriores de donantes humanos

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining homeostasis, and during infection or injury. Several independent research groups have highlighted the central role that microglia play in autoimmune diseases, autoinflammatory syndromes and cancers. The activation of microglia in some neurological diseases may directly participate in pathogenic processes. Primary microglia are a powerful tool to understand the immune responses in the brain, cell-cell interactions and dysregulated microglia phenotypes in disease. Primary microglia mimic in vivo microglial properties better than immortalized microglial cell lines. Human adult microglia exhibit distinct properties as compared to human fetal and rodent microglia. This protocol provides an efficient method for isolation of primary microglia from adult human brain. Studying these microglia can provide critical insights into cell-cell interactions between microglia and other resident cellular populations in the CNS including, oligodendrocytes, neurons and astrocytes. Additionally, microglia from different human brains may be cultured for characterization of unique immune responses for personalized medicine and a myriad of therapeutic applications.

This protocol is an efficient, cost effective and robust method of isolating primary microglia from live, adult, human brain tissue. Isolated primary human microglia can serve as a tool for studying cellular processes in homeostasis and disease.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Imágenes multimodales basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la DMAE

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

Autor destacado: Imágenes multimodales ex vivo basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

Ex Vivo Imágenes multimodales basadas en OCT de ojos de donantes humanos para la investigación de la degeneración macular relacionada con la edad

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...