Name: enrichment of bruch's membrane from human donor eyes
Uploaded: 2015-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
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저자는 박사 이삭 잠브라노와 인간의 기증자의 안구 조직의 공급에 대한 맨체스터 안과 병원 안구 은행의 직원, H &amp; E 염색 이미지 생명 과학 조직학 시설의 학부 씨 피트 워커를 인정하고 싶습니다. 특별 감사는 현미경으로 그의 도움 씨 로저 메도우로 이동합니다. SJC는 의료 연구위원회의 수신자 (MRC) 경력 개발 원정대 (MR / K024418 / 1)이고 저자는 또한, MRC (G0900538 및 K004441)에서 다른 최근의 연구 자금을 인정 시력 (1866)과 황반 사회를위한 싸움.

연구 목적으로 동의 인간의 눈의 조직을 이식 각막의 제거 다음 맨체스터 로얄 안과 병원 안구 은행에서 얻어졌다. 연구를위한 인체 조직의 사용은 인체 조직의 법 (2004) 지침에 따라, 그리고 대학 연​​구 윤리위원회의 승인 (11305 참조). 전체 부르크 막 1. 심화 <ol><li> 주위의 작​​업 공간을 청소하고 1 %의 살균제와 해부 현미경 아래 (v / v),이어서 70 % (v / v)의 에탄올로 닦아. </li><li> 확인 손을은 다음과 같습니다 (A, B 및 C로 여기에 나열된 자료 목록 참조) 하나의 새로운 일회용 메스, (일반적으로 조직 배양에 사용되는) 두 무균 세포 스크레이퍼와 핀셋 세 쌍. </li><li> 나중에 사용하기 위해 뚜껑을 유지, 일회용 페트리 접시에 눈 글로브를 놓습니다. 새로운 일회용 메스를 사용하여, 플랫 MO를 생성을 방해 할 수있는 임의의 잔여 시신경 삭제조직의 UNT. 다음, 확인 네 절개는 동일하게 3 부 (황반 부르크 막 농축)로 진행하는 것은 황반 영역을 통해 절단하지 않는 경우, 네 개의 사분면을 만들 이격. <ol><li> 가장 안쪽의 감각 신경 망막 (NSR)에서, 맥락막과 공막 (눈의 흰색)을 통해 - 절개가 안구 조직의 전체 깊이를 확장 있는지 확인합니다. 절개에게 시신경에 아이 컵의 여백에서 눈 라운드 모든 방법을 계속합니다. 이 아이 컵은 (그림 1B 참조) 평평 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 평면화 세안 컵의 일 사분면을 잡고 중심을 향해 이동 (맥락막 박리를 방지하기 위해) 그립 큰 집게 B에게 유리체 및 하부 NSR을 사용하고 주변부터 멀리 망막 색소 상피 (RPE)에서이 조직을 끌어 열린 아이 컵의 다음 상대 측에. 일반적으로,하지만 항상 유리체와 NSR 모두 하나로 분리하지. scalpe를 사용하여L은 시신경 유두에 고정 잔여 NSR을 절제합니다. </li><li> 다시 말하지만, 집게를 사용 장소에 조직 중 하나 사분면을 들고하는 동안, 부드럽게 아이 컵의 전체 내부 표면에서 망막 색소 상피 단일 층을 제거하기 위해 무균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 이 세포는 쉽게 분리하고 어두운 갈색 색소 덩어리를 볼 수 있습니다. 부드럽게 아이 컵에서 멀리 빠질 망막 색소 상피 세포를 씻어 PBS로 씻어. </li><li> 다음, 가볍게 4 눈 사분면에서 (브루흐의 막과 맥락막 모두 포함) 위에 놓인 어두운 붉은 조직을 벗겨 집게를 사용합니다. 깨끗한 접시에 절제 조직을 놓습니다. </li><li> 하나의 셀 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여, 장소에서 적출 된 조직을 잡고 부드럽게 조직을 긁어 두 번째 스크레이퍼를 사용합니다. 가능한 한 많은 과잉 물질을 제거, 이상 조직을 켜고 반복합니다. 결국, 반투명 막이 남아 :이 조잡 농축 브루흐의 막이다. 20X 배율의 최소 해부 현미경을 사용하는 것이다브루흐의 막 맥락막과 농축의 제거를 돕는 필수적. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 간단하게 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 막 배치하기 전에 잔류 맥락막과 혈액을 제거하기 위해 초순수와 브루흐의 막을 린스. </li><li> 어떤 오염 세포 문제를 용균 수 있도록 약 1 ml의 초순수 및 와류 간단히 (약 15 초)에 농축 부르크 막 일시 중단 (그림 2 참조). 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 참고 : 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 또는 저장 (섹션 2 아래에 설명 된대로) 나머지 풍부한 부르크 막 가용화를위한 준비가되었습니다. </li></ol> 전체 농축 브루흐의 막과 서양 얼룩 분석 2. 가용화 <ol><li> 500 μL 8 M UR의 조직을 침지시켜 풍부한 부르크 막에서 단백질을 추출1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (그림 3A)에 실온에서 6 시간 동안 개. </li><li> 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 용해 된 샘플은 남아있는 세포 외 물질을 펠렛. 상층 액을 제거하고 3,500 다 MWCO 투석 막에 전송 한 후 4 ℃에서 16 시간 동안 dialyse하는 PBS의 1 L에 샘플을 배치합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 단백질 분리 비드 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 샘플 / 비드 혼합 (회전 믹서에서 20 RPM)로 회전한다. </li><li> 5 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플은 구슬을 펠렛. (/ V) 글리세롤 승, 0.01 % 브로 모 페놀 블루, 3 % β-머 캅토 에탄올 (65.8 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 2.1 % SDS 26.3 %)을 30 μL 배 샘플 로딩 버퍼에 구슬에 결합 된 단백질을 상층 액을 제거하고 용해. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 샘플을 인큐베이션하고, 5 분 나머지 비드 펠렛 위해 10,000 XG 원심 분리기. </li><li> 프리 캐스트에에 출시 된 단백질을 포함하는 상층 액을로드 SDS-단백질 분리를위한 페이지 그라데이션 젤 (자료 목록 참조). </li><li> 예를 들어, 일반적인 염색 프로토콜, 쿠마 블루를 사용하여 분리 된 단백질 밴드를 시각화. <ol><li> ((W / V), 50 % 메탄올, 10 % 빙초산, 40 % 물, 0.1 % 브릴리언트 블루) 겔, 및 교반과 함께 RT에서 30 분 동안 간단히, 브릴리언트 블루 염색 20 ㎖를 추가 부화 . </li><li> 염색 액을 버리고 배경 염색 충분히 염색 된 단백질 밴드를 시각화 할 수 있도록 감소 될 때까지, 탈 이온수로 염색 겔 씻는다. </li><li> 아래에 설명 된대로 또는, 전송, 서부 분석을 위해 니트로 셀룰로오스에 단백질 밴드를 분리. </li></ol></li><li> 전송은 전송 버퍼의 반 건조 이송 장치 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 10 % [v / V를 메탄올)를 사용하여 2.5 시간 동안 80mA에서 니트로 셀룰로오스 막에 단백질 밴드를 분리. </li><li> 10 ml의 PBS, 10 %에 막을 차단 일 전에 4 ℃에서 16 시간 동안 우유, 0.02 % (W / V) BSA (/ V W)단백질 검출을위한 소정의 일차 항체 E 첨가. 참고 : 여기에 예를 들어, 그림 3c는 보완 캐스케이드, 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)의 조절에 대한 탐색 할 세 가지 별도의 기증자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 면역을 보여줍니다. </li></ol> 3. 농축 황반 브루흐의 멤브레인의 <ol><li> 전술 한 바와 같이 1.3 - 단계 1.1를 따릅니다. </li><li> NSR 자리에 여전히 동안 중앙 황반 영역 (그림 4 참조) 나타내는 노란색 중심와의 착색을 찾습니다. 멸균 6mm 생검 펀치를 사용하여 중심와 영역 위에 배치 단단히 황반에 잘라. <ol><li> 대신 생검 펀치 유지 깨끗한 생검을 달성하기 위해 주위의 눈 재료를 벗겨, 생검 펀치 블레이드의 가장자리에 아이 컵의 가장자리에서 메스 별도의 절개를 한 후 집게 B를 사용. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 C, 제거깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 펀치와 장소에서 조직의 6mm 디스크. 해부 현미경 페트리 접시의 뚜껑과 황반 펀치를 놓습니다. </li><li> (조직 검사의 정확성을 추론하는 노란색 중심와​​ 염색 검사) 얇은 NSR 디스크를 제거합니다. 부드럽게 망막 색소 상피 세포를 제거하는 살균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 트위터 A의 팁을 사용하여 공막을 통해 황반 디스크를 고정하고 천천히 맥락막과 트위터 다 다시를 사용 부르크 막 복합체를 벗겨, 브루흐의 막에서 원치 않는 맥락막 혈액 물질을 제거하는 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 황반 부르크 막 넣고 1ml의 초순수에 일시. 소용돌이 짧게 (약 15 초) 어떤 오염 세포 문제를 용균 도움이됩니다. 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 주 : 황반 분리 농축 부르크 막 해주기 단백체 위해 사용될 수있다alysis는 사용자가 선호하는 소화 프로토콜을 사용. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 우리는 추가 분석이 서양 블롯 (11), 질량 분석 및 활용 수정 챔버 11,14 Ussing 브루흐의 멤브레인의 확산 특성을 포함한 이후의 분석을 허용하는 브루흐의 멤브레인의 농축에 대해 설명합니다. 중요한 단계는) 눈의 내면의 철저한 긁고 세탁 부르크가 붕괴를 발생시키지 않고 모든 RPE 세포 b) 하부 맥락막의 반복 및 조심 긁어 제거하고, 초순수에서 적출 부르크의 c) 세척 포함 잔여 세포의 용해를 확인합니다. 농축 부르크 막 단백질체 분석에 이용 될 것인지 또한, 우레아 처리하여 단백질을 추출 기계적 균질화 같은 다른 방법에 비하여 탄성이 조직을 분해에 가장 효과적이다. 풍부한 부르크 막의 조직학은 맥락막 모세의 ECM이 제거되지 않음을 나타냅니다. 이 전 할 것입니다pentilaminar 부르크 막의 외층은 예견했던 맥락막 모세 내피 세포의 기저막에 의해 형성된다. 실제로는 변화가 터미널 보완 복잡한 / 막 공격 복합체 (MAC) (15)의 증착을 포함한 AMD이에서 발생하는 맥락막 모세의 ECM이 남아 유리할 수있다. 그것은 공막, 맥락막, 및 부르크 막의 존재 단면 경우 부르크 막 상세한 조직 학적 분석을 위해, 그것의 구조가 잘 보존 될 것이라는 점에 유의해야한다. 실제로,도 2에 제시된 조직학는 전적으로이 원고에 기재된 기술로부터 얻어진 농축의 정도를 설명하기위한 것이다. 황반 부르크의 농축은 NSR 특히 황반이 손상되지 않도록 보장, 아이 컵의주의 절개가 필요합니다; 그렇지 않으면 식별 및 황반의 이렇게 분리가 불가능합니다. tissu의 무결성전자는이 과정에 중요하며 따라서 48 시간 사후 시간에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 농축 정도는 도너 사이에서 변화하고 도너 연령, 사후 시간, 및 안구 병변의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 농축 된 용어의 사용은이 &#39;정제&#39;또는이 방법을 사용 부르크 막 &#39;차단&#39;은 단순히 불가능하다고되고, 기술의 한계를 인정할 의도적이다. 실제로, 맥락막 모세의 ECM은 브루흐의 막으로 병합 주어진 것은이 완전한 분리는 가능하지 않습니다. 각각의 안구 조직의 생화학 적 변화를 이해하는 것은 눈 질병의 진행을 이해하는데 필수적이다. 브루흐의 멤브레인의 독특한 농축이 이해를 용이하게; 진행중인 연구는 AMD의 다른 단계에서 질량 분석법을 이용하여 농축 된 황반 부르크 막 프로테옴을 조사다른 유전자형을 가진 환자에서 발생하는 샘플에서 AMD의 분자 병리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 이미 기술 된 기법을 성공적으로 농축 부르크 막에 부르크 막 (11) 및 추가 연구의 주된 보체 조절 제로 FHL-1을 식별하는 데 사용 된 AMD의 분자 병리에 더 많은 새로운 통찰력을 초래할 가능성이있다.

안과 연구의 사후 부검 인간의 눈 조직의 사용은 안과 질환의 발병 기전의 이해를위한 귀중한 자원이다. 인간의 기증자 눈의 분석은 서구 세계 1 실명의 주요 원인 인 노인성 황반변 성 (AMD)을 뒷받침하는 메커니즘을 분별하는 중요한 기여를했다. 전 세계적으로, AMD는 모든 실명의 약 8.7 %를 차지하고과 점점 고령화와 함께, 그것은 중심 시력의 손실에서 2020 2. AMD 결과에 의해 196,000,000명에 영향을 미칠 것으로 예상되고, 환자의 독립성과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다 3. 초기 AMD 드루 젠이 형성되는 것을 특징으로하며 (또한, 혈관 신생 또는 &quot;습식&quot;AMD 라 함) (때로는 &quot;건식&quot;AMD 라 함) 지리적 위축, 또는 황반변 성으로 진행할 수있다. 안티 VEGF 동안 주사는 안정하거나 신생 혈관 AMD의 IT 내가 시력을 향상치료가 아니다, 그리고 현재 어떤 치료는 지리적 위축에 대한 존재하지 않습니다. 특정 유전자 변이가 AMD의 위험 4 수정하는 것으로 나타났다 동안 - 8, 이하 이러한 변형은 생화학 적 수준에서 황반에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 알려져있다. AMD의 발병 기전에 중요한 사이트는 브루흐의 막이다. 이 구조와 다양한 연구 내에서 드루 젠 형태와 AMD 9 부르크 막 주위 보체 활성화의 증거를 제공했다. 부르크 막 맥락막으로부터 망막 색소 상피 세포를 분리하는 세포 외 기질의 시이트이고, 약 4 ㎛의 두께이다. 부르크 막 맥락막 모세로 병합 유창 모세 혈관이 외부를 포함 맥락막의 층은 큰 혈관 (10) (도 1a)을 함유하는 층이다. 브루흐의 멤브레인은 별도의 pentilaminar 시트입니다세포 기질 (ECM), 그리고이 방법은 적혈구와 크게 decellularized 무료 인 (이하, 부르크 막 농후 함)의 기본 맥락막 모세 ECM과 함께, 부르크 막 분리 방법 자세히. 농축 부르크 막 후 웨스턴 블 롯팅 및 조직학 실험에 사용 하였다. 또한, 눈의 황반 지역에서 유일하게 브루흐의 멤브레인을 풍부하게하기위한 방법이 설명되어 있습니다, AMD의 생화학 적 측면을 조사하는 사람들에게 특히 관심이 될 것이다.

<table><tbody><tr><td>Auxillary objective 0.5X</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>3638</td><td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td></tr><tr><td>Biopsy Punch 6 mm</td><td>Oncall Medical Supplies</td><td>SCH-33-36</td><td>6mm Biopsy Punches</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>Cell scrapers</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td>For membrane enrichment</td></tr><tr><td>CyroPure Cyrovials</td><td>Sarstedt</td><td>72.38</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Scalpels</td><td>Fisher Scientific</td><td>12387999</td><td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td></tr><tr><td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30 cm arms</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>0153</td><td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>D8537</td><td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td></tr><tr><td>(A) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4280</td><td>(A) Fine (100 mm) and straight</td></tr><tr><td>(B) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4272</td><td>(B) Broad and blunt (150 mm). Useful for lifting large portions of sample</td></tr><tr><td>(C) Forceps</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4323</td><td>(C) Straight fine points</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>GXCAM 5 digital colour camera &amp;amp; GT-Vision software</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>M/4000/17</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane</td><td>Life Technologies</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Life Technologies</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Sterilin</td><td>101VR20</td><td>90 mm, used as a dish for samples</td></tr><tr><td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td><td>Agilent</td><td>400714-61</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7X - 45X)</td><td>GT-Vision Ltd</td><td>5595</td><td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr></tbody></table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

연령 관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서 시각 장애의 주요 원인이다. 질병은 중심 시력의 손실의 결과, 망막 황반의 호출 센터의 파괴로 드러난다. 초기 AMD는 지리적 위축 (AMD 건조) 또는 혈관 신생 (젖은 AMD)으로 늦은 AMD에 진행 할 수 있습니다 부드러운 드루 젠이라는 작은, 황색 병변의 존재에 의해 특징입니다. 임상 적 변화가 잘 설명하고 있으며, AMD의 위험을 부여에 유전 적 영향에 대한 이해가 더욱 상세한지고 있지만, 주요 진행 상황을 결여 한 영역은 유전 적 위험의 생화학 적 결과에 대한 이해이다. 이것은 부르크 막, 혈액 공급으로부터 물질의 생물학적 필터 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층이있는 지지체 역할을 매우 얇은 세포 외 기질의 생화학을 이해하는데 어려움을 부분적으로 기인한다. 드루 젠 F브루흐의 막과 자신의 존재 내에서 ORM은 망막 색소 상피 세포에 영양분의 흐름을 방해. 만 다른 단백질이 상호 작용하는 방식 참으로 브루흐의 막 단백질 성분을 조사,에 의해, 연구진은 드루 젠 형성, 개발 AMD의 이후 시력 상실을 뒷받침 생화학 적 메커니즘을 해명 희망 할 수 있습니다. 이 문서는 하류 생화학 적 분석에 사용, 이것은 이미 부르크 막 생화학의 이해를 변경하는 방법의 예를 제공 할 수 있도록, 전체 브루흐의 막, 또는 단지 황반 영역에서 하나를 풍부하게하기위한 방법을 자세히 설명합니다.

상기 프로토콜 부르크 막, 맥락막 모세의 ECM의 고립 부르크 막 농축하고 결과 RPE를 모두 포함한 세포 / 세포 파편 (도 2)의 대부분을 제거 생성한다. 물에 농축 부르크 막의 세척 남아있는 맥락막 세포를 용균의 핵심 단계이다. 맥락막의 폐기시에 가해지는 압력은 브루흐의 막 (그림 2B)로 정의 된 영역으로 몇 가지 남아있는 세포 핵의 일부를 압축 나타납니다. 농축 부르크 막의 용해 화는 단백질 함량의 하류 분석을 허용한다. 4 사용 부르크 막 농축 가용화에서 단백질 밴드의 분리 - 단백질 함량을 식별 그 자체 동안 유용하지 12 % 구배 SDS-PAGE 겔, 아칸소 오염 혈액 단백질을 최소화하기 위해이 기술의 능력을 입증하지E 비특이적 결합 (도 3B). 농축 부르크 공막의 조직 학적 분석이도에 도시 된 2에도 대응이 점에있어서, 상기 단백질을 겔 실행에서 하나의 현저한 결근 인간 혈청 알부민의 상당한 대역 달리 후속 웨스턴 해석하기 어려운 블로 팅을 할 수있다 (~ 66 kDa의 분자량)이며 이. 작품의 일부는 이전 11 설명 된대로 실제로, 개인 기부자의 시리즈에서 브루흐의 막 서쪽 블로 팅 (그림 3C)를 통해 특정 항체를 사용하여 단백질의 번호를 프로빙 된 가용화. 여기에 도시 된 경우, (OX23 지칭) 항체에 12라는 보체 인자 H (FH)을 사용하고, 선천성 면역의 155 kDa의 레귤레이터에 대해 지시 분리되는 세 부르크 막 샘플에 저 분자량 밴드의 존재를 입증 기증자 (그림 3C). 이는이어서 인수 H 형 단백질을 1로 밝혀졌다 (FHL-1), 49 kDa 단백질에 관한 FH와 동일한 유전자 (13)의 접합부에서 발생하는 변화. FHL-1은 브루흐의 막 (11)의 주요 보수 레귤레이터 존재하는 것으로 나타납니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> 부르크 멤브레인의 인간의 눈과 보충도 1의 해부. (A) 부르크 막 외 매트릭스 장벽이다. 맥락막은 (맥락막 모세 불림) 연속적 부르크 막에 병합 유창 모세관 층을 포함하고, 이러한 생리적 시각 세포를지지하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층에서 (큰 혈관을 포함) 맥락막의 나머지 부분을 분리 감각 신경 망막 (NSR). (B)의 인간 접안부에 포 절개는 평면 실장 만들 개방 될 수 있도록 제조된다. 그만큼유리체는 핀셋을 사용하여 제거 할 수있다. NSR은 유리체와 함께 빠질 수뿐만 아니라 핀셋으로 제거 할 수 있습니다. 셀 스크레이퍼는 여전히 맥락막과 공막에 고정되는 동안 브루흐 막에서의 RPE 세포 층을 제거하기 위해 사용된다. 부르크 막 / 맥락막 착체 멀리 공막로부터 박리 될 수 있고, 새로운 셀 스크레이퍼를 사용하여, 외부 맥락막 제거 할 수있다. 초순수의 최종 세척이 남아있는 세포 문제를 lyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> 그림 2. 고순도 워싱턴에서 브루흐의 막 세척에서 외부 맥락막 구조를 긁어 브루흐의 막과 (A) 전에 맥락막. H &amp; E 염색 섹션의 조직학과 후 (B)터가 브루흐의 막 농축 생성합니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> 도 단백질 함량 분석을위한 농축 부르크 막의 용해 화 3.이. (A) 단백질은 PBS에 대해 투석 전에, 실온에서 6 시간 동안 8 M 우레아 잠복기 충실 부르크 막으로부터 추출 될 수있다. 웨스턴 분석을 위하여, 전체 부르크 막 투석액에서 단백질은 단백질 분리 비드를 이용하여 분리 및 용출 램 믈리 시료 로딩 버퍼 환원성 끓여. (B) 대표 쿠마시 블루 둘 다 단정 보여주는 SDS-PAGE 겔을 염색 부르크 막 가용화 희석 될 수있다 (BM)에있어서, D를 사용하여. (A)에 escribed (C) 3 개인 기부자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 웨스턴 블롯 (레인 1-3). 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)에 대한 프로브 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> 황반에서 농축 부르크 막 그림 4. 격리. 망막 황반 영역 5mm의 용이 상부 중심와의 황색 착색에 의해 식별 될 수있는 영역과, 인접하는 광 디스크의 근접성이다. 가이드로 중심와를 사용하여, 6mm 황반 조직 블록을 절제하는 평면 장착 인간의 눈에 6mm 생검 펀치를 배치합니다. 상부의 NSR를 제거하고 절제 황반에서 망막 색소 상피 세포를 긁어. 나머지 부르크 막 / 맥락막의 복잡한 수N 멀리 공막에서 박리하고 철저를 Lyse 초순수의 침수에 의한 세포 물질을 나머지, 맥락막을 제거하기 위해 긁어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K 조회수.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

세 인간 Bruch 막의 Ex Vivo 모델에서 망막 안료 상피 세포의 배양

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

연구

발생학

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately understood, thus impeding the establishment of defined treatments. Cell-based additive gene therapies for the increased expression of a protective factor are considered as a promising option to medicate neurodegenerative diseases, such as age-related macular degeneration (AMD). We have developed a method for the stable expression of the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF), which is characterized as a neuroprotective and anti-angiogenic protein in the nervous system, into the genome of primary human pigment epithelial (PE) cells using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Primary PE cells were isolated from human donor eyes and maintained in culture. After reaching confluence, 1 x 104 cells were suspended in 11 &#181;L of resuspension buffer and combined with 2 &#181;L of a purified solution containing 30 ng of hyperactive SB (SB100X) transposase plasmid and 470 ng of PEDF transposon plasmid. Genetic modification was carried out with a capillary electroporation system using the following parameters: two pulses with a voltage of 1,100 V and a width of 20 ms. Transfected cells were transferred into culture plates containing medium supplemented with fetal bovine serum; antibiotics and antimycotics were added with the first medium exchange. Successful transfection was demonstrated in independently performed experiments. Quantitative polymerase chain reaction (qPCR) showed the increased expression of the PEDF transgene. PEDF secretion was significantly elevated and remained stable, as evaluated by immunoblotting, and quantified by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). SB100X-mediated transfer allowed for a stable PEDF gene integration into the genome of PE cells and ensured the continuous secretion of PEDF, which is critical for the development of a cell-based gene addition therapy to treat AMD or other retinal degenerative diseases. Moreover, analysis of the integration profile of the PEDF transposon into human PE cells indicated an almost random genomic distribution.

We have developed a protocol to transfect primary human pigment epithelial cells by electroporation with the gene encoding pigment epithelium-derived factor (PEDF) using the Sleeping Beauty (SB) transposon system. Successful transfection was demonstrated by quantitative polymerase chain reaction (qPCR), immunoblotting, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

Our increasingly aging society leads to a growing incidence of neurodegenerative diseases. So far, the pathological mechanisms are inadequately ...

의학

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

AMD 연구를 위한 인간 기증자 안구의 OCT 기반 멀티모달 이미징

Ex Vivo OCT-Based Multimodal Imaging of Human Donor Eyes for Research into Age-Related Macular Degeneration

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging could add prognostic value to laboratory findings. In this work, ex vivo OCT and MMI were applied to human donor eyes prior to retinal tissue sectioning. The eyes were recovered from non-diabetic white donors aged &#8805;80 years old, with a death-to-preservation time (DtoP) of &#8804;6 h. The globes were recovered on-site, scored with an 18 mm trephine to facilitate cornea removal, and immersed in buffered 4% paraformaldehyde. Color fundus images were acquired after anterior segment removal with a dissecting scope and an SLR camera using trans-, epi-, and flash illumination at three magnifications. The globes were placed in a buffer within a custom-designed chamber with a 60 diopter lens. They were imaged with spectral domain OCT (30&#176; macula cube, 30 &#181;m spacing, averaging = 25), near-infrared reflectance, 488 nm autofluorescence, and 787 nm autofluorescence. The AMD eyes showed a change in the retinal pigment epithelium (RPE), with drusen or subretinal drusenoid deposits (SDDs), with or without neovascularization, and without evidence of other causes. Between June 2016 and September 2017, 94 right eyes and 90 left eyes were recovered (DtoP: 3.9 &plusmn; 1.0 h). Of the 184 eyes, 40.2% had AMD, including early intermediate (22.8%), atrophic (7.6%), and neovascular (9.8%) AMD, and 39.7% had unremarkable maculas. Drusen, SDDs, hyper-reflective foci, atrophy, and fibrovascular scars were identified using OCT. Artifacts included tissue opacification, detachments (bacillary, retinal, RPE, choroidal), foveal cystic change, an undulating RPE, and mechanical damage. To guide the cryo-sectioning, OCT volumes were used to find the fovea and optic nerve head landmarks and specific pathologies. The ex vivo volumes were registered with the in vivo volumes by selecting the reference function for eye tracking. The ex vivo visibility of the pathology seen in vivo depends on the preservation quality. Within 16 months, 75 rapid DtoP donor eyes at all stages of AMD were recovered and staged using clinical MMI methods.

저자 스포트라이트: 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 Ex Vivo OCT 기반 다중 모드 이미징  

Laboratory assays can leverage prognostic value from the longitudinal optical coherence tomography (OCT)-based multimodal imaging of age-related macular degeneration (AMD). Human donor eyes with and without AMD are imaged using OCT, color, near-infrared reflectance scanning laser ophthalmoscopy, and autofluorescence at two excitation wavelengths prior to tissue sectioning.

Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

A progression sequence for age-related macular degeneration (AMD) learned from optical coherence tomography (OCT)-based multimodal (MMI) clinical imaging ...

신경과학

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...

생물학

인간 limbal niche 세포를 분리, 배양 및 식별하기 위한 프로토콜

Isolation and Identification of Limbal Niche Cells

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used for LNCs isolation. The tissue was divided into 12 pieces under aseptic conditions and digested for 18 h at 37 &#176;C in the cell culture incubator using collagenase A to obtain cell clusters with LNCs and limbal&#160;epithelial progenitor cells. The cell clusters were further digested for 15 min at 37 &#176;C using 0.25% trypsin-EDTA to obtain single cells and then cultured in modified embryonic stem cell medium (MESCM) on a plastic surface coated with 5% Matrigel. Cells were passaged upon 70% confluence, and LNCs were identified using immunofluorescence, real-time quantitative PCR (qPCR), and flow cytometry. Primary LNCs were isolated and passaged more than 12 times. The proliferation activity of LNCs from P4 to P6 was the highest. LNCs expressed higher stem cell markers than BMMSCs (SCF, Nestin, Rex1, SSEA4, CD73, CD90, MSX1, P75NTR, and PDGFR&#946;). Furthermore, results showed that P4 LNCs uniformly expressed VIM, CD90, CD105, and PDGFR&#946;, but not Pan-CK, which could be used as a marker for the identification of LNCs. Flow cytometric analysis showed that approximately 95%, 97%, 92%, and 11% of LNCs expressed CD73, CD90, CD105, and SCF respectively, while they were&#160;68%, 99%, 20%, and 3% in&#160;BMMSCs. The standard process for LNC&#160;isolation and identification could provide&#160;a reliable laboratory basis for the widespread use of LNCs.

저자 스포트라이트: 광범위한 LNC 연구를 지원하기 위해 LNC(Limbal Niche Cell) 분리 및 특성 분석 표준화 

Here, we present a protocol to isolate and identify the human limbal niche cells.

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별

Here we report a standard procedure for the isolation and identification of limbal niche cells (LNCs). Limbus tissue obtained from an eye bank was used ...

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

요약

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인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 이용한 1차 인간 색소 상피 세포의 전기천공 기반 유전자 변형

소설 인간 오르가노피 망막 문화 기술의 특성화

퇴행성 망막 질병을 위한 비인간 영장류 모형에 있는 망막 안료 상피 이식

Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

Ex Vivo (생체 외 ) 연령 관련 황반변성 연구를 위한 인간 기증자 눈의 OCT 기반 다중 모드 이미징

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

Limbal Niche 세포의 분리 및 식별