저자는 박사 이삭 잠브라노와 인간의 기증자의 안구 조직의 공급에 대한 맨체스터 안과 병원 안구 은행의 직원, H &amp; E 염색 이미지 생명 과학 조직학 시설의 학부 씨 피트 워커를 인정하고 싶습니다. 특별 감사는 현미경으로 그의 도움 씨 로저 메도우로 이동합니다. SJC는 의료 연구위원회의 수신자 (MRC) 경력 개발 원정대 (MR / K024418 / 1)이고 저자는 또한, MRC (G0900538 및 K004441)에서 다른 최근의 연구 자금을 인정 시력 (1866)과 황반 사회를위한 싸움.

연구 목적으로 동의 인간의 눈의 조직을 이식 각막의 제거 다음 맨체스터 로얄 안과 병원 안구 은행에서 얻어졌다. 연구를위한 인체 조직의 사용은 인체 조직의 법 (2004) 지침에 따라, 그리고 대학 연​​구 윤리위원회의 승인 (11305 참조). 전체 부르크 막 1. 심화 <ol><li> 주위의 작​​업 공간을 청소하고 1 %의 살균제와 해부 현미경 아래 (v / v),이어서 70 % (v / v)의 에탄올로 닦아. </li><li> 확인 손을은 다음과 같습니다 (A, B 및 C로 여기에 나열된 자료 목록 참조) 하나의 새로운 일회용 메스, (일반적으로 조직 배양에 사용되는) 두 무균 세포 스크레이퍼와 핀셋 세 쌍. </li><li> 나중에 사용하기 위해 뚜껑을 유지, 일회용 페트리 접시에 눈 글로브를 놓습니다. 새로운 일회용 메스를 사용하여, 플랫 MO를 생성을 방해 할 수있는 임의의 잔여 시신경 삭제조직의 UNT. 다음, 확인 네 절개는 동일하게 3 부 (황반 부르크 막 농축)로 진행하는 것은 황반 영역을 통해 절단하지 않는 경우, 네 개의 사분면을 만들 이격. <ol><li> 가장 안쪽의 감각 신경 망막 (NSR)에서, 맥락막과 공막 (눈의 흰색)을 통해 - 절개가 안구 조직의 전체 깊이를 확장 있는지 확인합니다. 절개에게 시신경에 아이 컵의 여백에서 눈 라운드 모든 방법을 계속합니다. 이 아이 컵은 (그림 1B 참조) 평평 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 평면화 세안 컵의 일 사분면을 잡고 중심을 향해 이동 (맥락막 박리를 방지하기 위해) 그립 큰 집게 B에게 유리체 및 하부 NSR을 사용하고 주변부터 멀리 망막 색소 상피 (RPE)에서이 조직을 끌어 열린 아이 컵의 다음 상대 측에. 일반적으로,하지만 항상 유리체와 NSR 모두 하나로 분리하지. scalpe를 사용하여L은 시신경 유두에 고정 잔여 NSR을 절제합니다. </li><li> 다시 말하지만, 집게를 사용 장소에 조직 중 하나 사분면을 들고하는 동안, 부드럽게 아이 컵의 전체 내부 표면에서 망막 색소 상피 단일 층을 제거하기 위해 무균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. 이 세포는 쉽게 분리하고 어두운 갈색 색소 덩어리를 볼 수 있습니다. 부드럽게 아이 컵에서 멀리 빠질 망막 색소 상피 세포를 씻어 PBS로 씻어. </li><li> 다음, 가볍게 4 눈 사분면에서 (브루흐의 막과 맥락막 모두 포함) 위에 놓인 어두운 붉은 조직을 벗겨 집게를 사용합니다. 깨끗한 접시에 절제 조직을 놓습니다. </li><li> 하나의 셀 스크레이퍼의 평평한 가장자리를 사용하여, 장소에서 적출 된 조직을 잡고 부드럽게 조직을 긁어 두 번째 스크레이퍼를 사용합니다. 가능한 한 많은 과잉 물질을 제거, 이상 조직을 켜고 반복합니다. 결국, 반투명 막이 남아 :이 조잡 농축 브루흐의 막이다. 20X 배율의 최소 해부 현미경을 사용하는 것이다브루흐의 막 맥락막과 농축의 제거를 돕는 필수적. </li><li> 파스퇴르 피펫을 사용하여 간단하게 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 막 배치하기 전에 잔류 맥락막과 혈액을 제거하기 위해 초순수와 브루흐의 막을 린스. </li><li> 어떤 오염 세포 문제를 용균 수 있도록 약 1 ml의 초순수 및 와류 간단히 (약 15 초)에 농축 부르크 막 일시 중단 (그림 2 참조). 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 참고 : 나중에 사용하기 위해 -80 ° C에서 또는 저장 (섹션 2 아래에 설명 된대로) 나머지 풍부한 부르크 막 가용화를위한 준비가되었습니다. </li></ol> 전체 농축 브루흐의 막과 서양 얼룩 분석 2. 가용화 <ol><li> 500 μL 8 M UR의 조직을 침지시켜 풍부한 부르크 막에서 단백질을 추출1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 (그림 3A)에 실온에서 6 시간 동안 개. </li><li> 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 용해 된 샘플은 남아있는 세포 외 물질을 펠렛. 상층 액을 제거하고 3,500 다 MWCO 투석 막에 전송 한 후 4 ℃에서 16 시간 동안 dialyse하는 PBS의 1 L에 샘플을 배치합니다. </li><li> 각 샘플에 대해, 단백질 분리 비드 40 ㎕를 추가하고 실온에서 30 분 동안 샘플 / 비드 혼합 (회전 믹서에서 20 RPM)로 회전한다. </li><li> 5 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플은 구슬을 펠렛. (/ V) 글리세롤 승, 0.01 % 브로 모 페놀 블루, 3 % β-머 캅토 에탄올 (65.8 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 2.1 % SDS 26.3 %)을 30 μL 배 샘플 로딩 버퍼에 구슬에 결합 된 단백질을 상층 액을 제거하고 용해. </li><li> 10 분 동안 100 ℃에서 샘플을 인큐베이션하고, 5 분 나머지 비드 펠렛 위해 10,000 XG 원심 분리기. </li><li> 프리 캐스트에에 출시 된 단백질을 포함하는 상층 액을로드 SDS-단백질 분리를위한 페이지 그라데이션 젤 (자료 목록 참조). </li><li> 예를 들어, 일반적인 염색 프로토콜, 쿠마 블루를 사용하여 분리 된 단백질 밴드를 시각화. <ol><li> ((W / V), 50 % 메탄올, 10 % 빙초산, 40 % 물, 0.1 % 브릴리언트 블루) 겔, 및 교반과 함께 RT에서 30 분 동안 간단히, 브릴리언트 블루 염색 20 ㎖를 추가 부화 . </li><li> 염색 액을 버리고 배경 염색 충분히 염색 된 단백질 밴드를 시각화 할 수 있도록 감소 될 때까지, 탈 이온수로 염색 겔 씻는다. </li><li> 아래에 설명 된대로 또는, 전송, 서부 분석을 위해 니트로 셀룰로오스에 단백질 밴드를 분리. </li></ol></li><li> 전송은 전송 버퍼의 반 건조 이송 장치 (25 mM 트리스, 192 mM의 글리신, 10 % [v / V를 메탄올)를 사용하여 2.5 시간 동안 80mA에서 니트로 셀룰로오스 막에 단백질 밴드를 분리. </li><li> 10 ml의 PBS, 10 %에 막을 차단 일 전에 4 ℃에서 16 시간 동안 우유, 0.02 % (W / V) BSA (/ V W)단백질 검출을위한 소정의 일차 항체 E 첨가. 참고 : 여기에 예를 들어, 그림 3c는 보완 캐스케이드, 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)의 조절에 대한 탐색 할 세 가지 별도의 기증자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 면역을 보여줍니다. </li></ol> 3. 농축 황반 브루흐의 멤브레인의 <ol><li> 전술 한 바와 같이 1.3 - 단계 1.1를 따릅니다. </li><li> NSR 자리에 여전히 동안 중앙 황반 영역 (그림 4 참조) 나타내는 노란색 중심와의 착색을 찾습니다. 멸균 6mm 생검 펀치를 사용하여 중심와 영역 위에 배치 단단히 황반에 잘라. <ol><li> 대신 생검 펀치 유지 깨끗한 생검을 달성하기 위해 주위의 눈 재료를 벗겨, 생검 펀치 블레이드의 가장자리에 아이 컵의 가장자리에서 메스 별도의 절개를 한 후 집게 B를 사용. </li></ol></li><li> 집게를 사용하여 C, 제거깨끗한 페트리 접시 뚜껑에 펀치와 장소에서 조직의 6mm 디스크. 해부 현미경 페트리 접시의 뚜껑과 황반 펀치를 놓습니다. </li><li> (조직 검사의 정확성을 추론하는 노란색 중심와​​ 염색 검사) 얇은 NSR 디스크를 제거합니다. 부드럽게 망막 색소 상피 세포를 제거하는 살균 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 트위터 A의 팁을 사용하여 공막을 통해 황반 디스크를 고정하고 천천히 맥락막과 트위터 다 다시를 사용 부르크 막 복합체를 벗겨, 브루흐의 막에서 원치 않는 맥락막 혈액 물질을 제거하는 세포 스크레이퍼를 사용합니다. </li><li> 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 황반 부르크 막 넣고 1ml의 초순수에 일시. 소용돌이 짧게 (약 15 초) 어떤 오염 세포 문제를 용균 도움이됩니다. 막 펠렛과 뜨는을 대기음 30 초 동안 500 XG에서 샘플을 원심 분리기. 주 : 황반 분리 농축 부르크 막 해주기 단백체 위해 사용될 수있다alysis는 사용자가 선호하는 소화 프로토콜을 사용. </li></ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life:+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures.">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li><li>Hageman, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에서 우리는 추가 분석이 서양 블롯 (11), 질량 분석 및 활용 수정 챔버 11,14 Ussing 브루흐의 멤브레인의 확산 특성을 포함한 이후의 분석을 허용하는 브루흐의 멤브레인의 농축에 대해 설명합니다. 중요한 단계는) 눈의 내면의 철저한 긁고 세탁 부르크가 붕괴를 발생시키지 않고 모든 RPE 세포 b) 하부 맥락막의 반복 및 조심 긁어 제거하고, 초순수에서 적출 부르크의 c) 세척 포함 잔여 세포의 용해를 확인합니다. 농축 부르크 막 단백질체 분석에 이용 될 것인지 또한, 우레아 처리하여 단백질을 추출 기계적 균질화 같은 다른 방법에 비하여 탄성이 조직을 분해에 가장 효과적이다. 풍부한 부르크 막의 조직학은 맥락막 모세의 ECM이 제거되지 않음을 나타냅니다. 이 전 할 것입니다pentilaminar 부르크 막의 외층은 예견했던 맥락막 모세 내피 세포의 기저막에 의해 형성된다. 실제로는 변화가 터미널 보완 복잡한 / 막 공격 복합체 (MAC) (15)의 증착을 포함한 AMD이에서 발생하는 맥락막 모세의 ECM이 남아 유리할 수있다. 그것은 공막, 맥락막, 및 부르크 막의 존재 단면 경우 부르크 막 상세한 조직 학적 분석을 위해, 그것의 구조가 잘 보존 될 것이라는 점에 유의해야한다. 실제로,도 2에 제시된 조직학는 전적으로이 원고에 기재된 기술로부터 얻어진 농축의 정도를 설명하기위한 것이다. 황반 부르크의 농축은 NSR 특히 황반이 손상되지 않도록 보장, 아이 컵의주의 절개가 필요합니다; 그렇지 않으면 식별 및 황반의 이렇게 분리가 불가능합니다. tissu의 무결성전자는이 과정에 중요하며 따라서 48 시간 사후 시간에서 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 농축 정도는 도너 사이에서 변화하고 도너 연령, 사후 시간, 및 안구 병변의 존재에 의해 영향을받을 수있다. 농축 된 용어의 사용은이 &#39;정제&#39;또는이 방법을 사용 부르크 막 &#39;차단&#39;은 단순히 불가능하다고되고, 기술의 한계를 인정할 의도적이다. 실제로, 맥락막 모세의 ECM은 브루흐의 막으로 병합 주어진 것은이 완전한 분리는 가능하지 않습니다. 각각의 안구 조직의 생화학 적 변화를 이해하는 것은 눈 질병의 진행을 이해하는데 필수적이다. 브루흐의 멤브레인의 독특한 농축이 이해를 용이하게; 진행중인 연구는 AMD의 다른 단계에서 질량 분석법을 이용하여 농축 된 황반 부르크 막 프로테옴을 조사다른 유전자형을 가진 환자에서 발생하는 샘플에서 AMD의 분자 병리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 여기에 이미 기술 된 기법을 성공적으로 농축 부르크 막에 부르크 막 (11) 및 추가 연구의 주된 보체 조절 제로 FHL-1을 식별하는 데 사용 된 AMD의 분자 병리에 더 많은 새로운 통찰력을 초래할 가능성이있다.

안과 연구의 사후 부검 인간의 눈 조직의 사용은 안과 질환의 발병 기전의 이해를위한 귀중한 자원이다. 인간의 기증자 눈의 분석은 서구 세계 1 실명의 주요 원인 인 노인성 황반변 성 (AMD)을 뒷받침하는 메커니즘을 분별하는 중요한 기여를했다. 전 세계적으로, AMD는 모든 실명의 약 8.7 %를 차지하고과 점점 고령화와 함께, 그것은 중심 시력의 손실에서 2020 2. AMD 결과에 의해 196,000,000명에 영향을 미칠 것으로 예상되고, 환자의 독립성과 삶의 질에 지대한 영향을 미친다 3. 초기 AMD 드루 젠이 형성되는 것을 특징으로하며 (또한, 혈관 신생 또는 &quot;습식&quot;AMD 라 함) (때로는 &quot;건식&quot;AMD 라 함) 지리적 위축, 또는 황반변 성으로 진행할 수있다. 안티 VEGF 동안 주사는 안정하거나 신생 혈관 AMD의 IT 내가 시력을 향상치료가 아니다, 그리고 현재 어떤 치료는 지리적 위축에 대한 존재하지 않습니다. 특정 유전자 변이가 AMD의 위험 4 수정하는 것으로 나타났다 동안 - 8, 이하 이러한 변형은 생화학 적 수준에서 황반에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 알려져있다. AMD의 발병 기전에 중요한 사이트는 브루흐의 막이다. 이 구조와 다양한 연구 내에서 드루 젠 형태와 AMD 9 부르크 막 주위 보체 활성화의 증거를 제공했다. 부르크 막 맥락막으로부터 망막 색소 상피 세포를 분리하는 세포 외 기질의 시이트이고, 약 4 ㎛의 두께이다. 부르크 막 맥락막 모세로 병합 유창 모세 혈관이 외부를 포함 맥락막의 층은 큰 혈관 (10) (도 1a)을 함유하는 층이다. 브루흐의 멤브레인은 별도의 pentilaminar 시트입니다세포 기질 (ECM), 그리고이 방법은 적혈구와 크게 decellularized 무료 인 (이하, 부르크 막 농후 함)의 기본 맥락막 모세 ECM과 함께, 부르크 막 분리 방법 자세히. 농축 부르크 막 후 웨스턴 블 롯팅 및 조직학 실험에 사용 하였다. 또한, 눈의 황반 지역에서 유일하게 브루흐의 멤브레인을 풍부하게하기위한 방법이 설명되어 있습니다, AMD의 생화학 적 측면을 조사하는 사람들에게 특히 관심이 될 것이다.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

연령 관련 황반 변성 (AMD)은 선진국에서 시각 장애의 주요 원인이다. 질병은 중심 시력의 손실의 결과, 망막 황반의 호출 센터의 파괴로 드러난다. 초기 AMD는 지리적 위축 (AMD 건조) 또는 혈관 신생 (젖은 AMD)으로 늦은 AMD에 진행 할 수 있습니다 부드러운 드루 젠이라는 작은, 황색 병변의 존재에 의해 특징입니다. 임상 적 변화가 잘 설명하고 있으며, AMD의 위험을 부여에 유전 적 영향에 대한 이해가 더욱 상세한지고 있지만, 주요 진행 상황을 결여 한 영역은 유전 적 위험의 생화학 적 결과에 대한 이해이다. 이것은 부르크 막, 혈액 공급으로부터 물질의 생물학적 필터 및 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층이있는 지지체 역할을 매우 얇은 세포 외 기질의 생화학을 이해하는데 어려움을 부분적으로 기인한다. 드루 젠 F브루흐의 막과 자신의 존재 내에서 ORM은 망막 색소 상피 세포에 영양분의 흐름을 방해. 만 다른 단백질이 상호 작용하는 방식 참으로 브루흐의 막 단백질 성분을 조사,에 의해, 연구진은 드루 젠 형성, 개발 AMD의 이후 시력 상실을 뒷받침 생화학 적 메커니즘을 해명 희망 할 수 있습니다. 이 문서는 하류 생화학 적 분석에 사용, 이것은 이미 부르크 막 생화학의 이해를 변경하는 방법의 예를 제공 할 수 있도록, 전체 브루흐의 막, 또는 단지 황반 영역에서 하나를 풍부하게하기위한 방법을 자세히 설명합니다.

상기 프로토콜 부르크 막, 맥락막 모세의 ECM의 고립 부르크 막 농축하고 결과 RPE를 모두 포함한 세포 / 세포 파편 (도 2)의 대부분을 제거 생성한다. 물에 농축 부르크 막의 세척 남아있는 맥락막 세포를 용균의 핵심 단계이다. 맥락막의 폐기시에 가해지는 압력은 브루흐의 막 (그림 2B)로 정의 된 영역으로 몇 가지 남아있는 세포 핵의 일부를 압축 나타납니다. 농축 부르크 막의 용해 화는 단백질 함량의 하류 분석을 허용한다. 4 사용 부르크 막 농축 가용화에서 단백질 밴드의 분리 - 단백질 함량을 식별 그 자체 동안 유용하지 12 % 구배 SDS-PAGE 겔, 아칸소 오염 혈액 단백질을 최소화하기 위해이 기술의 능력을 입증하지E 비특이적 결합 (도 3B). 농축 부르크 공막의 조직 학적 분석이도에 도시 된 2에도 대응이 점에있어서, 상기 단백질을 겔 실행에서 하나의 현저한 결근 인간 혈청 알부민의 상당한 대역 달리 후속 웨스턴 해석하기 어려운 블로 팅을 할 수있다 (~ 66 kDa의 분자량)이며 이. 작품의 일부는 이전 11 설명 된대로 실제로, 개인 기부자의 시리즈에서 브루흐의 막 서쪽 블로 팅 (그림 3C)를 통해 특정 항체를 사용하여 단백질의 번호를 프로빙 된 가용화. 여기에 도시 된 경우, (OX23 지칭) 항체에 12라는 보체 인자 H (FH)을 사용하고, 선천성 면역의 155 kDa의 레귤레이터에 대해 지시 분리되는 세 부르크 막 샘플에 저 분자량 밴드의 존재를 입증 기증자 (그림 3C). 이는이어서 인수 H 형 단백질을 1로 밝혀졌다 (FHL-1), 49 kDa 단백질에 관한 FH와 동일한 유전자 (13)의 접합부에서 발생하는 변화. FHL-1은 브루흐의 막 (11)의 주요 보수 레귤레이터 존재하는 것으로 나타납니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> 부르크 멤브레인의 인간의 눈과 보충도 1의 해부. (A) 부르크 막 외 매트릭스 장벽이다. 맥락막은 (맥락막 모세 불림) 연속적 부르크 막에 병합 유창 모세관 층을 포함하고, 이러한 생리적 시각 세포를지지하는 망막 색소 상피 (RPE) 세포 단층에서 (큰 혈관을 포함) 맥락막의 나머지 부분을 분리 감각 신경 망막 (NSR). (B)의 인간 접안부에 포 절개는 평면 실장 만들 개방 될 수 있도록 제조된다. 그만큼유리체는 핀셋을 사용하여 제거 할 수있다. NSR은 유리체와 함께 빠질 수뿐만 아니라 핀셋으로 제거 할 수 있습니다. 셀 스크레이퍼는 여전히 맥락막과 공막에 고정되는 동안 브루흐 막에서의 RPE 세포 층을 제거하기 위해 사용된다. 부르크 막 / 맥락막 착체 멀리 공막로부터 박리 될 수 있고, 새로운 셀 스크레이퍼를 사용하여, 외부 맥락막 제거 할 수있다. 초순수의 최종 세척이 남아있는 세포 문제를 lyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> 그림 2. 고순도 워싱턴에서 브루흐의 막 세척에서 외부 맥락막 구조를 긁어 브루흐의 막과 (A) 전에 맥락막. H &amp; E 염색 섹션의 조직학과 후 (B)터가 브루흐의 막 농축 생성합니다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> 도 단백질 함량 분석을위한 농축 부르크 막의 용해 화 3.이. (A) 단백질은 PBS에 대해 투석 전에, 실온에서 6 시간 동안 8 M 우레아 잠복기 충실 부르크 막으로부터 추출 될 수있다. 웨스턴 분석을 위하여, 전체 부르크 막 투석액에서 단백질은 단백질 분리 비드를 이용하여 분리 및 용출 램 믈리 시료 로딩 버퍼 환원성 끓여. (B) 대표 쿠마시 블루 둘 다 단정 보여주는 SDS-PAGE 겔을 염색 부르크 막 가용화 희석 될 수있다 (BM)에있어서, D를 사용하여. (A)에 escribed (C) 3 개인 기부자로부터 가용화 부르크 막의 대표적인 웨스턴 블롯 (레인 1-3). 인수 H-같은 단백질 1 (FHL-1)에 대한 프로브 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> 황반에서 농축 부르크 막 그림 4. 격리. 망막 황반 영역 5mm의 용이 상부 중심와의 황색 착색에 의해 식별 될 수있는 영역과, 인접하는 광 디스크의 근접성이다. 가이드로 중심와를 사용하여, 6mm 황반 조직 블록을 절제하는 평면 장착 인간의 눈에 6mm 생검 펀치를 배치합니다. 상부의 NSR를 제거하고 절제 황반에서 망막 색소 상피 세포를 긁어. 나머지 부르크 막 / 맥락막의 복잡한 수N 멀리 공막에서 박리하고 철저를 Lyse 초순수의 침수에 의한 세포 물질을 나머지, 맥락막을 제거하기 위해 긁어. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

인간의 기증자 눈에서 브루흐의 멤브레인의 농축

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K 조회수.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

절연, 강화하고, Medulloblastoma의 줄기 세포의 유지 보수

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

연구

신경과학

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

폐기 인간 태아 두피 조직에서 신경 줄기 세포의 생성

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM 염료를 사용하여 양식 소뇌 과립 뉴런에서 시냅틱 소포 풀 보충의 정량 분석

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

쥐의 눈으로 인간 망막 안료 상피 세포의 트랜스 scleral Subretinal 이식에 대 한 세련 된 프로토콜의 개발

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

신선한 인간의 뇌 조직에서 뇌 모세 혈관의 절연

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...