Die Autoren danken Dr. Isaac Zambrano und das Personal an der Manchester-Augenklinik Eye Bank für die Lieferung von menschlichen Spender Augengewebes, und Mr. Pete Walker der Fakultät für Lebenswissenschaften Histologie Anlage für die H &amp; E gefärbten Bildern erkennen. Besonderer Dank geht an Herrn Roger Meadows für seine Hilfe bei der Mikroskopie. SJC ist ein Empfänger einer Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1), und die Autoren auch andere aktuelle Forschungsförderung von MRC (G0900538 und K004441) anzuerkennen, Fight for Sight (1866) und der Makula Society.

Menschliche Auge Gewebe zu Forschungszwecken eingewilligt wurde von der Manchester Königlichen Eye Hospital Eye Bank nach dem Entfernen der Hornhaut zur Transplantation erhalten. Die Verwendung von menschlichem Gewebe für die Forschung wurde in Übereinstimmung mit der Human Tissue Act (2004) Richtlinien, mit Zustimmung University Research Ethics Committee (Referenz 11305). 1. Anreicherung von Whole Bruch-Membran <ol><li> Reinigen Sie den Arbeitsbereich um und unter dem Binokular mit 1% Desinfektionsmittel (v / v) und dann wischen Sie mit 70% (v / v) Ethanol. </li><li> Achten Sie darauf, das Folgende zu Hand: eine neue Einweg-Skalpell, zwei sterilen Zellschaber (üblicherweise in Gewebekultur verwendet werden) und drei Paare von Pinzetten (hier als A, B, und C aufgeführt sind, siehe Materialliste). </li><li> Setzen Sie die Augenkugel in eine Einweg-Petrischale, Halten des Deckels für die spätere Verwendung. Mit Hilfe einer neuen Einweg-Skalpell, entfernen Sie alle Rest Sehnerv, die stören können mit der Erstellung einer flachen mount des Gewebes. Als nächstes stellen vier Schnitte gleichmäßig beabstandet um vier Quadranten zu erstellen, wenn Sie fortfahren, Teil 3 (Anreicherung von Makula Bruch-Membran) nicht durch die Makula-Region geschnitten. <ol><li> Stellen Sie sicher, dass die Einschnitte erstrecken sich durch die gesamte Tiefe des Augengewebes - vom innersten neurosensorischen Netzhaut (NSR), durch die Aderhaut und Lederhaut (Weiß des Auges). Fahren Sie den Einschnitt den ganzen Weg um das Auge von dem Rand der Augenmuschel des Sehnervs. Damit wird die Augenmuschel aus abgeflacht werden (siehe Abbildung 1B). </li></ol></li><li> Halten eines Quadranten des abgeflachten Augenmuschel mit Pinzette A (bis Aderhaut Ablösung zu verhindern), verwenden Sie den größeren Pinzette B zu greifen den Glaskörper und die zugrunde liegenden NSR und ziehen dieses Gewebe aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE), beginnend an der Peripherie, Bewegung in Richtung Zentrum der geöffneten Augenmuschel und dann an der gegenüberliegenden Seite. In der Regel, aber nicht immer beide Glaskörper und NSR lösen als einer. Verwenden Sie die scalpel, um restliche NSR an der Papille verankert herauszuschneiden. </li><li> Wieder, während, einen Quadranten von Gewebe an Ort und Stelle mit Pinzette A, verwenden Sie den sterilen Zellschaber, um sanft zu entfernen die RPE-Monoschicht von der gesamten Innenfläche der Augenmuschel. Diese Zellen leicht lösen und als dunkelbraun pigmentierter Klumpen zu sehen. Spülen mit PBS vorsichtig waschen weg verdrängt RPE-Zellen aus der Augenmuschel. </li><li> Als Nächstes verwenden Pinzette A vorsichtig schälen die darüber liegende dunkelrote Gewebe (die sowohl Bruch-Membran und der Aderhaut) von allen 4 Quadranten Auge. Legen Sie die ausgeschnittenen Gewebe in eine saubere Schüssel. </li><li> Unter Verwendung der abgeflachten Kante von einem Zellschaber, um die herausgeschnittenen Gewebe in Position zu halten, verwenden Sie die zweite Schaber, um sanft kratzen das Gewebe. Drehen Sie das Gewebe über und wiederholen, die Beseitigung so viel überschüssiges Material wie möglich. Schließlich wird eine lichtdurchlässige Membran bleibt: dies ist die grob angereicherten Bruchmembran. Die Verwendung des Präpariermikroskop bei einem Minimum von 20-facher Vergrößerung istunerlässlich bei der Unterstützung der Entfernung der Aderhaut und Bereicherung der Bruch-Membran. </li><li> Mit einer Pasteurpipette, kurz die Bruch-Membran mit ultrareinem Wasser spülen, um Restaderhaut und Blut, bevor die Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen. </li><li> Hängen Sie das angereicherte Bruch-Membran in etwa 1 ml Reinstwasser und kurz vortexen (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz (siehe Abbildung 2). Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Die verbleibenden bereichert Bruch-Membran ist nun bereit für die Solubilisierung oder Lagerung bei -80 ° C für die spätere Verwendung (wie in Abschnitt 2 unten beschrieben). </li></ol> 2. Solubilisierung von Whole Enriched Bruch-Membran und Western Blot-Analyse <ol><li> Extrahieren Sie Protein aus angereicherten Bruch-Membran durch Eintauchen des Gewebes in 500 ul 8 M urea für 6 h bei RT in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (3A). </li><li> Zentrifuge solubilisierten Proben bei 10.000 × g für 10 min, um alle verbleibenden extrazellulären Materie zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und überträgt es auf 3.500 Da MWCO Dialysemembran, dann legen Sie die Probe in 1 l PBS zu 16 Stunden bei 4 ° C dialysiert. </li><li> Für jede Probe werden 40 ul der Proteinisolierung Perlen, und drehen Probe / Perlenmix (20 UpM auf einer rotierenden Mischer) bei RT für 30 min. </li><li> Zentrifuge Proben bei 10.000 × g für 5 min pelletiert der Wülste. Überstand abnehmen und solubilisieren Proteins an Kügelchen gebunden in 30 ul 2x Probenbeladungspuffer (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) Glycerol, 0,01% Bromphenolblau, 3% β-Mercaptoethanol). </li><li> Inkubieren der Proben bei 100 ° C für 10 min und dann bei 10.000 × g für 5 Minuten zentrifugiert werden, um die verbleibenden Kügelchen zu pelletieren. </li><li> Laden der Überstand, der die freigesetzten Proteine ​​auf einen vorgegossenen enthält SDS-Seite Gradienten-Gel (siehe Materialliste) zur Proteintrennung. </li><li> Visualisieren getrennten Proteinbanden mit einem gemeinsamen Färbeprotokoll zB Coomassie-Blau. <ol><li> Kurz gesagt, 20 ml des strahlend blauen Fleck (0,1% Brilliantblau (w / v), 50% Methanol, 10% Essigsäure, 40% Wasser) auf das Gel, und Inkubation für 30 min bei RT unter leichtem Schütteln . </li><li> Entsorgen Sie die Farblösung und waschen Sie die gefärbten Gels mit entionisiertem Wasser, bis die Hintergrundfärbung ausreichend reduziert, um Buntproteinbande Visualisierung zu ermöglichen. </li><li> Alternativ Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulose für die Western-Analyse, wie unten beschrieben. </li></ol></li><li> Übertragungs getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosemembran bei 80 mA für 2,5 h unter Verwendung halbtrockenen Übertragungsvorrichtung in Transferpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 10% [v / v] Methanol). </li><li> Blockieren der Membran in 10 ml PBS, 10% (w / v) Milch und 0,02% (w / v) BSA für 16 Stunden bei 4 ° C vor the Zugabe der gewünschten primären Antikörper zum Nachweis von Proteinen. Hinweis: Als Beispiel hier zeigt 3C einen repräsentativen Immunoblot solubilisiert Bruch-Membran aus drei verschiedenen Spendern untersucht für einen Regler der Komplementkaskade, Faktor H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Anreicherung von Makula-Bruch-Membran <ol><li> Führen Sie die Schritte 1,1 bis 1,3, wie zuvor beschrieben. </li><li> Während die NSR noch vorhanden ist, suchen Sie die gelbe Fovea-Färbung, die das zentrale Makula-Bereich (siehe Abbildung 4) darstellt. Mit einem sterilen 6 mm Stanzbiopsie, legen Sie sie über der fovealen Region und fest schneiden in der Makula. <ol><li> Halten die Biopsie-Stanze an Ort und Stelle, stellen Sie eine separate Inzision mit einem Skalpell aus dem Rand der Augenmuschel an den Rand der Biopsie Stanzmesser, und dann mit Pinzette B, abziehen der umgebenden Augenmaterial, um einen sauberen Biopsie zu erreichen. </li></ol></li><li> Verwendung Pinzette C, zu entfernendie 6-mm-Scheibe von Gewebe aus dem Stempel und auf den sauberen Petrischale Deckel. Legen Sie die Petrischale Deckel und Makula-Punch unter dem Binokular. </li><li> Entfernen Sie die dünne NSR Scheibe (nach gelben Fovea-Färbung, um die Genauigkeit der Biopsie entnehmen). Verwenden Sie eine sterile Zellschaber zur schonenden Entfernung der RPE-Zellen. </li><li> Sichern Sie die Makula-Disk über der Lederhaut mit den Spitzen der Pinzette ein, und langsam ziehen Sie die Aderhaut und der Bruch-Membran-Komplex mit Pinzetten C. Auch hier verwenden Sie den Zellschaber, um unerwünschte Aderhaut und Blutstoffe aus Bruch-Membran zu entfernen. </li><li> Legen Sie die Makula-Bruch-Membran in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Aussetzung in 1 ml ultrareinem Wasser. Vortex kurz (ca. 15 sec) zu helfen, zu lysieren keine verunreinigenden Zellsubstanz. Zentrifugieren Sie die Probe bei 500 xg für 30 Sekunden, um die Membran zu pelletieren und absaugen des Überstandes. Hinweis: Das angereicherte Bruch-Membran von der Makula isoliert kann jetzt verwendet werden, ein Proteom-alysis mit bevorzugten Verdauung Protokollen des Benutzers. </li></ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. 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The authors declare that they have no competing financial interests.

Hier beschreiben wir die Bereicherung der Bruch-Membran für die weitere Analyse ermöglicht nachfolgenden Analysen einschließlich Western-Blot 11, Massenspektrometrie und die Diffusionseigenschaften der Bruch-Membran unter Verwendung von modifizierten Ussing-Kammern 11,14. Kritischer Schritte umfassen a) die gründliche Abschaben und Waschen der inneren Oberfläche des Auges um alle RPE-Zellen b) die wiederholte und vorsichtiges Abkratzen der darunterliegenden Aderhaut, ohne dass das Bruch-zu zerfallen zu entfernen, und c) Waschen des entfernten Bruch&#39;sche in Reinstwasser zur Lyse von Rest Zellen sicherzustellen. Außerdem, wenn der Bruch-Membran angereichert ist, für Proteomanalyse verwendet werden, Proteinextraktion durch die Harnstoff-Behandlung ist am wirksamsten in der Aufteilung dieses elastischen Gewebes im Vergleich zu anderen Verfahren, wie mechanische Homogenisierung. Histologie von angereichertem Bruch-Membran zeigt das ECM des Choriokapillaris nicht entfernt. Dies ist ex seinsichtlichen als äußere Schicht der pentilaminar Bruch-Membran wird durch Choriokapillaris Endothelzellen Basalmembranen gebildet. Tatsächlich kann es vorteilhaft sein, dass das ECM des Choriokapillaris bleibt als Änderungen dies auftreten in AMD einschließlich der Ablagerung von terminalen Komplementkomplex / Membran-Angriffskomplex (MAC) 15. Es sollte beachtet werden, dass für eine detaillierte histologische Analyse der Bruch-Membran, ihre Struktur besser erhalten, wenn in Gegenwart von der Sklera, Aderhaut, und Bruch-Membran geschnitten werden kann. Tatsächlich ist die Histologie in 2 präsentiert ausschließlich zur Deckung der Anreicherungsgrad von der in dieser Handschrift beschriebenen Technik resultierenden demonstrieren. Anreicherung von Makula Bruchs erfordert eine sorgfältige Präparation der Augenmuschel, sicherzustellen, dass der NSR und insbesondere die Fovea nicht beschädigt werden; andernfalls Identifikation und somit die Isolierung des Makula nicht möglich. Die Integrität der tissue ist auch wichtig, zu diesem Prozess und es wird daher empfohlen, alle Proben unter 48 Stunden post mortem Zeit verwendet werden. Der Grad der Anreicherung erforderlich variiert zwischen Gebern und durch Spenderalter, Post-mortem-Zeit, und die Anwesenheit von jedem Auge Pathologie betroffen sein. Die Verwendung des Begriffs angereichert ist gewollt in Anerkennung einer Einschränkung der Technik, wobei dies, dass &quot;Reinigung&quot; oder &quot;Trennung&quot; der Bruch-Membran mit dieser Methode ist einfach nicht möglich. Aufgrund der Tatsache, dass der ECM des Choriokapillaris geht in Bruch-Membran gibt es eine vollständige Trennung nicht möglich ist. Das Verständnis der biochemischen Veränderungen der jeweiligen Augengewebe ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis Augenfortschreiten der Krankheit. Diese einzigartige Bereicherung der Bruch-Membran erleichtert dieses Verständnis; laufende Studien untersuchen das Proteom von angereichertem Makula-Bruch-Membran unter Verwendung von Massenspektrometrie in verschiedenen Stadien der AMDund in Proben von Patienten mit verschiedenen Genotypen Ursprung um das Verständnis der molekularen Pathologie von AMD zu verbessern. Bereits die hier beschriebene Technik wurde verwendet, um FHL-1 erfolgreich zu identifizieren als die vorherrschende Ergänzung Regler in Membran 11 und weitere Studien Bruchs auf angereicherten Bruch-Membran sind wahrscheinlich in mehr neue Einblicke in die molekulare Pathologie von AMD führen.

Der Einsatz von post mortem menschliche Auge Gewebe in der Augenforschung ist eine unschätzbare Ressource für das Verständnis der Pathogenese Augenkrankheit. Analyse von menschlichen Spenderaugen hat wichtige Beiträge, um die Mechanismen zugrunde altersbedingten Makuladegeneration (AMD), die die Hauptursache für Erblindung in der westlichen Welt 1 anspruchsvollen gemacht. Weltweit entfallen AMD für rund 8,7% aller Blindheit und mit einer zunehmend alternden Bevölkerung wird vorhergesagt, bis 196 Millionen Menschen bis zum Jahr 2020 2. AMD führt zum Verlust des zentralen Sehvermögens beeinträchtigen und hat eine tief greifende Auswirkungen auf die Patienten Unabhängigkeit und Lebensqualität 3. Frühen AMD wird durch die Bildung von Drusen gekennzeichnet und es kann zu geographische Atrophie (manchmal als &quot;trockene&quot; AMD bezeichnet) oder CNV (auch als neovaskulären oder &quot;nasse&quot; AMD bezeichnet) fortschreiten. Während Anti-VEGF-Injektionen können stabilisieren oder Sehvermögen von neovaskulärer AMD es is nicht heilende und derzeit für geographische Atrophie existiert keine Behandlung. Während bestimmte genetische Varianten haben gezeigt, dass AMD Risiko 4 ändern - 8 wird weniger darüber, wie diese Varianten beeinflussen die Makula bei einer biochemischen Ebene bekannt. Ein wichtiger Standort in AMD Pathogenese ist der Bruch-Membran. Drusen Form innerhalb dieser Struktur und verschiedene Studien haben Beweise der Komplementaktivierung in und um Bruch-Membran in AMD 9 vorgesehen. Bruch-Membran ist ein Blatt von der extrazellulären Matrix, die die retinale Pigmentepithel (RPE) Zellen aus der Aderhaut trennt, und ist etwa 4 &amp; mgr; m dick. Bruch-Membran geht in die Aderhaut, einer Schicht aus der Aderhaut, die gefensterte Kapillaren und extern zu diesem enthält, sind Schichten mit größeren Blutgefäße 10 (Figur 1A). Bruch-Membran ist ein pentilaminar Blatt Extrazellulären Matrix (ECM), und diese Methode beschreibt, wie der Bruch-Membran zu isolieren, zusammen mit der ECM der zugrunde liegenden Choriokapillaris (nachfolgend bezeichnet Bruch-Membran angereichert), die weitgehend dezellularisierte und frei von roten Blutkörperchen ist. Enriched Bruch-Membran wurde dann für die Western-Blot und Histologie Experimente verwendet. Weiterhin Methode zur Anreicherung der Bruch-Membran allein aus der Makula Bereich des Auges beschrieben, die von besonderem Interesse für die Untersuchung der biochemischen Aspekte des AMD sein wird.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine führende Ursache für Sehbehinderung in der entwickelten Welt. Die Krankheit manifestiert sich durch die Zerstörung der Mitte der Retina, Makula genannt, was zum Verlust der zentralen Sehschärfe. Frühen AMD ist durch die Anwesenheit von kleinen, gelblichen Läsionen genannt weiche Drusen, dass der Fortschritt auf späten AMD wie geographische Atrophie (trockene AMD) oder Gefäßneubildung (feuchte AMD) gekennzeichnet. Obwohl die klinischen Veränderungen sind gut beschrieben, und das Verständnis der genetischen Einflüsse auf verleiht AMD Risiko werden immer detaillierter, ist ein Bereich, fehlen wichtige Fortschritte das Verständnis der biochemischen Auswirkungen der genetischen Risiko. Dies ist teilweise auf Grund von Schwierigkeiten beim Verständnis der Biochemie der Bruch-Membran, einer sehr dünnen extrazellulären Matrix, als biologischer Filter von Material von der Durchblutung und ein Gerüst, auf dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellmonoschicht liegt dient. Drusen form im Bruch-Membran und ihre Anwesenheit stört Nährstofffluss in den RPE-Zellen. Nur durch die Untersuchung der Proteinzusammensetzung der Bruch-Membran, und in der Tat, wie andere Proteine ​​mit ihm interagieren, können die Forscher hoffen, dass die biochemischen Mechanismen zugrunde Drusen Bildung, Entwicklung von AMD und anschließende Verlust der Sehkraft zu entwirren. Dieses Papier Details Methoden zur Anreicherung von entweder ganzen Bruch-Membran, oder einfach von der Makula Region, so dass es für nachfolgende biochemische Analyse verwendet werden, und Beispiele dafür, wie diese ändert sich bereits das Verständnis der Bruch-Membran Biochemie.

Das oben beschriebene Protokoll zur Membran Ergebnisse Bruchs bereichert in der Isolierung des Bruch-Membran, der ECM des Choriokapillaris produzieren und entfernt die meisten der Zellen / Zelltrümmer einschließlich all des RPE (Abbildung 2). Das Waschen der angereicherten Bruch-Membran in Wasser ist ein wichtiger Schritt in Lyse alle verbleibenden Aderhautzellen. Die während der Verschrottung der Aderhaut ausgeübte Druck scheint eine der wenigen verbliebenen Zellkerne in den definiert als Bruch-Membran (2B) Region verdichten. Die Solubilisierung von angereichertem Bruch-Membran ermöglicht die nachgeschaltete Analyse der Proteingehalt. Die Trennung von Proteinbanden von solubilisierten angereichert Bruch-Membran unter Verwendung einer 4-12% -Gradienten-SDS-PAGE-Gel, während nicht nützlich in seinem eigenen Recht um den Proteingehalt zu ermitteln, tut zeigen die Fähigkeit dieser Technik, um verunreinigende Proteine, Blut ar minimierene unspezifisch gebundene (3B). In dieser Hinsicht ist eine bemerkenswerte Brief aus dem Proteingel Lauf ist eine beträchtliche Gruppe von Humanserumalbumin (~ 66 kDa), die sonst machen können anschließenden Western-Blot schwieriger zu interpretieren: Die histologische Analyse von angereichertem Bruch-Membran in Abbildung 2 auch Stützen Dies. Tatsächlich als Teil des Arbeits zuvor beschriebenen 11, solubilisiert Bruch-Membran aus einer Serie von einzelnen Spendern wurden für eine Reihe von Proteinen mit spezifischen Antikörpern mittels Western Blot (Figur 3C) sondiert. In dem hier gezeigten Fall ein Antikörper (bezeichnet OX23) 12 gegen ein 155 kDa Regulator der angeborenen Immunität gerichtet, genannt Komplementfaktor H (FH), verwendet wurde, und zeigte die Anwesenheit eines unteren molekulare Bande in der Bruch-Membran-Proben von drei getrennten Spender (3C). Diese anschließend stellte sich heraus, Faktor H-like protein 1 sein (FHL-1)Der 49 kDa-Proteins an FH ergeben und von einem Spleiß Variation des gleichen Gens 13. FHL-1 scheint in der Bruch-Membran 11 die Haupt vorliegenden Ergänzung Regler sein. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Abbildung 1. Dissection des menschlichen Auges und Anreicherung der Bruch-Membran. (A) Bruch-Membran ist eine extrazelluläre Matrix-Schranke. Die Aderhaut enthält eine Schicht aus gefensterten Kapillaren, die kontinuierlich in der Bruch-Membran verschmelzen (das so genannte Choriokapillaris) und diese zu trennen den Rest der Aderhaut (die großen Blutgefäße) aus dem retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellschicht, die physiologisch unterstützt die Photorezeptorzellen der neurosensorischen Netzhaut (NSR). (B) Vier Einschnitte in den menschlichen Augenmuschel gemacht so dass sie geöffnet werden, um eine flache Halterung zu schaffen. DasGlaskörper können bei der Verwendung von Pinzetten entfernt werden. Der NSR kann off zusammen mit dem Glaskörper, sind aber auch mit einer Pinzette entfernt werden. Einem Zellschaber verwendet, um die RPE-Zellschicht von Bruch-Membran zu entfernen, während es noch an der Aderhaut und der Sklera verankert. Der Bruch-Membran / Choroidea Komplex kann von der Lederhaut abgeschält werden und mit einer neuen Zellschaber kann die äußere Choroidea entfernt werden. Eine letzte Waschung in ultrareinem Wasser lysiert restliche Zellmaterial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Abbildung 2. Histologie der Bruch-Membran und der Aderhaut. H &amp; E-gefärbten Schnitten vor (A) und nach (B) Abschaben der äußeren Aderhautstrukturen aus Bruch-Membran und Waschen in ultrareinem water angereichert Bruch-Membran zu erzeugen. Skalenbalken stellen 20 &amp; mgr; m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Abbildung 3 Solubilisierung Enriched Bruch-Membran für Protein Content Analysis. (A) Protein kann aus angereichertem Bruch-Membran durch Inkubation in 8 M Harnstoff für 6 h bei RT extrahiert werden, bevor sie gegen PBS dialysiert. Für Western-Analyse, können Proteine, die aus der ganzen Bruch-Membran Dialysat mit Proteinisolierung Perlen isoliert und eluiert durch Kochen mit Laemmli-reduzierendem Probenladepuffer. (B) Ein Vertreter Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gel, das sowohl saubere und verwässert Bruch-Membran solubilisiert (BM) mit der Methode d. in (A) escribed (C) Eine repräsentative Western Blot von solubilisiert Bruch-Membran aus 3 einzelnen Spendern (Spuren 1-3). für Faktor H-like protein 1 (FHL-1) sondiert <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehen diese Figur.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figur 4. Isolierung von angereichertem Bruch-Membran von der Makula. Die Makula Bereich der Netzhaut ist ein 5 mm-Bereich, die sich leicht durch die Gelbfärbung der überlagernden Fovea identifiziert werden kann, und die Nähe zu der benachbarten Papille. Unter Verwendung der Fovea als Leitfaden, legen Sie ein 6 mm Biopsie-Stanze auf der flachen montiert menschliche Auge, um eine 6 mm Makula Gewebeblock herauszuschneiden. Entfernen Sie die darüberliegenden NSR und abkratzen RPE-Zellen aus dem herausgeschnittenen Makula. Die übrigen Bruch-Membran / Aderhaut-Komplex kann dien von der Lederhaut schälen und gründlich abgekratzt, um Aderhaut zu entfernen, lysieren restlichen Zellmaterial durch Eintauchen in ultrareines Wasser. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Enrichment of Bruch&#039;s Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Bereicherung der Bruch-Membran von menschlichen Spender Augen

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Neuroscience

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

11.9K Aufrufe.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.