Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Isaac Zambrano e il personale della Eye Hospital Banca degli Occhi di Manchester per la fornitura di tessuti dell&#39;occhio donatore umano, e il signor Pete Walker della Facoltà di Scienze della Vita Istologia impianto per le immagini H &amp; E macchiato. Un ringraziamento speciale va a Roger Meadows per il suo aiuto con il microscopio. SJC è destinatario di un Medical Research Council (MRC) Career Development Fellowship (MR / K024418 / 1) e gli autori anche riconoscere altre recenti finanziamenti alla ricerca da MRC (G0900538 e K004441), Lotta per Sight (1866) e The maculare Society.

Tessuto Occhio umano consentito per scopi di ricerca è stato ottenuto dal Manchester Royal Eye Hospital Banca degli Occhi in seguito alla rimozione della cornea per il trapianto. L&#39;uso di tessuti umani per la ricerca è stato in conformità con la legge Human Tissue (2004) le linee guida, e con l&#39;approvazione University Research Comitato Etico (riferimento 11305). 1. Arricchimento della membrana di Whole Bruch <ol><li> Pulire l&#39;area di lavoro attorno e sotto il microscopio da dissezione con 1% disinfettante (v / v) e poi pulire con 70% (v / v) di etanolo. </li><li> Assicurarsi che i seguenti sono a portata di mano: un nuovo bisturi monouso, due raschietti sterili cellulari (comunemente utilizzati nella coltura del tessuto) e tre paia di pinzette (qui indicati come A, B, e C, si veda la lista dei materiali). </li><li> Posizionare il globo occhio in un usa e getta piastra di Petri, mantenendo il coperchio per un uso successivo. Utilizzando un nuovo bisturi monouso, rimuovere ogni residuo del nervo ottico, che possono interferire con la creazione di un mo pianount del tessuto. Avanti, fare quattro incisioni ugualmente distanziate per creare quattro quadranti, se procedere alla parte 3 (arricchimento della membrana maculare di Bruch) non tagliare attraverso la regione macula. <ol><li> Assicurarsi che le incisioni si estendono attraverso l&#39;intera profondità del tessuto oculare - dalla retina neurosensoriale più interno (NSR), attraverso la coroide e sclera (bianco dell&#39;occhio). Continuare l&#39;incisione tutto il giro l&#39;occhio dal margine della conchiglia oculare al nervo ottico. Questo permetterà l&#39;oculare di essere appiattito (vedi Figura 1B). </li></ol></li><li> Tenendo un quadrante della conchiglia oculare appiattita con pinzetta A (per evitare il distacco della coroide), utilizzare la pinzetta grande B per afferrare la NSR vitreo e di fondo e tirare questo tessuto dalla epitelio pigmentato retinico (RPE) a partire alla periferia, si muove verso il centro della conchiglia oculare aperto e poi verso il lato opposto. Di solito, ma non sempre sia vitreo e NSR staccare come uno. Utilizzare il Scalpel per asportare qualsiasi NSR residua ancorata al disco ottico. </li><li> Anche in questo caso, pur tenendo un quadrante di tessuto in posizione utilizzando pinzette A, utilizzare il raschietto cella sterile per rimuovere delicatamente il monostrato RPE da tutta la superficie interna della conchiglia oculare. Queste cellule si staccano facilmente e può essere visto macchie marrone-pigmentate scure. Risciacquare con PBS per lavare delicatamente le cellule RPE via sloggiato dalla oculare. </li><li> Successivamente, utilizzare pinzette A alla buccia delicatamente la sovrastante scuro velina rossa (che comprende sia la membrana di Bruch e la coroide) da tutti e 4 i quadranti degli occhi. Collocare il tessuto asportato in un piatto pulito. </li><li> Utilizzando il bordo appiattito di un raschietto cellulare per tenere il tessuto asportato in luogo, utilizzare il secondo raschietto per raschiare delicatamente il tessuto. Girare il tessuto e ripetere, eliminando quanto più materiale in eccesso il più possibile. Infine, una membrana traslucida rimarrà: questa è la membrana di Bruch grossolanamente arricchito. L&#39;uso del microscopio da dissezione ad un minimo di 20 ingrandimenti èessenziale nel favorire la rimozione di coroide e arricchimento della membrana di Bruch. </li><li> Usando una pipetta Pasteur, sciacquare brevemente membrana di Bruch con acqua ultrapura per rimuovere coroide residuo e il sangue prima di mettere la membrana in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Sospendere la membrana di Bruch arricchito in circa 1 ml di acqua ultrapura e vortex brevemente (circa 15 sec) per aiutare lisare qualsiasi materia cellulare contaminante (vedi figura 2). Centrifugare il campione a 500 xg per 30 sec a pellet membrana e aspirare il sopranatante. Nota: membrana Il restante arricchito di Bruch è pronto per solubilizzazione (come descritto al punto 2 qui di seguito) o la conservazione a -80 ° C per un uso successivo. </li></ol> 2. solubilizzazione di membrana e Western Blot analisi di Whole Arricchita Bruch <ol><li> Estratto proteine ​​arricchito membrana di Bruch immergendo il tessuto in 500 microlitri 8 M urEA per 6 ore a temperatura ambiente in provette da 1,5 ml microcentrifuga (Figura 3A). </li><li> Centrifugare i campioni solubilizzato a 10.000 xg per 10 minuti a pellet qualsiasi questione extracellulare rimanente. Rimuovere il surnatante e trasferirlo a 3.500 Da MWCO membrana dialitica, quindi inserire il campione in 1 l di PBS per dialyse per 16 ore a 4 ° C. </li><li> Per ciascun campione, aggiungere 40 ml di perline isolamento proteine, e ruotare campione / miscela di sferette (20 rpm su un agitatore rotante) a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 5 minuti a pellet le perline. Rimuovere il surnatante e solubilizzare proteine ​​legate a microsfere in 30 microlitri 2x tampone di caricamento (65,8 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2,1% SDS, 26,3% (w / v) di glicerolo, 0,01% blu di bromofenolo, 3% β-mercaptoetanolo). </li><li> Incubare i campioni a 100 ° C per 10 minuti, quindi si centrifuga a 10.000 xg per 5 min a pellet rimanenti perline. </li><li> Caricare il surnatante contenente le proteine ​​rilasciate su un prefabbricato SDSGel pagina gradiente (vedi elenco dei materiali) per la separazione delle proteine. </li><li> Visualizza bande di proteine ​​separate mediante un protocollo di colorazione comune, ad esempio, Coomassie blu. <ol><li> In breve, aggiungere 20 ml di brillante macchia blu (0,1% blu brillante (w / v), 50% metanolo, 10% di acido acetico glaciale, 40% di acqua) al gel, e incubare per 30 min a temperatura ambiente con agitazione . </li><li> Eliminare la soluzione colorante e lavare il gel colorato con acqua deionizzata fino a quando la colorazione di fondo è sufficientemente ridotto per permettere la visualizzazione di banda proteine ​​colorato. </li><li> In alternativa, il trasferimento separato bande proteiche di nitrocellulosa per analisi Western, come descritto di seguito. </li></ol></li><li> Trasferimento separato bande proteiche su membrana di nitrocellulosa a 80 mA per 2,5 ore con dispositivo di trasferimento semisecco in tampone di trasferimento (Tris 25 mM, glicina 192 mM, 10% [v / v] metanolo). </li><li> Bloccare la membrana in 10 ml di PBS, 10% (w / v) di latte, e 0,02% (w / v) BSA per 16 ore a 4 ° C prima di the aggiunta di anticorpi primari desiderate per il rilevamento di proteine. Nota: Come esempio, la Figura 3C mostra una immunoblot rappresentante di solubilizzato membrana di Bruch da tre donatori separati sondato per un regolatore della cascata del complemento, fattore H-like protein 1 (FHL-1). </li></ol> 3. Arricchimento della membrana di Bruch maculare <ol><li> Seguire i passaggi 1,1-1,3 come descritto in precedenza. </li><li> Mentre la NSR è ancora in vigore, individuare il foveale colorazione gialla che rappresenta la regione macula centrale (vedere Figura 4). Utilizzando uno sterile 6 millimetri biopsia, posizionarlo sopra la regione foveale e saldamente tagliato a alla macula. <ol><li> Mantenere la biopsia in posto, praticare un&#39;incisione separata con un bisturi dal bordo della conchiglia oculare al bordo della lama biopsia, e quindi utilizzando pinzette B, sbucciare via il materiale circostante occhio per ottenere una biopsia pulito. </li></ol></li><li> Usando pinzette C, rimuovereil disco 6 millimetri di tessuto dal punzone e posto sul coperchio pulito capsula di Petri. Mettere il coperchio capsula di Petri e pugno maculare sotto il microscopio da dissezione. </li><li> Rimuovere il disco NSR sottile (controllare per il giallo della fovea colorazione dedurre accuratezza della biopsia). Utilizzare un raschietto cellulare sterile per rimuovere delicatamente le cellule RPE. </li><li> Fissare il disco maculare tramite la sclera con la punta delle pinzette A, e sbucciare lentamente al largo della coroide e complesso membrana di Bruch con pinzette C. Anche in questo caso, utilizzare il raschietto cella per rimuovere coroide indesiderati e la materia sangue dalla membrana di Bruch. </li><li> Posizionare la membrana di Bruch maculare in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e sospendere in 1 ml di acqua ultrapura. Vortex brevemente (circa 15 secondi) per aiutare lisare qualsiasi materia cellulare contaminante. Centrifugare il campione a 500 xg per 30 sec a pellet membrana e aspirare il sopranatante. Nota: La membrana di Bruch arricchita isolato dal macula può ora essere utilizzato per una proteomicaANALISI utilizzando protocolli di digestione preferite dall&#39;utente. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Qui si descrive l&#39;arricchimento della membrana di Bruch per ulteriori analisi che consente analisi successive tra cui western blotting 11, spettrometria di massa e le proprietà di diffusione della membrana di Bruch utilizzando modificata Ussing camere di 11,14. Passaggi critici comprendono a) la raschiatura accurata e lavaggio della superficie interna dell&#39;occhio per rimuovere tutte le cellule RPE b) la raschiatura ripetuta e accurata della coroide sottostante senza causare del Bruch a disintegrarsi e c) lavaggio della Bruch asportato del in acqua ultrapura per assicurare la lisi delle cellule residue. Inoltre, se la membrana di Bruch arricchito deve essere utilizzato per l&#39;analisi proteomica, estrazione di proteine ​​mediante trattamento urea è il più efficace per abbattere questo tessuto resistente rispetto ad altri metodi quali l&#39;omogeneizzazione meccanica. Istologia di membrana arricchito di Bruch indica l&#39;ECM del coriocapillare non viene rimosso. Questo deve essere expected come lo strato esterno della membrana di Bruch della pentilaminar è formato da choriocapillaris endoteliali membrane basali cellule. Infatti può essere vantaggioso che il ECM del choriocapillaris rimane come eseguite modifiche in questo AMD inclusa la deposizione di complesso complesso / attacco alla membrana complemento terminale (MAC) 15. Va notato che per dettagliata analisi istologica della membrana di Bruch, la sua struttura sarebbe meglio preservata se sezionato in presenza di sclera, coroide, e la membrana di Bruch. Infatti, l&#39;istologia illustrato nella figura 2 è destinato esclusivamente per dimostrare il grado di arricchimento derivante dalla tecnica descritta in questo manoscritto. Arricchimento di maculare Bruch di richiede un&#39;attenta dissezione del oculare, assicurando che la NSR e in particolare la fovea non siano danneggiati; altrimenti constatazione e pertanto l&#39;isolamento della macula non sono possibili. L&#39;integrità del tissuE &#39;anche importante a questo processo e si raccomanda pertanto di utilizzare campioni in 48 ore di tempo post mortem. Il grado di arricchimento richiesto varia fra i donatori e può essere influenzata dall&#39;età del donatore, tempo di post-mortem, e la presenza di eventuali patologie dell&#39;occhio. L&#39;uso del termine arricchito è intenzionale nel riconoscere una limitazione della tecnica, questo è che &#39;purificazione&#39; o &#39;isolamento&#39; della membrana di Bruch con questo metodo semplicemente non è possibile. Infatti, dato che l&#39;ECM del coriocapillare si fonde in membrana di Bruch ci completa separazione non è fattibile. Comprendere i cambiamenti biochimici dei rispettivi tessuti oculari è essenziale per comprendere la progressione della malattia degli occhi. Questo arricchimento unica della membrana di Bruch facilitare questa comprensione; studi in corso stanno studiando il proteoma di maculare arricchito membrana di Bruch con la spettrometria di massa in diverse fasi di AMDe in campioni provenienti da soggetti con diversi genotipi di migliorare la comprensione della patologia molecolare di AMD. Già la tecnica qui descritta è stata utilizzata per identificare con successo FHL-1 come regolatore complemento predominante nella membrana 11 e ulteriori studi di Bruch sulla membrana arricchito di Bruch sono suscettibili di tradursi in ulteriori nuove intuizioni della patologia molecolare del AMD.

L&#39;uso di post mortem tessuto oculare umano nella ricerca oftalmica è una risorsa inestimabile per la comprensione della patogenesi della malattia degli occhi. Analisi di occhi donatori umani è dato un contributo importante a discernere i meccanismi alla base età degenerazione maculare (AMD), che è la principale causa di cecità nel mondo occidentale 1. A livello globale, AMD rappresenta circa l&#39;8,7% dei casi di cecità e con un crescente invecchiamento della popolazione, si prevede che interessare 196 milioni di persone entro i risultati 2020 2. AMD nella perdita della visione centrale e ha un impatto profondo sulla indipendenza e la qualità della vita dei pazienti 3. Presto AMD è caratterizzata dalla formazione di drusen e può progredire ad atrofia geografica (a volte indicato come &#39;a secco&#39; AMD), o neovascolarizzazione coroidale (noto anche come neovascolare o &#39;bagnato&#39; AMD). Mentre anti-VEGF iniezioni possono stabilizzare o migliorare la visione in AMD neovascolare che iNon è curativo, e allo stato attuale, non esiste un trattamento per l&#39;atrofia geografica. Mentre alcune varianti genetiche hanno dimostrato di modificare AMD rischio 4-8, meno si sa su come queste varianti influenzano la macula a livello biochimico. Un sito importante nella patogenesi di AMD è membrana di Bruch. Modulo Drusen all&#39;interno di questa struttura e diversi studi hanno fornito la prova di attivazione del complemento in ed intorno a membrana di Bruch in AMD 9. Membrana di Bruch è un foglio di matrice extracellulare che separa le cellule della retina epiteliali del pigmento (RPE) dalla coroide, ed è di circa 4 micron di spessore. Membrana di Bruch fonde le coriocapillare, uno strato della coroide che contiene capillari finestrate ed esterni a questo sono strati contenenti vasi sanguigni più grandi 10 (Figura 1A). Membrana di Bruch è un foglio di pentilaminar supplementarematrice cellulare (ECM), e questa metodologia dettagli come isolare membrana di Bruch, insieme con la ECM delle choriocapillaris sottostanti (di seguito arricchito membrana di Bruch), che è in gran parte decellularized e privo di globuli rossi. Arricchita membrana di Bruch è stato poi utilizzato per asciugare e istologici esperimenti occidentali. Inoltre, la metodologia per arricchire membrana di Bruch esclusivamente dalla regione macula dell&#39;occhio è descritto, che saranno di particolare interesse per coloro indagare gli aspetti biochimici della AMD.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Età degenerazione maculare (AMD) è una delle principali cause di disabilità visiva nel mondo sviluppato. La malattia si manifesta con la distruzione del centro della retina, chiamata macula, con conseguente perdita della visione centrale. All&#39;inizio AMD è caratterizzato dalla presenza di piccole lesioni giallastri chiamati drusen morbido che può progredire sul ritardo AMD come atrofia geografica (asciugare AMD) o neovascolarizzazione (AMD bagnato). Anche se i cambiamenti clinici sono ben descritti, e la comprensione delle influenze genetiche sul conferimento rischio AMD stanno diventando sempre più dettagliata, un settore privo di importanti progressi è la comprensione delle conseguenze biochimiche di rischio genetico. Ciò è dovuto alla difficoltà di comprendere la biochimica della membrana di Bruch, una matrice extracellulare molto sottile che agisce come un filtro biologico di materiale dalla fornitura di sangue e un&#39;impalcatura su cui risiede la retina epiteliali del pigmento (RPE) monostrato cellulare. Drusen form all&#39;interno membrana di Bruch e la loro presenza interrompe il flusso di sostanze nutritive alle cellule RPE. Solo studiando la composizione proteica della membrana di Bruch, e infatti come altre proteine ​​interagiscono con esso, possono ricercatori sperano di svelare i meccanismi biochimici alla base formazione drusen, sviluppo di AMD e la conseguente perdita della vista. Dettagli Questo documento metodologie per arricchire o membrana di Bruch intero, o solo dalla regione macula, in modo che possa essere utilizzato per l&#39;analisi biochimica valle, e forniscono esempi di come questo sta già cambiando la comprensione della membrana biochimica del Bruch.

Il protocollo descritto in precedenza per la produzione di arricchisce risultati membrana di Bruch nell&#39;isolamento della membrana di Bruch, l&#39;ECM del coriocapillare e rimuove la maggior parte del / detriti cellulari cellule compresi tutti RPE (Figura 2). Il lavaggio della membrana di Bruch arricchito in acqua è un passo fondamentale nella lisi tutte le cellule della coroide rimanenti. La pressione esercitata durante la demolizione della coroide sembra compattare alcuni dei pochi nuclei delle cellule rimaste nella regione definita come membrana di Bruch (Figura 2B). La solubilizzazione delle membrane arricchito di Bruch consente l&#39;analisi a valle del suo contenuto proteico. La separazione delle bande proteiche da solubilizzato arricchito membrana di Bruch con un 4 - gradiente di gel SDS-PAGE 12%, mentre non utile a sé stante per identificare contenuto proteico, fa dimostrare la capacità di questa tecnica per minimizzare contaminanti proteine ​​del sangue che are non specificamente legato (Figura 3B). A questo proposito, una notevole assente dalla pista gel proteico è un gruppo consistente di albumina sierica umana (~ 66 kDa) che potrebbero altrimenti le successive Western Blotting più difficile interpretazione: l&#39;analisi istologica dei membrana arricchito di Bruch mostrato in figura 2 anche supporti questo. Infatti, come parte del lavoro descritto in precedenza 11, solubilizzato membrana di Bruch da una serie di singoli donatori sono stati sondati per un certo numero di proteine ​​utilizzando anticorpi specifici tramite Western blotting (Figura 3C). Nel caso illustrato, un anticorpo (chiamato OX23) 12 diretto contro un regolatore 155 kDa dell&#39;immunità innata, denominato fattore complemento H (FH), è stato utilizzato e dimostrato la presenza di una banda inferiore peso molecolare campioni di membrana di Bruch da tre distinte donatori (Figura 3C). Questo in seguito si è rivelata fattore H-like protein 1 (FHL-1), Una proteina di 49 kDa correlate a FH e derivanti da una variazione giunzione dello stesso gene 13. FHL-1 sembra essere il regolatore di complemento principale presente nella membrana di Bruch 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione del Occhio umano e arricchimento della membrana di Bruch. (A) membrana di Bruch è una barriera matrice extracellulare. La coroide contiene uno strato di capillari fenestrate che si fondono continuamente nella membrana di Bruch (chiamato coriocapillare) e questi separare il resto della coroide (contenente grandi vasi sanguigni) dal epitelio pigmentato retinico (RPE) monostrato cellulare, che supporta fisiologicamente le cellule visive della retina neurosensoriale (NSR). (B) Quattro incisioni nella oculare umano sono resi permettendo così di essere aperto per creare un supporto piano. Ilvetrosa può essere rimossa con l&#39;uso di pinzette. La NSR potrebbe staccarsi insieme vitreo ma può anche essere rimossa con una pinzetta. Un raschietto cella viene utilizzata per rimuovere lo strato di cellule RPE dalla membrana di Bruch mentre è ancora ancorata alla coroide e sclera. Complesso membrana / coroide del Bruch può essere staccato dalla sclera e utilizzando un nuovo raschietto cellulare, la coroide esterno può essere rimosso. Un lavaggio finale in acqua ultrapura lisa qualsiasi materia cellulare rimanenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Figura 2. Istologia di membrana di Bruch e le sezioni coroide. H &amp; E macchiato prima (A) e dopo (B) raschiando via le strutture della coroide esterna da membrana di Bruch e lavaggio in wa ultrapureter Per generare arricchito membrana di Bruch. Barre di scala rappresentano il 20 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Figura 3. solubilizzazione della membrana di Bruch arricchita per analisi delle proteine ​​contenuto. (A) Proteina può essere estratto dalla membrana arricchito di Bruch incubando a 8 M urea per 6 ore a temperatura ambiente, prima di essere dializzata contro PBS. Per l&#39;analisi occidentale, proteine ​​provenienti da tutta la membrana dializzato di Bruch possono essere isolate utilizzando perline di isolamento delle proteine ​​e eluiti facendo bollire con Laemmli riducendo tampone di carico. (B) Un rappresentante Coomassie blu macchiato SDS-PAGE gel, che mostra sia pulito e diluito solubilizzati membrana di Bruch (BM) utilizzando il metodo d. descritto nella (A) (C) Una macchia occidentale rappresentante solubilizzato membrana di Bruch da 3 donatori individuali (corsie 1-3). sondato per il fattore H-like protein 1 (FHL-1) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;isolamento della membrana di Bruch Arricchito dalla Macula. La regione macula della retina è una zona 5 mm che può essere facilmente identificata dalla colorazione gialla della fovea sovrastante, e la sua vicinanza al disco ottico adiacente. Utilizzando la fovea come guida, posizionare una biopsia 6 millimetri sull&#39;occhio umano montata piatta per asportare un blocco di tessuto macula 6 mm. Rimuovere la NSR sovrastante e raschiare le cellule RPE dal macula asportato. Complesso membrana / coroide Il restante del Bruch può iln essere sfogliato dalla sclera e accuratamente raschiato per rimuovere coroide, Lyse restante materiale cellulare da immersione in acqua ultrapura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Arricchimento della membrana di Bruch da occhi donatore umano

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

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Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Isolamento, di arricchimento e manutenzione delle cellule staminali Medulloblastoma

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Ricerca

Neuroscienze

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

Analisi quantitativa di Replenishment pool delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni granuli cerebellari utilizzando coloranti FM

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

Progenitore di derivazione Sistema Cultura Oligodendrocyte dal cervello umano fetale

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

La specifica di telencefalici neuroni glutamatergici di cellule staminali umane pluripotenti

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

Derivazione libero-Feeder della cresta neurale progenitrici Cellule pluripotenti da cellule staminali umane

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

Regia neuroni dopaminergici differenziazione da cellule staminali pluripotenti umane

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Derivazione delle Culture leptomeningi Explant da Postmortem cervello umano donatori

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sviluppo di un protocollo di raffinata per Trans-sclerale Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico umano negli occhi di topo

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dei capillari cerebrali da tessuto cerebrale umano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...