Yazarlar Dr. Isaac Zambrano ve insan donör göz dokusunda temini için Manchester Göz Hastanesi Göz Bankasında personel ve H &amp; E lekeli görüntüler için Yaşam Bilimleri Histoloji tesisin Fakültesi Mr. Pete Walker kabul etmek istiyorum. Özel teşekkür mikroskobu ile yaptığı yardım için Sayın Roger Meadows gider. SJC Tıbbi Araştırma Konseyi bir alıcı (MAM) Kariyer Geliştirme Bursu (MR / K024418 / 1) ve yazarlar da, MRC (G0900538 ve K004441) diğer son araştırma fonu kabul Sight (1866) ve Makula Toplum için savaşın.

Araştırma amaçlı razı İnsan gözü doku nakli için kornea çıkarılmasını takiben Manchester Kraliyet Göz Hastanesi Göz Bankası elde edilmiştir. Araştırma için insan dokusunun kullanılması İnsan Doku Yasası (2004) kurallarına uygun olarak yapıldı ve Üniversitesi Araştırma Etik Kurulu onayı ile (11305 referans). Tüm Bruch Membran 1. zenginleştirilmesi <ol><li> Yaklaşık çalışma alanını temizleyin ve% 1 dezenfektan ile mikroskop altında (h / h) ve daha sonra% 70 (hac / hac) etanol ile silin. </li><li> Emin olun el şunlardır: (A, B, ve C gibi burada listelenen malzemeler listesine bakınız) yeni bir tek kullanımlık neşter, (genellikle doku kültüründe kullanılan) iki steril hücre kazıyıcı ve cımbız üç çift. </li><li> Daha sonra kullanmak için kapağı koruyarak atılabilir petri kabına göz küresi yerleştirin. Yeni bir tek neşter kullanılarak, düz bir mo oluşturarak engel olabilir ki, herhangi bir kalıntı optik sinir kaldırmakdoku unt. Sonraki yapmak dört kesiler eşit kısım 3 (maküler Bruch membranı zenginleştirme) geçmeden makula bölgesi kesti yoksa, dört kadran oluşturmak için aralıklı. <ol><li> Içteki retinada (NSR) dan, koroid ve sklera (gözün beyaz) ile - kesiler göz dokusunun tüm derinliği boyunca uzanan emin olun. Insizyon optik sinir Göz yuvası kenarından göz yuvarlak tüm yol devam ediyor. Bu göz kapağı (Şekil 1B bakınız) dümdüz olmasını sağlayacaktır. </li></ol></li><li> Cımbız A kullanılarak düzleştirilmiş Göz yuvası bir kadranda Holding merkezine doğru hareket, (koroid dekolmanı önlemek için) kavrama büyük cımbız B vitreus ve altta yatan NSR kullanımı ve çevresinde başlayan uzakta retina pigment epiteli (RPE) Bu doku çekin açılmış Göz yuvası ve daha sonra karşı tarafa. Genellikle, ama her zaman vitreus ve NSR hem biri olarak ayırmak değil. Scalpe kullanınl optik disk demirlemiş herhangi bir kalıntı NSR tüketim için. </li><li> Yine, cımbız A kullanılarak yerine dokunun bir kadrana sahip iken yavaşça Göz yuvası tüm iç yüzeyinden RPE tek tabaka çıkarmak için steril hücre kazıyıcı kullanılır. Bu hücreler kolayca ayırmak ve koyu kahverengi pigmentli kümeleri görülebilir. Yavaşça Göz yuvası uzak yerinden RPE hücreleri yıkamak için PBS ile durulayın. </li><li> Sonra, yavaşça Tüm 4 göz kadranlardan (Bruch membranı ve koroid hem oluşan) üstte koyu kırmızı doku soyulmasına cımbız A kullanın. Temiz bir kabına kesilmiş doku yerleştirin. </li><li> Bir hücre kazıyıcı ve basık kenarını kullanarak, yerinde eksize doku tutun nazikçe doku kazımak için ikinci kazıyıcı kullanın. Mümkün olduğunca fazla malzemeyi kaldırarak, üzerinde doku çevirin ve tekrarlayın. Sonunda, saydam bir zar kalacaktır: Bu kabaca zenginleştirilmiş Bruch membranı olduğunu. 20X büyütme en az mikroskop kullanımıBruch membranı koroid ve zenginleştirme kaldırılmasını yardım gerekli. </li><li> Pasteur pipet kullanarak, kısaca 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içine zarı yerleştirmeden önce kalan koroid ve kan çıkarmak için ultra saf su ile Bruch membranı durulayın. </li><li> Herhangi bir bulaşık hücresel madde lize yardımcı olmak için yaklaşık 1 ml ultra saf su ve vorteks kısa bir süre (yaklaşık 15 saniye) &#39;den hazırlanmaktadır Bruch membran Askıya (bakınız Şekil 2). Membran pelet süpernatant aspire 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Not: daha sonra kullanılmak üzere -80 ° C ya da depolama (bölümünün altında 2&#39;de tarif edildiği gibi) geri kalan zenginleştirilmiş Bruch membranı çözündürme için hazırdır. </li></ol> Tüm Zenginleştirilmiş Bruch membran ve Western Blot Analizi 2. Çözündürülmesi <ol><li> 500 ul 8 M ur, dokuyu daldırılmasıyla zenginleştirilmiş Bruch zarının proteini ekstrakte1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri (Şekil 3A), oda sıcaklığında 6 saat boyunca ad. </li><li> 10 dakika boyunca 10.000 xg&#39;de Santrifüj çözünmüş örnekler kalan dışı konuyu pelet. Süpernatantı ve 3500 Da MWCO diyaliz membranına aktarmak ve ardından 4 ° C&#39;de 16 saat boyunca diyaliz PBS 1 L numuneyi. </li><li> Her numune için, protein izolasyon boncuk 40 ul ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında örnek / boncuk karışımı (bir döner karıştırıcıda 20 rpm) döner. </li><li> 5 dakika boyunca 10.000 x g&#39;de santrifüjleyin örnekleri boncuk: pelet. (A / h) gliserol a,% 0.01 bromofenol mavisi,% 3 β-mersaptoetanol (65.8 mM Tris-HCI, pH 6.8,% 2.1 SDS,% 26.3), 30 ul 2x numune yükleme tamponunda boncuklara bağlanan protein Süpernatantı ve çözünür. </li><li> 10 dakika boyunca 100 ° C&#39;de inkübe edin ve 5 dakika geri kalan boncuklar: pelet daha sonra 10,000 x g&#39;de santrifüjlenir. </li><li> Pre-cast için yayımlanan proteinleri içeren süpernatant yükleyin SDS-Protein ayrımı için sayfa gradyan jeli (malzeme listesine bakınız). </li><li> Örneğin, ortak bir boyama protokolü, Coomassie mavisi kullanılarak ayrılan protein bantları gözünüzde canlandırın. <ol><li> ((Ağ / hac),% 50 metanol,% 10 glasiyal asetik asit,% 40 su,% 0.1 parlak mavi), jel ve hafif çalkalama ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Kısaca, parlak mavi leke 20 ml ilave inkübe . </li><li> Boyama solüsyonu atın ve arka plan renklenmesi yeterli bir boyanmış protein bantını görselleştirme izin inene kadar deiyonize su ile boyanmış jel yıkayın. </li><li> Aşağıda tarif edildiği gibi Alternatif olarak, aktarma, batı analizi için nitroselüloza protein bandını ayrıldı. </li></ol></li><li> Aktarım transfer tampon maddesi içinde yarı kuru transfer cihazı (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 10 [hacim / hacim] metanol) kullanılarak 2,5 saat süre ile 80 mA nitroselüloz zar üzerine protein bantları ayrıldı. </li><li> 10 ml PBS,% 10 zarı bloke th öncesinde 4 ° C&#39;de 16 saat boyunca süt ve% 0.02 (ağırlık / hacim) BSA (w / v)Protein tespiti için istenen birincil antikor e eklenmesi. Not: Burada bir örnek olarak, Şekil 3C, komplement kaskadı, faktör H-benzeri protein 1 (FHL-1) &#39;in bir regülatör problanmış üç ayrı donörlerden çözündürüldü Bruch zarının temsili bir immüno-gösterir. </li></ol> 3. Zenginleştirme Makula Bruch Membran <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi 1,3 - 1,1 adımları izleyin. </li><li> NSR hala yerinde iken, merkezi makula bölgesi (Şekil 4) temsil sarı fovea colouration bulun. Steril 6 mm biyopsi yumruk kullanarak, fovea üzerine yerleştirin ve sıkıca makulaya kesilmiş. <ol><li> Yerinde biyopsi yumruk tutulması, temiz bir biyopsi elde etmek için çevredeki göz malzemesini uzak soyma, biyopsi yumruk bıçak kenarına Göz yuvası kenarından bir neşter ile ayrı bir kesi yapmak ve sonra cımbız B&#39;yi kullanarak. </li></ol></li><li> Cımbız C kullanarak, kaldırmakTemiz petri kapağındaki yumruk ve yerden doku 6 mm disk. Diseksiyon mikroskobu altında petri kapağı ve maküler yumruk yerleştirin. </li><li> (Biyopsi doğruluğunu anlaması için sarı fovea boyama kontrol edin) ince NSR diskini çıkarın. Yavaşça RPE hücreleri çıkarmak için steril hücre kazıyıcı kullanın. </li><li> Cımbız A ipuçlarını kullanarak sklera yoluyla makula diski Güvenli ve yavaş yavaş koroid ve cımbız C. Yine kullanarak Bruch membranı kompleksi soyulabilir, Bruch zarının istenmeyen koroid ve kan madde kaldırmak için hücre kazıyıcı kullanın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine makula Bruch membranı yerleştirin ve 1 ml ultra saf suda askıya. Vortex kısaca (yaklaşık 15 saniye) herhangi kirletici hücresel konuyu lyse yardımcı olur. Membran pelet süpernatant aspire 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. Not: makula izole zenginleştirilmiş Bruch membranı şimdi proteomik An için kullanılabiliralysis kullanıcının tercih ettiği sindirim protokollerini kullanarak. </li></ol>

<ol>
	<li>Coleman, H. R., Chan, C. -. C., Ferris, F. L., Chew, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration.">Age-related macular degeneration.</a> Lancet. 372, 1835-1845 (2008).</li><li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: A systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Glob Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li><li>Coleman, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+age-related+macular+degeneration+on+vision-specific+quality+of+life:+Follow-up+from+the+10-year+and+15-year+visits+of+the+study+of+osteoporotic+fractures.">Impact of age-related macular degeneration on vision-specific quality of life: Follow-up from the 10-year and 15-year visits of the study of osteoporotic fractures.</a> Am J Ophthalmol. 150 (5), 683-691 (2010).</li><li>Hageman, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+haplotype+in+the+complement+regulatory+gene+factor+H+(HF1/CFH)+predisposes+individuals+to+age-related+macular+degeneration.">A common haplotype in the complement regulatory gene factor H (HF1/CFH) predisposes individuals to age-related macular degeneration.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (20), 7227-7232 (2005).</li><li>Klein, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+in+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism in age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 385-389 (2005).</li><li>Haines, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+variant+increases+the+risk+of+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H variant increases the risk of age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 419-421 (2005).</li><li>Edwards, A. O., Ritter, R., Abel, K. J., Manning, A., Panhuysen, C., Farrer, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complement+factor+H+polymorphism+and+age-related+macular+degeneration.">Complement factor H polymorphism and age-related macular degeneration.</a> Science. 308 (5720), 421-424 (2005).</li><li>Fritsche, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+new+loci+associated+with+age-related+macular+degeneration.">Seven new loci associated with age-related macular degeneration.</a> Nat Genet. 45 (4), 433-439 (2013).</li><li>Clark, S., Bishop, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Factor+H+and+Related+Proteins+in+Regulating+Complement+Activation+in+the+Macula,+and+Relevance+to+Age-Related+Macular+Degeneration.">Role of Factor H and Related Proteins in Regulating Complement Activation in the Macula, and Relevance to Age-Related Macular Degeneration.</a> J Clin Med. 4 (1), 18-31 (2014).</li><li>Booij, J. C., Baas, D. C., Beisekeeva, J., Gorgels, T. G. M. F., Bergen, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+Bruch&#8217;s+membrane.">The dynamic nature of Bruch&#8217;s membrane.</a> Prog Retin Eye Res. 29 (1), 1-18 (2010).</li><li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+factor+H-like+protein+1+as+the+predominant+complement+regulator+in+Bruch&#8217;s+membrane:+implications+for+age-related+macular+degeneration.">Identification of factor H-like protein 1 as the predominant complement regulator in Bruch&#8217;s membrane: implications for age-related macular degeneration.</a> J Immunol. 193 (10), 4962-4970 (2014).</li><li>Sim, E., Palmer, M. S., Puklavec, M., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+the+complement+control+protein+factor+H+(beta+1+H).">Monoclonal antibodies against the complement control protein factor H (beta 1 H).</a> Biosci Rep. 3 (12), 1119-1131 (1983).</li><li>Ripoche, J., Day, A. J., Harris, T. J., Sim, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+amino+acid+sequence+of+human+complement+factor+H.">The complete amino acid sequence of human complement factor H.</a> Biochem J. 249 (2), 593-602 (1988).</li><li>Moore, D. J., Clover, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+age+on+the+macromolecular+permeability+of+human+Bruch&#8217;s+membrane.">The effect of age on the macromolecular permeability of human Bruch&#8217;s membrane.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. I. 42 (12), 2970-2975 (2001).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Mol Immunol. 67 (1), 43-50 (2015).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Burada daha ayrıntılı bir şekilde analizi, batı lekeleme 11, kütle spektrometrisi ve kullanılarak tadil odaları 11,14 Ussing Bruch zarının difüzyon özellikleri dahil olmak üzere sonraki analizler izin vermek için Bruch zarının zenginleştirme tarif eder. Kritik adımlar a) gözün iç yüzeyinin tam bir kazıma ve yıkama Bruch en dağılmasına neden olmayan tüm RPE hücreleri b) altta yatan koroid tekrarlanan ve dikkatli kazıma kaldırmak ve ultra saf su içinde çıkarıldı Bruch en c) yıkanması bulunmaktadır artık hücrelerin parçalanma sağlamak. Zenginleştirilmiş Bruch membranı proteomik analiz için kullanılacak ise Dahası, üre tedavisi ile protein çıkarma gibi mekanik homojenleştirme gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında bu esnek doku kırılmasında en etkin yöntemdir. Zenginleştirilmiş Bruch membran Histoloji koriokapillaris ECM kaldırılmaz gösterir. Bu eski olmaktırpentilaminar Bruch zarının tabaka olarak beklenmeyen koryokapillaris endotelyal hücre temel zarların tarafından oluşturulmaktadır. Gerçekten de değişiklik terminali kompleman kompleksi / membran saldırısı kompleksi (MAC) 15 birikimini içeren AMD bu meydana gibi koroid ECM kalmasını avantajlı olabilir. Bu sklera, koroid ve Bruch zarının mevcudiyetinde kesit halinde Bruch zarının ayrıntılı histolojik analiz için, yapısı daha iyi korunur olacağını belirtmek gerekir. Gerçekten de, Şekil 2 de histoloji yalnızca bu makalede açıklanan teknikle elde edilen takviye derecesinin göstermek için tasarlanmıştır. Maküler Bruch en zenginleştirme NSR ve özellikle fovea zarar görmezler sağlanması, Göz yuvası dikkatli diseksiyon gerektirir; Aksi takdirde kimlik ve makula dolayısıyla tecrit mümkün değildir. Tissu&#39;nun bütünlüğüe de bu süreçte önemli olduğunu ve bu nedenle 48 saat otopsi zaman altında numuneler kullanılması tavsiye edilir. Gerekli zenginleştirme derecesi bağışçılar arasında değişir ve donör yaşı, postmortem zaman ve herhangi bir göz patolojisi varlığı ile etkilenebilir. Zenginleştirilmiş terimin kullanılması, bu &#39;arıtma&#39; ya da bu yöntemi kullanarak Bruch membranı &#39;tecrit&#39; sadece mümkün olmadığını varlık, teknik bir sınırlama kabul kasıtlı olduğunu. Nitekim, koriokapillaris ECM Bruch zarı içine birleştirir verilen orada tam ayrılık mümkün değildir. İlgili oküler dokularda biyokimyasal değişiklikler anlamak göz hastalığı ilerlemesini anlamak esastır. Bruch membranı Bu benzersiz zenginleştirme bu anlayışı kolaylaştırmaktadır; Devam eden çalışmalar AMD farklı aşamalarında kütle spektrometresi kullanılarak zenginleştirilmiş makula Bruch membranı Proteomun araştırıyorve farklı genotipleri olan kişilerde kaynaklanan örneklerinde AMD moleküler patolojinin anlayışı geliştirmek. Zaten burada açıklanan teknik başarıyla zenginleştirilmiş Bruch zarı üzerinde Bruch membranı 11 ve ileri çalışmalar baskın tamamlayıcısı düzenleyici olarak FHL-1 tanımlamak için kullanılır olmuştur AMD moleküler patoloji içine daha yeni anlayışlar sonuçlanması muhtemeldir.

Oftalmik araştırmalarda ölüm sonrası insan gözü dokusunun kullanılması göz hastalığı patogenezinde anlaşılması için paha biçilemez bir kaynaktır. Insan donör gözlerin Analizi batı dünyasında 1 körlüğün önde gelen nedenidir yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), destekleyen mekanizmaların sezmek için önemli katkılarda bulunmuştur. Küresel olarak, AMD tüm körlük yaklaşık% 8.7 hesapları ve giderek yaşlanan nüfus ile, bu merkezi görme kaybı 2020 2. AMD sonuçları 196 milyon kişiyi etkilediği tahmin ediliyor ve hasta bağımsızlık ve yaşam kalitesi üzerinde derin bir etkisi vardır 3. Erken AMD drusen oluşumu ile karakterizedir ve (aynı zamanda neovasküler veya &#39;ıslak&#39; AMD olarak anılacaktır) (bazen &#39;kuru&#39; AMD olarak anılacaktır), coğrafi atrofi, ya da koroid neovaskülarizasyon ilerleyebilir. Anti-VEGF iken enjeksiyonlar stabilize veya neovasküler AMD i vizyon geliştirmekküratif değil ve şu anda hiçbir tedavi coğrafi atrofi için var. Bazı genetik varyantlar AMD riskini 4 değiştirmek gösterilmiştir iken - 8, daha az bu varyantlar bir biyokimyasal düzeyde makula nasıl etkilediği hakkında bilinmektedir. AMD patogenezinde önemli bir yer Bruch membranı olduğunu. Bu yapı ve çeşitli çalışmalarda druzeni formu ve AMD 9 Bruch zarı çevresinde kompleman aktivasyon kanıtlar sağlamıştır. Bruch membranı koroid retina pigment epitelyal (RPE) hücreleri ayıran hücre dışı matrisin bir tabakadır ve yaklaşık 4 um kalınlığındadır. Bruch membranı koriokapillaris birleştirir, fenestralı kılcal ve bu harici içeren koroid tabakası büyük kan damarlarına 10 (Şekil 1A) içeren tabakalar vardır. Bruch membranı ekstra bir pentilaminar tabakasıdırhücresel matris (ECM) ve bu metodoloji kırmızı kan hücreleri büyük ölçüde decellularized ve ücretsiz olan (bundan sonra Bruch membranı zenginleştirilmiş anılacaktır) altında yatan koriokapillaris ECM birlikte Bruch membranı izole etmek için nasıl ayrıntıları. Zenginleştirilmiş Bruch Zar daha sonra, batı lekeleme ve histoloji deneyleri için kullanılmıştır. Ayrıca, gözün makula bölgesinden sadece Bruch membranı zenginleştirmek için metodoloji tarif edilir, AMD biyokimyasal yönlerini inceleyen kişilere özel ilgi olacak.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Auxillary objective 0.5x</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>3638</td>
			<td>Useful (but not essential) for lower magnification imaging of whole eye flat-mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch 6mm</td>
			<td>Oncall Medical Supplies</td>
			<td>SCH-33-36</td>
			<td>6mm Biopsy Punches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A3059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell scrapers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td>For membrane enrichment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CyroPure Cyrovials</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.38</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12387999</td>
			<td>Sterile, individually wrapped Swann-Morton scalpels.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Gooseneck LED spot lights on 30cm arms</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>0153</td>
			<td>Flexible light source essential for dissection and imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>Used to prevent macula drying out and during membrane enrichment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(A) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4280</td>
			<td>(A) Fine (100mm) and straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(B) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4272</td>
			<td>(B) Broad and blunt (150mm). Useful for lifting large portions of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(C) Forceps</td>
			<td>Scientific Laboratory Supplies</td>
			<td>INS4323</td>
			<td>(C) Straight fine points</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>G1345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GXCAM 5 digital colour camera &#38; GT-Vision software</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>1122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>M/4000/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose membrane</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Sterilin</td>
			<td>101VR20</td>
			<td>90mm, used as a dish for samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein isolation beads (Strataclean resin)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>400714-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-0301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereozoom microscope GXMXTL3T (magnification range 7x-45x)</td>
			<td>GT-Vision Ltd</td>
			<td>5595</td>
			<td>Stereozoom microscope attached to boom stand for ease of use during dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enrichment of bruch's membrane from human donor eyes

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), gelişmiş ülkelerde görme kaybının önde gelen nedenidir. Hastalık merkezi görme kaybına neden makula denilen retina merkezinin imha kendini gösterir. Erken AMD gibi coğrafi atrofi (AMD kurutmak) ya da neovaskülarizasyon (ıslak AMD) gibi geç AMD üzerine ilerleyebilir yumuşak druzen denilen küçük, sarımsı lezyonların varlığı ile karakterizedir. Klinik değişiklikler de tarif edilmiştir ve AMD riskini veren genetik etkilerin anlaşılması her zamankinden daha detaylı alıyorsanız rağmen, büyük bir ilerleme yoksun bir alan genetik risk biyokimyasal sonuçları bir anlayıştır. Bu Bruch zarının, kan kaynağından malzemenin biyolojik bir filtre ve retina pigment epitelyal (RPE) hücre tekli-tabakası üzerinde bulunduğu bir iskele olarak hareket eden bir çok ince hücre dışı matrisin biyokimya anlama zorluklar kısmen. Drusen fBruch membran ve onların varlığı içinde orm RPE hücreleri besin akışını bozar. Yalnızca diğer proteinler ile etkileşim nasıl gerçekten Bruch membran protein bileşiminin araştırılması ve tarafından, araştırmacılar drusen oluşumunu gelişimini AMD ve sonraki görme kaybı destekleyen biyokimyasal mekanizmaları açıklığa kavuşturabilmek için umut olabilir. Bu kağıdı aşağı biyokimyasal analiz için kullanılan ve bu zaten Bruch membranı biyokimya anlayış değişiyor nasıl örnekler sağlamak, böylece, bütün Bruch membranı, ya da sadece makula bölgesinden ya zenginleştiren metodolojileri ayrıntıları.

Yukarıda açıklanan protokol Bruch membran koriokapillaris ECM izolasyonunda Bruch membranı sonuçlarını zenginleştirilmiş ve RPE dahil olmak üzere tüm hücre / hücre enkaz (Şekil 2) en kaldırır üretmek için. Suda zenginleştirilmiş Bruch membran yıkama kalan koroid hücrelerini parçalayan önemli bir adımdır. Koroid hurdaya sırasında uygulanan basınç Bruch zarının (Şekil 2B) gibi tanımlanmıştır bölgeye birkaç kalan hücre çekirdeklerinin bazıları sıkıştırmak görünmektedir. Zenginleştirilmiş Bruch zarının çözülebilirliği olan protein içeriğinin alt analizini sağlar. 4 kullanarak Bruch membranı zenginleştirilmiş çözünmüş protein bantlarının ayrılması - protein içeriğini tespit etmek kendi başına iken kullanışlı değil% 12 gradyan SDS-PAGE jel, ar kirletici kan proteinleri en aza indirmek için bu tekniğin yeteneğini göstermek yoke spesifik olmayan bağlanma (Şekil 3B). Zenginleştirilmiş Bruch zarının histolojik analizi, Şekil 2 de gösterilen, aynı zamanda destekler: Bu bağlamda, protein jel çalışmadan elde edilen bir önemli devamsız insan serum albumini oldukça büyük bir bant daha sonra başka bir Batı yorumlamak daha zordur blot yapabilir (~ 66 kDa) bir bu. Iş parçası daha önce tarif edildiği gibi 11 Gerçekten de, tek tek donorlarının bir dizi Bruch membranı western lekeleme (Şekil 3C) üzerinden özel antikorlar kullanılarak bir dizi protein için problanmıştır çözündürüldü. Burada gösterilen durumda, (OX23 olarak adlandırılır) bir antikor olarak 12 olarak adlandırılan tamamlayıcı faktör H (FH), kullanılan, doğal bağışıklık bir 155 kDa regülatör karşı yönlendirilen ve ayrı üç ila Bruch membran örnekleri, daha düşük bir molekül ağırlığı bandı varlığını göstermiştir donörler (Şekil 3C). Bu, daha sonra faktör H-benzeri protein 1 olduğu ortaya çıktı (FHL-1)Bir 49 kDa proteini FH ilişkin ve aynı gen 13 bir bağlantı değişiminden kaynaklanan. FHL-1 Bruch zarının 11 ana kompleman düzenleyici mevcut olduğu görülmektedir. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53382/53382fig1.jpg" /> Bruch Membran İnsan Gözü ve Zenginleştirme Şekil 1. diseksiyonu. (A) Bruch membranı bir hücre dışı matris engeldir. Koroid (koryokapillaris denir) sürekli Bruch zarı içine birleştirme fenestralı kılcal damarların bir tabaka içerir ve bu fizyolojik fotoreseptör hücreleri destekleyen retina pigment epiteli (RPE) hücre tek tabaka, (büyük kan damarlarını içeren) koroid kalanını ayrı retinada (NSR). (B) insan Göz yuvası içine dört kesi düz bir montaj oluşturmak için açılacak izin yapılan edilmektedir.camsı cımbız kullanılarak çıkarılabilir. NSR vitröz ile birlikte çıkarak aynı zamanda cımbız ile temizlenebilir. Bir hücre kazıyıcı hala koroid ve sklera demirlemiş ise Bruch membran RPE hücre tabakasını kaldırmak için kullanılır. Bruch membranı / koroid kompleksi uzakta sklera soyulmuş olabilir ve yeni bir hücre kazıyıcı kullanarak, dış koroid kaldırılabilir. Ultra saf su içinde nihai yıkama kalan hücresel konuyu lyses. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53382/53382fig2.jpg" /> Şekil 2. ultra saf wa Bruch membran ve yıkama gelen dış koroid yapıları uzakta kazıma Bruch Membran ve (A) daha önce Koroid. H &amp; E boyanan kesitler Histoloji ve sonra (B)ter Bruch membranı zenginleştirilmiş üretir. Ölçek çubukları 20 um temsil etmektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53382/53382fig3.jpg" /> Şekil Protein içeriği analiz için Zenginleştirilmiş Bruch Membran 3. çözünürlük (A). Protein PBS&#39;ye karşı diyaliz önce, oda sıcaklığında 6 saat süre ile 8 M üre içinde inkübe edilerek zenginleştirilmiş Bruch zarının elde edilebilir. Western analizi için, bütün Bruch membranı diyalizat gelen proteinler protein izolasyon boncuklar kullanılarak izole edilmiş ve elüt Laemmli numune yükleme tamponu indirgeme kaynatılarak. (B) A için temsili Coomassie mavisi hem katışıksız hem de gösteren SDS-PAGE jelini ve Bruch membran çözündürülmüş seyreltilebilir (BM) D Yöntemi kullanılarak. (A) escribed (C) 3 ayrı donörlerden alınan çözülen Bruch membranı bir temsilci western blot (kulvarlar 1-3). faktör H-benzeri protein 1 (FHL-1) için probed <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig3large.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakam.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53382/53382fig4.jpg" /> Macula zenginleştirilmiş Bruch Membran Şekil 4. İzolasyonu. Sarı benek bölgesi 5 mm kolayca örten fovea sarı renklenme ile tespit edilebilir alanı ve komşu optik disk olan yakınlığı. Bir kılavuz olarak foveayı kullanarak, 6 mm makula doku bloğu çıkarılması için, düz monte insan gözü üzerinde 6 mm biyopsi zımbası yerleştirin. Örten NSR çıkarın ve eksize makula gelen RPE hücreleri kazıyın. Kalan Bruch membranı / koroid kompleksi cann uzak sklera soyulmuş olması ve iyice lize ultra saf su içinde dalma hücresel materyal kalan koroid kaldırmak için kazınmış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53382/53382fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes at JoVE.com

Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Identifying proteins specifically associated with Bruch&#8217;s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

İnsan Donör Gözler gelen Bruch Membran zenginleştirilmesi

Age-related macular degeneration (AMD) is a leading cause of visual impairment in the developed world. The disease manifests itself by the destruction of ...

enrichment-of-bruch-s-membrane-from-human-donor-eyes

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Görüntüleme.  University of Manchester. Identifying proteins specifically associated with Bruch’s membrane in human eyes is an important step in understanding the biochemical mechanisms behind eye diseases such as age-related macular degeneration. This protocol describes how to enrich this sheet of extracellular matrix for down-stream biochemical analysis.

Video: Enrichment of Bruch's Membrane from Human Donor Eyes

Isolation, Enrichment, and Maintenance of Medulloblastoma Stem Cells

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been generally adopted to study the nature of neural stem cells, including those derived from normal and tumorous tissues. However, appreciable amounts of differentiation and cell death are common in cultured neurospheres likely due to sub-optimal condition such as accessibility of all cells within sphere aggregates to culture medium.
Medulloblastoma, the most common pediatric CNS tumor, is characterized by its rapid progression and tendency to spread along the entire brain-spinal axis with dismal clinical outcome. Medulloblastoma is a neuroepithelial tumor of the cerebellum, accounting for 20% and 40% of intracranial and posterior fossa tumor in childhood, respectively1. It is now well established that Shh signaling stimulates proliferation of cerebellar granule neuron precursors (CGNPs) during cerebellar development 2-4. Numerous studies using mouse models, in which the Shh pathway is constitutively activated, have linked Shh signaling with medulloblastoma 5-9.
A recent report has shown that a subset of medulloblastoma cells derived from Patched1LacZ/+ mice are cancer stem cells, which are capable of initiating and propogating tumors 10. Here we describe an efficient method to isolate, enrich and maintain tumor stem cells derived from several mouse models of medulloblastoma, with constitutively activated Shh pathway due to a mutation in Smoothened (11, hereon referred as SmoM2), a GPCR that is critical for Shh pathway activation. In every isolated medulloblastoma tissue, we were able to establish numerous highly proliferative colonies. These cells robustly expressed several neural stem cell markers such as Nestin and Sox2, can undergo serial passages (greater than 20) and were clonogenic. While these cultured tumor stem cells were relatively small, often bipoar with high nuclear to cytoplasmic ratio when cultured under conditions favoring stem cell growth, they dramatically altered their morphology, extended multiple cellular processes, flattened and withdrew from the cell cycle upon switching to a cell culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum. More importantly, these tumor stem cells differentiated into Tuj1+ or NeuN+ neurons, GFAP+ astrocytes and CNPase+ oligodendrocytes, thus highlighting their multi-potency. Furthermore, these cells were capable of propagating secondary medulloblastomas when orthotopically transplanted into host mice.

This protocol describes the isolation, enrichment, and maintenance of medulloblastoma tumor stem cells derived from mutant mice with ectopic Sonic hedgehog pathway activity.

Medulloblastom Kök Hücreleri İzolasyon, Zenginleştirme ve Bakım

Brain tumors have been suggested to possess a small population of stem cells that are the root cause of tumorigenesis. Neurosphere assays have been ...

Nörobilim

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell lineage development. In vitro expansion of neural progenitors from fetal CNS tissue has been well characterized. Despite the identification and isolation of glial progenitors from adult human sub-cortical white matter and development of various culture conditions to direct differentiation of fetal neural progenitors into myelin producing oligodendrocytes, acquiring sufficient human oligodendrocytes for in vitro experimentation remains difficult. Differentiation of galactocerebroside+ (GalC) and O4+ oligodendrocyte precursor or progenitor cells (OPC) from neural precursor cells has been reported using second trimester fetal brain. However, these cells do not proliferate in the absence of support cells including astrocytes and neurons, and are lost quickly over time in culture. The need remains for a culture system to produce cells of the oligodendrocyte lineage suitable for in vitro experimentation.
Culture of primary human oligodendrocytes could, for example, be a useful model to study the pathogenesis of neurotropic infectious agents like the human polyomavirus, JCV, that in vivo infects those cells. These cultured cells could also provide models of other demyelinating diseases of the central nervous system (CNS). Primary, human fetal brain-derived, multipotential neural progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons (progenitor-derived neurons, PDN) and astrocytes (progenitor-derived astrocytes, PDA) This study shows that neural progenitors can be induced to differentiate through many of the stages of oligodendrocytic lineage development (progenitor-derived oligodendrocytes, PDO). We culture neural progenitor cells in DMEM-F12 serum-free media supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF), platelet derived growth factor (PDGF-AA), Sonic hedgehog (Shh), neurotrophic factor 3 (NT-3), N-2 and triiodothyronine (T3). The cultured cells are passaged at 2.5e6 cells per 75cm flasks approximately every seven days. Using these conditions, the majority of the cells in culture maintain a morphology characterized by few processes and express markers of pre-oligodendrocyte cells, such as A2B5 and O-4. When we remove the four growth factors (GF) (bFGF, PDGF-AA, Shh, NT-3) and add conditioned media from PDN, the cells start to acquire more processes and express markers specific of oligodendrocyte differentiation, such as GalC and myelin basic protein (MBP). We performed phenotypic characterization using multicolor flow cytometry to identify unique markers of oligodendrocyte.

Primary, human fetal brain-derived, multipotential progenitor cells proliferate in vitro while maintaining the capacity to differentiate into neurons and astrocytes. This work shows that neural progenitors can be induced to differentiate through stages of the oligodendrocytic lineage by conditioning with select growth factors.

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

İnsan Pluripotent Kök Hücreler Telencephalic glutamaterjik Nöron Şartnamesi

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

İnsan Pluripotent dan Sinir Crest Progenitör Hücreler besleyici ücretsiz Derivasyon Kök Hücre

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

İnsan Pluripotent Kök Hücreleri dopaminerjik Nöron Farklılaşma Yönetmen

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

Otopsi İnsan beyni Donörleri gelen leptomeninkslerde Eksplantasyon Kültürlerin türetilmesi

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...