Este proyecto fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (5 P20 RR016461 y 8 P20 GM103499), la Fundación Nacional para la Ciencia (EPS-0903795). Más apoyo proporcionado por la Investigación y Crecimiento Profesional de la Universidad de Furman y premios Furman Advantage.

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo animal fue aprobado por el (número de permisos: A3242-01) Comité Institucional Cuidado de Animales y el Empleo de la Universidad de Furman. Todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo se pueden encontrar en la Tabla de Materiales y Equipos, mientras tampones utilizados se pueden encontrar en la tabla de tampones y soluciones. 1. suspensión de células individuales de linfocitos del mouse bazos <ol><li> Sacrificar los ratones mediante asfixia con CO2. Confirmar la eutanasia por dislocación cervical. Nota: Utilice el bazo a partir de dos 6-8 semanas de edad ratones isogénico (por ejemplo, C57B / 6) del mismo género. Por lo general, se procesan dos bazos. </li><li> Rocíe los animales profusamente con solución de etanol al 70% y orientar de manera que la cabeza está mirando hacia la izquierda. </li><li> El uso de pinzas, levantar la piel del animal hacia arriba y lejos de tque cuerpo. Con unas tijeras, corte una pequeña muesca a través de la piel cerca del abdomen del animal. Usando los dedos, tirar de cada lado de la muesca para exponer el peritoneo desde el cuello hasta el comienzo de las patas traseras. El bazo debe ser visible directamente debajo del peritoneo. </li><li> Con unas pinzas, levante el peritoneo y hacer una pequeña incisión para exponer el bazo. Retirar el bazo con pinzas y usar las tijeras para embromar a la basura cualquier adiposo y tejido conectivo. </li><li> Coloque el bazo en un tubo cónico de 50 ml que contiene 10 ml de PBS suplementado con 2% suero bovino fetal (denominado en lo sucesivo PBS + 2%). Mantenga el tubo en hielo hasta que esté listo para comenzar la suspensión de células individuales. Nota: la recuperación típica es de entre 60-90 million células por el bazo, y por lo general, se necesitan 2 millones de células por muestra. Realizar todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos. </li><li> Decantar los bazos en un 100 mm placa de cultivo tisular estéril. </li><li> Obtener dos portaobjetos esmerilado y mantenga tse desliza de manera que las dos superficies heladas en bruto se enfrentan hacia el interior uno hacia el otro. Moje las diapositivas en la solución de PBS + 2% se vierte en la placa de Petri. </li><li> Mantenga el bazo entre las superficies de esmerilado de las diapositivas, con los bordes todavía sumergidas, y moler el bazo suavemente moviendo las diapositivas de ida y vuelta uno contra el otro (Figura 1A). Las células caerán en la placa de Petri. Continuar moler hasta que todas las células han sido liberados y los restos del bazo aparecerá blanco (Figura 1B). </li><li> Elaborar la suspensión celular en una pipeta y filtrar lentamente a través de un filtro de 70 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml estéril. Tenga en cuenta que pequeños trozos de pulpa roja estarán presentes en el filtro (Figura 2). <ol><li> Si el filtro se levanta, levántelo ligeramente para permitir que el líquido drene a través y coloque el filtro en el tubo cónico de 50 ml y continuar, repitiendo este proceso según sea necesario. Si el procesamiento de más de 5 SPLEens, puede ser necesario dividir en dos lotes y utilizar un nuevo filtro para cada uno. </li></ol></li><li> El uso de la parte de tope de una jeringa de 3 ml presionar suavemente la pulpa roja que contiene las células restantes a través del filtro (Figura 2B). Asegúrese de presionar tanto a la parte inferior del filtro y los lados para asegurar que toda la pulpa roja ha pasado a través del filtro (Figura 2C). </li><li> Añadir 10 mL de PBS + 2% a la placa de cultivo de tejidos y usar esto para lavar el portaobjetos, tapón de la jeringa, y el plato para recuperar las células restantes. Pasar este a través del mismo filtro de células de 70 m en el tubo cónico de 50 mL. Repita este paso según sea necesario. </li><li> Centrifugar la suspensión celular se filtró a 300 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante, con cuidado de no perturbar el sedimento. Una cantidad traza de PBS + 2% se dejó en el tubo. Tapar el tubo y la película de la pastilla hasta que el sedimento se resuspendió completamente. </li><li> Lyse glóbulos rojos por anuncioding 2 ml de ACK tampón de lisis (0,15 M NH 4 Cl, 1 mM KHCO3, EDTA 0,1 mM, pH de 7,2, se almacena a 4 ° C) por bazo al tubo cónico y girar e invertir el tubo para asegurar que todas las células entrar en contacto con el tampón ACK. Agite suavemente el tubo durante 1 min a TA. </li><li> Llevar el volumen de la suspensión celular a 50 ml mediante la adición de PBS + 2% el tubo para neutralizar el tampón ACK. Invierta el tubo 10 veces y centrifugar durante 5 minutos a 300 xga 4 ° C. Después de la centrifugación es completa, el sedimento debe ser blanco (Figura 3). </li><li> Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante, con cuidado de no perturbar el sedimento. Deja una pequeña cantidad de PBS + 2% en el tubo, tapar el tubo, y la película de la pastilla para volver a suspender la misma. </li><li> Añadir 10 ml de medio de células T [10% de FBS, HEPES 10 mM (pH 7,0), 2 mM GlutaMAX, piruvato 1 mM de sodio, 1x aminoácidos no esenciales, 1x penicilina / estreptomicina y 50 mM β-mercaptoetanol] y, además, resuspender el precipitado por suavementepipeteando arriba y abajo. Luego filtrar la suspensión a través de un filtro de 70 micras nuevo en un nuevo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Utilice otros 5-10 ml de medio de células T para enjuagar el tubo original y pasar esta a través del filtro 70 micras en el tubo que contiene el resto de las células filtradas. Si el procesamiento de más de dos bazos, el volumen de los medios de comunicación de células T se puede aumentar para maximizar la recuperación. </li><li> Mantener las células en hielo hasta que esté listo para ser manchado. Las células deben ser contados y viabilidad acceder. <ol><li> Para contar las células, combinar 3 ml de células con 24 ml de PBS + 2% y 3 ml de 0,4% de azul de tripano. Cargar 10 ml de esta en cada cámara de un hemocitómetro Neubauer mejorado. Viabilidad, según la evaluación de exclusión con azul de tripano, es típicamente entre 85 a 95%. </li></ol></li></ol> 2. Viabilidad y tinción de la superficie <ol><li> Células de pellets por centrifugación durante 10 minutos a 300 xga 4 ° C. Resuspender las células en medio de células T a una concentración de 1 x 10 7 células / ml. Transfer 2 millones de células (100 ml) en un pocillo de una placa de 96 pocillos de cultivo de tejidos de fondo en U. </li><li> Centrifugar la placa de 96 pocillos durante 10 minutos a 300 xga 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante de cada pocillo con un movimiento rápido de líquido dentro de la placa así en el fregadero (el sedimento celular se mantendrá en el pozo) y secándose la placa sobre una toalla de papel limpia. Lavar las células mediante resuspensión en 200 l de PBS seguido de centrifugación a 300 xg durante 10 min a 4 ° C. Realizar todos los lavados de esta manera a menos que se indique lo contrario. Nota: No utilice PBS + 2%, ya que interfiere con la mancha PI puede arreglar. </li><li> Eliminar el sobrenadante con un movimiento rápido de la placa y añadir 100 ml de tinte comercial recién preparado (por ejemplo, se puede fijar la mancha roja de células muertas) a cada pocillo. <ol><li> Hacer la mancha por dilución de la solución de colorante reactivo 01:10 en DMSO seguido de una dilución 1:10 en PBS. Incubar la placa a 4 ° C durante 30 min protegidas de la luz. </li></ol></li><li> Centrifugar la ptarde para 10 min a 300 xga 4 ° C. En este punto en adelante, realice todo el trabajo con la placa con la luz campana de cultivo de tejidos fuera. </li><li> Eliminar el sobrenadante con un movimiento rápido de la placa y luego añadir 100 ml de solución de bloqueo Fc. Hacer solución de bloqueo Fc diluyendo Fc bloque de solución madre 1: 100 en PBS. </li><li> Diluir anticuerpos que se utilizarán para tinción de la superficie (por ejemplo, anti-CD4 o anti-CD8) en PBS y se añaden 100 ml a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos durante 30 minutos a 4 ° C protegido de la luz. Nota: Los anticuerpos manchas superficiales deben titularon para un rendimiento óptimo. Típicamente utilizar una dilución 1: 400, por el protocolo del fabricante: 200 o 1. </li></ol> 3. intracelular Histona H3 tinción para <ol><li> Después de la incubación de la mancha de la superficie, se lavan las células dos veces en PBS. </li><li> Después del último lavado, añadir 100 l de paraformaldehído al 4% a cada pocillo. Incubar la placa de 96 pocillos durante 5 min a TA. Hacer 4% de paraformaldehído por diluting 16% de paraformaldehído en PBS. Haga este fresco. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS. </li><li> Hacer solución de Perm / Bloque (solución madre Perm es PBS + 2% + 0,02% Triton X-100, se almacenan a 4 ° C) mediante la combinación de 2 ml de suero normal de conejo por 100 ml de la solución de Perm. Hacer suficiente para 60 ml / muestra. </li><li> Añadir 40 ml de Perm / Bloquear a cada pocillo de muestra y mezclar bien con la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no hacer burbujas. Se incuba la placa a temperatura ambiente durante 45 min en la oscuridad. Ahorre restante Perm / Bloque para el paso 3.6. </li><li> Diluir anticuerpo conjugado con fluorescencia Histona H3K4me1 en Perm / Bloque solución reservado en el paso 3.5 y añadir 10 l de esta dilución a cada pocillo. Mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar la placa de 96 pocillos en la oscuridad durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Utilice un anticuerpo conjugado H3K4me1 utilizando el kit de conjugación R-ficoeritrina siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS + 2%. </li><li> Resuspender las células en 200l de PBS + 2% y transferir las muestras a tubos FACS para citometría de flujo análisis. Las muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C en la oscuridad. Para obtener resultados óptimos analizar las muestras dentro de los dos días. Individualmente las muestras teñidas se pueden utilizar como citometría de flujo controles de compensación. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Hemos desarrollado un protocolo que permite la evaluación de la condensación de la cromatina en las células T. Se basa en la simple observación de que los anticuerpos de la histona H3 no pueden acceder a sus epítopos fácilmente en las células ingenuas, pero tras la activación de células T, estos mismos anticuerpos son capaces de unirse a sus epítopos. Mediante la comparación de la tinción de la histona H3 MFI entre los grupos de tratamiento, el grado relativo de condensación o descondensación se puede determinar. Hemos utilizado este protocolo para determinar el estado de condensación relativa durante el desarrollo de timocitos y durante la activación de células T 4. También hemos utilizado este protocolo para investigar los mecanismos que controlan el proceso de descondensación 5. Este protocolo se basa en el uso de un anticuerpo de histona H3 para detectar el estado condensación de la cromatina. Puesto que no hay cambio global en la modificación de histonas durante la activación de células T 4, podemos utilizar un anticuerpo H3K4me1 para evaluar la cromatinaestado en este protocolo. Hemos utilizado anticuerpos generados contra sin modificar la histona H3; sin embargo, la señal producida era mucho más débil en general. En nuestra experiencia, los anticuerpos generados contra modificado histona H3 funcionan mejor en la inmunofluorescencia y citometría de flujo ensayos, mientras que los anticuerpos contra la histona H3 sin modificar funcionan mejor en Western blot. Cabe señalar que también es posible usar anticuerpos dirigidos contra otras proteínas histonas, aunque no hemos intentado. Los pasos de anticuerpos Perm / Bloque y histona H3 son los pasos más críticos en el protocolo. La cantidad de solución de Perm / Bloque utilizado debe ser optimizado cada vez que se haga la solución de Perm. Esto se puede hacer mediante la comparación el rendimiento de diferentes diluciones de la solución madre. Un experimento típico consiste en comparar el estado de la cromatina en las células T ingenuas a las activadas durante 3 horas (Figura 4). Uno debe elegir la dilución que produce el mayor cambio en IMF másel período de tiempo analizado. La solución madre se puede diluir en PBS + 2% para disminuir Perm / Bloque fuerza por primera resuspender las células en tanto como 100 ml de PBS + 2% después de la etapa 3.4 y luego añadiendo el Perm / Bloque en el paso 3.5. Un experimento piloto similar debería ser usado para probar diferentes diluciones del conjugado anticuerpo de histona H3 con fluorescencia cada vez que un nuevo lote de anticuerpo está marcado. Estos pasos son especialmente críticos para la detección exitosa de las diferencias de condensación temprano en la activación de células T (por ejemplo, dentro de 3 h de activación). De vez en cuando, hay células que no reciben permeabilizada y por lo tanto no se mancha con el anticuerpo de histona H3. Esto puede suceder si las células no se vuelven a suspender bien al añadir el Perm / Bloque o si el Perm / Bloque no es lo suficientemente fuerte. Estas células aparecerán como eventos presionadas contra el eje cuando la visualización de un histograma de tinción de la histona H3. Dado que estos eventos se sesgar la IMF en general, estos eventos pueden ser omitidos del análisis realizado por gating la distribución normal de las células de histona H3 positivos. La asistencia adicional se puede encontrar en la Guía de solución de problemas (Tabla 1). La inclusión de un fixable mancha de células muertas permite la evaluación de la viabilidad celular en el ensayo. Esto es absolutamente crítico cuando la manipulación de activación de células T debido a que ciertos estímulos pueden inducir la muerte celular. En tal caso, el anticuerpo de histona H3 se puede unir histonas en células muertas de manera diferente que las células vivas, lo que lleva a una mala interpretación de los resultados. Este protocolo está diseñado para su uso en 96 pocillos formato de placa, lo que permite un análisis de alto rendimiento del estado de la cromatina. Un bazo de un ratón hembra de 6-8 semanas de edad por lo general producirá entre 60-90 million células utilizando el protocolo. Dado que el protocolo de tinción requiere 2 millones de células por muestra, se puede ensayar fácilmente varios grupos de tratamiento y los puntos de tiempo, por triplicado, con un único bazo en una sola placa de 96 pocillos. Es posible pealice el protocolo con menos células por muestra; sin embargo, debido al número de etapas de centrifugación y la pérdida inherente de las células en cada uno de estos pasos, no es aconsejable para reducir el número de células por mucho. Hemos completado con éxito el protocolo con 1 millón de células por muestra. Utilizamos este protocolo para examinar el estado de la cromatina en las células T helper CD4 + y células T citotóxicas CD8 +. Esto es posible debido a que el protocolo incluye tinción de la superficie estándar. El protocolo podría ser fácilmente adaptado para el examen de la cromatina en otras subpoblaciones de linfocitos mediante el uso de anticuerpos contra marcadores de superficie específicas de la población. Este protocolo también podría fácilmente ser adaptado a otros tipos de células, siempre y cuando los anticuerpos que reconocen marcadores de superficie pertinentes son las condiciones de fijación / permeabilización disponibles y adecuados son conocidos.

La citometría de flujo es una tecnología basada en láser desarrollado para el análisis de múltiples parámetros físicos y fluorescentes en las poblaciones de células. Esta tecnología funciona como células suspendidas en una corriente de fluido encuentro un láser, marcadores fluorescentes emocionantes en o dentro de las células. Estos marcadores continuación emiten luz que se detecta y cuantifica mediante tubos fotomultiplicadores. Mientras que la citometría de flujo se ha utilizado tradicionalmente para identificar poblaciones de células, ha demostrado ser una tecnología útil cuando se estudia una matriz de propiedades de células incluyendo integridad de la membrana celular, interacciones proteína-proteína y el tráfico de proteínas a 1-3. Hemos desarrollado un protocolo que permite esta tecnología para ser utilizado para detectar el estado de la cromatina en las células T, ya que se activan in vitro 4. También hemos utilizado este protocolo para investigar el mecanismo de activación inducida por la cromatina descondensación de las células T 5. Activatio células Tn y la proliferación son críticos para una respuesta inmune apropiada. Células T, un subconjunto específico de linfocitos dentro del sistema inmune, son necesarios para las respuestas inmunes adecuadas y el desarrollo de la memoria inmunológica. La activación se inicia cuando un antígeno es presentado en el contexto del complejo mayor compatibilidad con el receptor de células T (TCR) situado sobre la superficie extracelular de las células T en reposo (revisado en 6). Esto desencadena una serie de eventos moleculares dinámicas y altamente ordenados dentro de las células T que culminan en un aumento de Ca2 + intracelular concentración 7 y la translocación nuclear de factores de transcripción necesarios para la activación (revisado en 8-10). Una vez activadas, las células T adquieren la capacidad de responder a la interleucina-2 (IL-2), un factor de crecimiento potente que utiliza la JAK (Janus quinasa) / STAT (transductor de señales y activador de la transcripción) y la vía para conducir la proliferación clonal de T activado las células 11. Brevemente, IL-2 estimulaciónresultados en la fosforilación de proteínas STAT, una familia de factores de transcripción citosólicos latente. Una vez fosforilada, proteínas STAT dimerizan, translocan al núcleo y conducen la expresión de genes, incluyendo los implicados en la progresión del ciclo celular. En las células T, IL-2 señales a través de STAT5, que se requiere para la proliferación de células T 12,13. Con el fin de lograr la expansión clonal de las células T activadas, las células que no han experimentado el compromiso antígeno TCR (células T ingenuas), deben tener un mecanismo para ignorar los efectos potentes de IL-2. Esto se logra a través de la regulación del estado de la cromatina. Células T vírgenes poseen una cromatina condensada que prohíbe compromiso ADN-STAT5 en respuesta a IL-2 estimulación. Tras la activación, decondenses cromatina y STAT5 pueden acceder a los promotores de los genes diana, permitiendo la proliferación clonal 4. Curiosamente, este cambio en el estado de la cromatina no depende de la modificación epigenética de protei histonans (para una revisión, ver 14), como se observó ningún cambio global en la modificación de las histonas durante la activación de células T 4. Durante la realización de estos estudios, hemos descubierto que los anticuerpos contra las proteínas histonas también tenían dificultades para acceder a sus epítopos de células ingenuas, pero que tras la activación podríamos enlazar más fácilmente sus epítopos 4. Por lo tanto, la unión del anticuerpo a las histonas sirve como una lectura para el estado de condensación de la cromatina. Aquí presentamos el método a utilizar citometría de flujo para detectar anticuerpos histona H3 con fluorescencia conjugados con el fin de evaluar el estado de la cromatina en las células T. Condensación de la cromatina en una población de células se mide como la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la tinción de la histona H3. En el contexto de la activación de células T, la IMF de la histona H3 de tinción aumenta, significando la descondensación de la cromatina. Además de medir el estado de la cromatina mediante tinción histona H3 intracelular, este protocolo también incorporarse eTES superficie de tinción y una mancha fixable para células vivas, lo que permite el análisis de subpoblaciones de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:584px;" width="585">
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">100mm tissue culture dish</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Precleaned frosted microscope slides</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-343</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile cell strainer, 70mm nylon mesh</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">3mL syringe, Luer-Lok tip</td>
			<td style="width:83px;">BD</td>
			<td>309585</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Falcon 50mL polypropylene conical tube</td>
			<td style="width:83px;">Corning</td>
			<td>352098</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td>
			<td style="width:83px;">Life Technologies</td>
			<td>L23102</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Fc Block</td>
			<td style="width:83px;">BD Biosciences</td>
			<td>553142</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:83px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:83px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal rabbit serum</td>
			<td style="width:83px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">R9133</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Anti-H3K4me1 antibody</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab8895</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">R-Phycoerythrin conjugation kit</td>
			<td style="width:83px;">Abcam</td>
			<td>ab102919</td>
			<td style="width:167px;">Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Durante una respuesta inmune adecuada, las células T en reposo se activan tras la presentación del antígeno a su receptor de la célula T específica de antígeno. Esto conduce a la proliferación clonal de células T sólo aquellos que llevan un receptor que reconoce el antígeno. Descondensación de la cromatina es un sello de la activación de células T y es necesario para las células T para adquirir la capacidad de proliferar después del acoplamiento antígeno. Este cambio en la condensación de la cromatina puede detectarse utilizando anticuerpos producidos contra las proteínas histonas. Estos anticuerpos no pueden obligar a sus epítopos en las células T vírgenes, así como pueden en las células T activadas. Describimos cómo manchar simultáneamente T marcadores de superficie de células específicas, viabilidad pista con un corregible mancha de células muertas, y medir el estado de la cromatina mediante tinción intracelular de proteínas histonas H3. Las células teñidas son analizadas por citometría de flujo y el estado de condensación de la cromatina se mide como la intensidad media de fluorescencia (MFI) de la mancha de la histona H3. Chromaten descondensación durante la activación de células T se demuestra como un aumento de la IMF

Los linfocitos de un C57B / 6 de ratón se procesaron en una sola suspensión de células según el protocolo y se contaron usando un hemocitómetro estándar. Las células se sembraron por triplicado a 2 x 10 6 / ml en medio de células T en 15 ml tubos cónicos y se dejaron sin tratar, o se estimularon con 1 mg / anticuerpos anti-CD3 solubles ml (4C11 clon) durante 3 horas a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos estándar. Las células muertas se tiñeron y, a continuación las células fueron luego teñidas utilizando anticuerpos superficialmente FITC-CD8 y CD4 APC-acuerdo con el protocolo. Accesibilidad de histona se analizó mediante citometría de flujo (Figura 4). En ambos ingenuo células T CD4 + y CD8 +, la intensidad de fluorescencia media (MFI) es baja, lo que significa un estado de la cromatina condensada. Como las células se activan con anti-CD3 anticuerpos los incrementos aplicados por las IFM de forma significativa (p &lt;0,001, prueba t de Student) que indica que la cromatina ha descondensada. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Figura 1. Técnica para el procesamiento de los bazos en una suspensión de células individuales utilizando portaobjetos de microscopio esmerilado. (A) El bazo se presiona contra las superficies de esmerilado de dos portaobjetos de microscopio. (B) Las diapositivas se mueven hacia atrás y adelante contra otros linfocitos liberación en una placa de Petri de 100 mm hasta los restos del bazo son de color blanco. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Figura 2. Uso de un tapón de la jeringa para presionar restante pulpa roja a través de un filtro de células de 70 mm. (A) de pulpa Red restante después de un bazo i<html> s procesado en una suspensión de células individuales y pasado a través del filtro de células de 70 mm. (B) La parte de tope de una jeringa de 3 ml se utiliza para presionar suavemente restante pulpa roja a través del filtro de células. (C) Después de usar la jeringa, debe haber prácticamente ninguna pulpa roja que queda en el filtro de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Figura 3. ACK lisis de las células rojas de la sangre. (A) centrifugación de una suspensión de células individuales generados a partir de un solo bazo de ratón antes de la lisis ACK. (B) Después de ACK lisis de las células rojas de la sangre, el sedimento celular debe ser blanco.conseguir = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Figura 4. Los resultados representativos del protocolo. Esquema (A) Gating utiliza para analizar el estado de la cromatina en linfocitos T CD4 +. (B y C) las células T se dejaron sin tratar o se activan con / anticuerpos anti-CD3 ml solubles 1 mg durante 3 horas (por triplicado). Las células fueron analizadas por citometría de flujo para determinar la condensación de cromatina en las células CD4 + (B) y las células CD8 + (C). Los datos son la media ± desviación estándar de la intensidad media de fluorescencia de la tinción H3K4me1. * p &lt;0,001 (prueba de la t de Student) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic h</a>ERE para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Mesa 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tabla 1:. Guía de Solución de problemas Una referencia rápida para los problemas comunes y las posibles soluciones.

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

La citometría de flujo puede utilizarse para evaluar el estado de la cromatina dentro de las células T. Este protocolo permite a los científicos interpretan evidencia de descondensación de la cromatina durante la activación de las células T demostrada por un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de anticuerpos histona H3 fluorescentes

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.7K vistas.  Furman University.  La citometría de flujo puede utilizarse para evaluar el estado de la cromatina dentro de las células T. Este protocolo permite a los científicos interpretan evidencia de descondensación de la cromatina durante la activación de las células T demostrada por un aumento en la intensidad de fluorescencia media (MFI) de anticuerpos histona H3 fluorescentes 