Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
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이 프로젝트는 국립 보건 연구소 (5 P20 RR016461 8 P20 GM103499)에서 보조금에 의해 지원되었다, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (EPS-0903795). 퍼먼 대학의 연구 및 전문적인 성장과 퍼먼 이점 상에 의해 제공 또한 지원.

이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 동물 프로토콜은 퍼먼 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (: A3242-01 허가 번호)에 의해 승인되었다. 사용 된 버퍼가 버퍼 및 솔루션의 표에서 확인할 수 있습니다 동안이 프로토콜에 사용되는 모든 재료와 장비, 재료 및 장비의 표에서 확인할 수 있습니다. 마우스 비장에서 림프구 1. 단일 세포 현탁액 <ol><li> CO 2 질식을 통해 마우스를 희생. 자궁 전위에 의해 안락사를 확인합니다. 참고 : 같은 성별의 (예를 들어, / 6 C57B)이 6-8주 된 동종 마우스에서 비장을 사용합니다. 일반적으로, 두 비장 처리됩니다. </li><li> 풍부 70 % 에탄올 수용액 및 헤드가 왼쪽 직면하도록 동양으로 동물 스프레이. </li><li> 집게를 사용하여 위쪽으로 멀리 t에서 동물의 피부를 리프트그는 몸. 가위를 사용하여 동물의 복부 주변의 피부를 통해 작은 홈을 잘랐다. 손가락을 이용하여 뒷다리의 시작 목 복막을 노출시키는 절 결부의 양쪽을 당긴다. 비장은 복막 바로 아래에 표시되어야합니다. </li><li> 집게를 사용하여 복막을 들어 올려 비장을 노출 할 수있는 작은 절개를합니다. 집게와 비장을 제거하고 지방과 결합 조직을 멀리 애타게 가위를 사용합니다. </li><li> 2 % 태아 소 혈청으로 보충 된 10 ml의 PBS를 함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 비장을 배치 (이하 PBS + 2 % 이상으로 함). 단일 세포 현탁액을 시작할 준비가 될 때까지 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 일반적인 복구 비장 당 60-90000000 사이의 세포이며, 일반적으로, 2 백만 세포 샘플 당이 필요하다. 조직 배양 후드에서 다음 단계를 모두 수행한다. </li><li> 멸균 100mm 조직 배양 접시에 비장을 가만히 따르다. </li><li> T 두 프로스트 현미경 슬라이드를 얻어 개최두 거친 프로스트 표면이 서로를 향해 안쪽으로 마주 보도록 그는 슬라이드. PBS + 2 % 용액에 슬라이드를 습윤 페트리 접시에 붓고. </li><li> 여전히 침수 가장자리에, 슬라이드의 프로스트 표면 사이의 비장을 잡고 서로 (그림 1A)에 대해 앞뒤로 슬라이드를 움직여 부드럽게 비장 갈기. 세포는 배양 접시에 빠질 것입니다. 모든 셀이 출시과 비장의 유물 (그림 1B) 흰색 표시 될 때까지 연마를 계속합니다. </li><li> 피펫으로 세포 현탁액을 그려 새로운 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 필터를 통해 천천히 필터링합니다. 빨간 펄프의 작은 조각이 필터 (그림 2A)에 존재할 수 있습니다. <ol><li> 필터가 상승하면, 부드럽게 필요에 따라이 과정을 반복, 유체를 통해 드레인과 50 ML 원뿔 관에 다시 필터를 배치하고 계속 할 수 있도록 약간 들어 올려. 5 개 이상이면 처리 spleENS, 두 개의 배치에 나누어 각각 새로운 필터를 사용하는 것이 필요할 수있다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부를 사용하여 부드럽게 스트레이너 (도 2b)를 통해 나머지 세포를 포함하는 적색 펄프를 누른다. 모든 빨간 펄프 필터 (그림 2C)를 통과 한 것을 확인하기 위해 필터 바닥과 측면을 모두 눌러해야합니다. </li><li> 조직 배양 접시에 10 mL의 PBS + 2 %를 추가하고 남아있는 세포를 복구하기 위해 슬라이드, 주사기 스토퍼, 그리고 요리를 세척 할 때 사용합니다. 50 ML 원뿔 튜브에 같은 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 이 단계가 필요한만큼 반복합니다. </li><li> 4 ℃에서 5 분 동안 300 XG에 필터링 된 세포 현탁액을 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. PBS + 2 %의 미량이 튜브에 남아있을 것이다. 튜브 캡과 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 펠릿을 가볍게. </li><li> 광고로를 Lyse 적혈구ACK 용해 버퍼의 딩 2 용액 (0.15 M NH 4 CL, 1 mM의 KHCO 3, 0.1 mM의 EDTA, 4 ° C에서 7.2, 저장소의 pH) 원뿔 튜브에 비장 당 회전 보장하기 위해 튜브를 반전 모든 세포 ACK 버퍼와 접촉. 부드럽게 실온에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이 친다. </li><li> PBS + 2 % ACK 버퍼 중화 튜브를 첨가하여 50 ml의 세포 현탁액의 양을 준비한다. 4 ℃에서 300 XG에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리하고 10 시간을 전환. 원심 분리가 완료되면, 펠렛을 백색 (도 3)이어야한다. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 폐기 상층 액을 조심하지 펠렛을 방해 할 수 있습니다. 튜브에 PBS + 2 %의 미량 남기기 튜브를 캡핑하고, 재현 탁을 위해 펠릿을 가볍게. </li><li> T 세포 배지 [10 % FBS, 10 mM의 HEPES (PH 7.0), 2 mM의 루타, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산, 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 50 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 또한 10 ㎖를 추가 부드럽게하여 펠릿을 재현 탁로 pipetting 아래. 그런 다음 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 새로운 70 μm의 필터를 통해 서스펜션을 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 원래 튜브 헹구고 여과 셀의 나머지 부분을 포함하는 튜브에 70 μm의 필터를 통해 통과하는 T 세포의 다른 매체를 사용하여 5 ~ 10 mL로. 두 개 이상의 비장을 처리하면, T 세포 배지의 부피는 회복을 최대화하도록 증가 될 수있다. </li><li> 준비가 염색 할 때까지 얼음에 세포를 유지합니다. 세포 계산과 생존에 액세스 할 수 있어야합니다. <ol><li> 세포를 계산하려면 24 PBS + 2 % ㎖의 3 ㎖ 0.4 % 트리 판 블루로 세포의 3 ㎖을 결합한다. 로드 향상 노이 바 우어의 혈구의 각 챔버에이 10 ㎖. 트리 판 블루 배제에 의해 평가로 생존은 85-95% 사이에 일반적입니다. </li></ol></li></ol> 2. 생존과 표면의 얼룩 <ol><li> 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 원심 분리하여 펠렛 세포. 1 × 107 세포 / ml의 농도로 T 세포 배지에서 세포를 재현 탁. TRANSFU 바닥 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 200 만 ER 셀 (100 ㎖). </li><li> 4 ° C에서 300 XG에서 10 분 동안 96 웰 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 잘 싱크대에 웰 플레이트에서 액체를 쓸어 넘겨 각각의 상층 액을 분리합니다 (세포 펠렛은 잘 유지됩니다) 깨끗한 종이 타월에있는 플레이트에 뿌리며 마치. 200 ㎕의 PBS에 재현 탁하여이를 세포 씻어 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에서 원심 분리 하였다. 별도의 표시가없는 한, 모든 세척이 방법을 수행합니다. 참고 :이 고칠 PI 얼룩 방해로 PBS + 2 %를 사용하지 마십시오. </li><li> 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 각 웰에 새로 제조 된 상업 얼룩 (예를 들어, 고칠 붉은 죽은 세포 얼룩) 100 ㎖를 추가합니다. <ol><li> PBS에서 1:10 희석 한 다음 DMSO의 반응성 염료 원액의 1:10 희석하여 얼룩을 확인합니다. 빛으로부터 보호 30 분 동안 4 ° C에서 접시를 품어. </li></ol></li><li> P를 원심 분리기후반 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안. 이 시점에서, 오프 조직 문화 후드 라이트와 함께 접시에 모든 작업을 수행합니다. </li><li> 판을 쓸어 넘겨 상층 액을 제거하고 다음의 Fc 블록 용액 100 ㎖를 추가합니다. 된 Fc 블록 원액 1 희석 된 Fc 블록 솔루션을 확인하십시오 : PBS에서 100. </li><li> 희석 된 항체를 PBS에 대해 표면의 오염 (예를 들어, 항 CD4 또는 CD8 항)를 사용하고, 각 웰에 100 ㎖를 추가한다. 빛으로부터 보호 4 ℃에서 30 분 동안 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 표면 얼룩 항체가 최적의 성능을 위해 역가해야합니다. 제조업체의 프로토콜 당 400 희석 : 200 또는 1 : 일반적으로 1을 사용합니다. </li></ol> 히스톤 H3 3. 세포 내 염색 <ol><li> 표면 얼룩의 부화 후, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 마지막 세척 후, 각 웰에 4 % 파라 포름 알데히드 100 μl를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 96 웰 플레이트를 배양한다. dilut 4 % 파라 포름 알데히드를 확인PBS에서 16 % 파라 포름 알데히드를 보내고. 이 신선합니다. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. </li><li> 파마 / 차단 솔루션을 확인 (주 파마 솔루션은 PBS + 인 2 % + 0.02 % 트리톤 X-100, 저장 4 ° C에서) 100 ㎖ 주식 파마 액 당 정상 토끼 혈청 2 ㎖를 결합하여. 60 ㎖ / 샘플에 대한 충분합니다. </li><li> 부드럽게 거품을 만드는 않도록주의하면서, 아래로 피펫 팅에 의해 잘 잘 각 샘플에 40 ml의 파마 / 블록을 추가하고 혼합한다. 어둠 속에서 45 분 동안 실온에서 접시를 품어. 단계 3.6 파마 / 벽돌 남은 저장합니다. </li><li> 단계 3.5에 예약 파마 / 차단 솔루션에 형광 접합 히스톤 H3K4me1 항체를 희석하고 각 웰에이 희석의 10 μl를 추가합니다. 부드럽게 피펫 팅 아래로 섞는다. 4 ℃에서 1 시간 동안 어둠 속에서 96 웰 플레이트를 품어. 참고 : 제조업체의 지침에 따라 R-피코 에리 트린의 결합 키트를 사용하여 결합 H3K4me1 항체를 사용합니다. </li><li> 두 번 PBS + 2 %의 세포를 씻으십시오. </li><li> (200)에서 세포를 재현 탁PBS + 2 % μL 및 유동 세포 계측법 분석을위한 외과 튜브에 샘플을 전송합니다. 샘플은 어둠 속에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 최적의 결과 두 가지 일 이내에 샘플을 분석 할 수 있습니다. 단독 스테인드 샘플 보상 유세포 컨트롤로서 사용될 수있다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

우리는 T 세포의 염색질 응축의 평가를 허용하는 프로토콜을 개발했다. 그것은 히스톤 H3 항체는 나이브 세포에서 용이하게 그 에피토프에 액세스 할 수없는 간단한 관찰에 의존하지만, T 세포가 활성화되면, 이러한 항체는 동일한 에피토프에 결합 할 수있다. 처리 군 사이의 MFI 히스톤 H3의 염색과 비교하여, 또는 축합 decondensation의 상대적인 정도를 결정할 수있다. 우리는 흉선 세포 발달 동안 및 T 세포 활성화 4 중 상대적 응축 상태를 결정하기 위해 이러한 프로토콜을 사용했다. 우리는 또한 decondensation 과정 (5)을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 이 프로토콜은 염색질 응축 상태를 검출하는 히스톤 H3 항체의 사용에 의존한다. T 세포 활성화 4 동안 히스톤 변형 전역 변화가 없기 때문에, 우리는 염색질을 평가 H3K4me1 항체를 사용할 수있다이 프로토콜의 상태. 우리는 수정되지 않은 히스톤 H3에 대해 제기 항체를 사용했다; 그러나, 생성 된 신호는 매우 약하다 전체였다. 수정되지 않은 히스톤 H3에 대한 항체는 웨스턴 블롯에서 더 잘 작동하는 동안 우리의 경험에 의하면, 수정 히스톤 H3에 대해 제기 항체는 면역에 더 잘 작동하고 세포 계측법 분석 흐름. 이는 우리가 시도되지 않은 것이 있지만, 다른 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하는 것이 가능하다는 것을 주목해야한다. 파마 / 벽돌과 히스톤 H3 항체 단계는 프로토콜의 가장 중요한 단계입니다. 사용 파마 / 블록 용액의 양은 스톡 파마 액 이루어질 때마다 최적화 될 필요가있다. 이것은 스톡 용액의 상이한 희석 성능을 비교함으로써 수행 될 수있다. 전형적인 실험은 3 시간 (그림 4)에 대해 활성화 된 것과 순진한 T 세포의 염색질 상태를 비교하는 과정이 수반됩니다. 하나는 위에 MFI에 가장 큰 변화를 생산 희석을 선택해야합니다시간 분석. 원액 첫번째 단계 3.5 파마 / 블록을 추가 단계 3.4 이후만큼 ml의 100 PBS + 2 %에서 세포를 재현 탁하고 의해 파마 / 블록 강도 저하 PBS + 2 %로 희석 할 수있다. 유사한 파일럿 실험은 형광 공액 히스톤 H3 항체의 항체의 새로운 배치가 표시 될 때마다 다른 희석액을 테스트하기 위해 사용되어야한다. 이러한 단계 (활성화 3 시간 이내, 예) 초기 T 세포 활성화에 축합 차이의 성공적인 검출에 특히 중요하다. 때때로, 히스톤 H3 항체로 염색하지 않습니다 때문에 투과성이 도착하지 않는 세포가있다. 이 파마 / 블록을 추가 할 때 세포가 잘 재현 탁하지 않은 경우 발생할 수 있습니다 또는 파마 / 벽돌이 지탱할 수없는 경우. 이 세포는 히스톤 H3 염색의 히스토그램을 시각화 할 때 축에 가압 이벤트로 나타납니다. 전체 MFI를 왜곡 할이 사건 이후,이 이벤트는 gatin에 의해 분석에서 생략 할 수있다G 히스톤 H3 양성 세포의 정규 분포. 추가 지원은 문제 해결 설명서 (표 1)에서 찾을 수 있습니다. 고칠 수 죽은 세포 얼룩의 포함은 분석에서 세포 생존 능력의 평가를 할 수 있습니다. 특정한 자극은 세포 사멸을 유도 할 수 있기 때문에, T 세포 활성화를 조작하는 경우에 절대적으로 중요하다. 이러한 경우, 히스톤 H3 항체 결과 오해로 이어지는 생균 다르게 사균에서 히스톤 결합 할 수있다. 이 프로토콜은 염색질 상태의 높은 처리량 분석을 가능하게, 96- 웰 플레이트 형식으로 사용하기 위해 설계된다. 6-8 주령 암컷 마우스에서 비장은 일반적 프로토콜을 사용 60-90000000 간 세포를 수득한다. 염색 프로토콜은 샘플 당 2 백만 세포를 필요로하기 때문에, 용이 한 단일 96- 웰 플레이트에 단일 비장 중으로 여러 처치 군과 시점을 분석 할 수있다. 그것은 P에있다샘플 당 더 적은 세포와 프로토콜을 erform; 그러나, 원심 분리 단계의 수와 각 단계에서 세포의 고유 손실, 훨씬하여 세포의 수를 낮추는 것이 바람직하지 않다. 우리는 성공적으로 샘플 당 1 백만 세포와 프로토콜을 완료했습니다. 우리는 CD4 + T 헬퍼 세포 및 CD8 + 세포 독성 T 세포의 염색질 상태를 검사하기 위해 사용되는 프로토콜. 프로토콜은 표준 표면 얼룩을 포함하기 때문에 가능 이루어진다. 프로토콜 용이 인구 특정 표면 마커에 대한 항체를 사용하여 다른 림프구 아 집단에서 염색질의 검사를 위해 적응 될 수있다. 이 프로토콜은 쉽게 관련 표면 마커를 인식하는 항체로 오랫동안 다른 세포 유형에 사용할 수 있고 적절한 고정 / 투과성으로 조건 알려져 있습니다 적용 할 수 있습니다.

유동 세포 계측법은 세포 집단의 다수의 물리적 파라미터의 형광 분석을 위해 개발 된 레이저 기반 기술이다. 이 기술이나 세포 내 유체 스트림의 만남에 현탁 세포로서 레이저 흥분 형광 마커를 작동한다. 이 마커는 감지 광전자 증 튜브에 의해 정량화 빛을 방출한다. 유동 세포 계측법은 전통적 세포 집단을 식별하는 데 사용 되었으나, 이는 세포막의 무결성, 단백질 - 단백질 상호 작용, 단백질 거래 1-3 포함한 전지 특성의 배열을 연구 할 때 유용한 기술로 입증되었다. 우리는이 기술들은 시험 관내 (4)에서 활성화 될 때 T 세포의 염색질 상태를 검출하는데 사용될 수있는 프로토콜을 개발했다. 우리는 또한 T 세포 (5)의 활성화를 유도 염색질 decondensation의 메커니즘을 조사하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. T 세포 activati​​on 및 확산은 적절한 면역 반응에 중요하다. T 세포, 면역 시스템 내 림프구의 특정 서브 세트는 적절한 면역 반응 및 면역 학적 메모리의 개발에 요구된다. 항원 (6에서 검토)의 무부하 T 세포의 세포 표면에있는 T 세포 수용체 (TCR)에 주요 호환성 착체의 컨텍스트에서 제공 될 때 활성화가 개시된다. 이는 세포의 Ca2 + 농도 (7) 및 (8-10에서 검토)의 활성화에 필요한 전사 인자의 핵 전좌의 증가 남중 T 세포 내의 동적 고도로 정렬 된 분자 일련의 이벤트를 트리거한다. 일단, T 세포는 인터루킨 -2 (IL-2), JAK (야누스 키나제) / STAT를 이용하는 강력한 성장 인자에 반응하는 능력을 획득 활성화 (신호 변환기와 전사 액티베이터) 경로가 활성화 T의 클론의 증식을 구동 셀 (11). 간략하게, IL-2 자극STAT 단백질 세포질 잠상 전사 인자의 계열의 인산화 결과. 인산화되면 STAT 단백질은 이량 화, 핵으로 이동시키다 및 세포주기 진행에 관련된 것들을 포함하는 유전자의 발현을 구동한다. T 세포, T 세포의 증식에 필요한 12,13 STAT5 통해 IL-2 신호. 활성화 된 T 세포의 클로 날 팽창을 달성하기 위해, 항원 - 결합 TCR (나이브 T 세포)를 경험하지 아니한 세포는 IL-2의 강력한 효과를 무시하는 메커니즘을 가져야한다. 이것은 염색질 상태의 규제를 통해 달성된다. 나이브 T 세포는 IL-2 자극에 응답 STAT5-DNA 결합을 금지 응축 된 염색질을 갖는다. 활성화되면, 염색질 decondenses 및 STAT5는 클론 증식 4를 허용, 표적 유전자의 프로모터에 액세스 할 수 있습니다. 흥미롭게도, 염색질 상태의 변화는 히스톤 PROTEI의 후생 유전 학적 변형에 의존하지 않는다NS (검토를 위해, 14 참조) 우리는 T 세포 활성화 4시 히스톤 수정에는 글로벌 변화를 관찰하지 않기 때문에. 이 연구를 수행하는 동안, 우리는 히스톤 단백질에 대해 제기 항체는 순진 세포에 자신의 에피토프를 액세스하는 어려움을 가지고 있다는 것을 발견,하지만 활성화에 따라 그보다 쉽게 자신의 항원 결정기 (4)를 결합 할 수 있습니다. 따라서, 히스톤에 결합하는 항체는 염색질 응축 상태를 판독 역할을한다. 여기서 우리는 방법 T 세포에서 염색질 상태를 평가하기 위해 형광 접합 된 히스톤 H3 항체를 검출하는 유동 세포 계측법을 사용하도록 제안한다. 세포 집단 내의 염색질 응축은 히스톤 H3 염색의 평균 개화 강도 (MFI)로 측정된다. 염색질의 decondensation를 나타내는 T 세포 활성화, 히스톤 H3 염색 증가 MFI, 문맥에서. 히스톤 H3 세포 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 이외에,이 프로토콜은 또한 incorporaTES는 세포의 소집단의 분석을 허용, 염색 및 살아있는 세포에 대한 정착 얼룩 표면.

<table><tbody><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Precleaned frosted microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe, Luer-Lok tip</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml polypropylene conical tube</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L23102</td><td>Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>R-Phycoerythrin conjugation kit</td><td>Abcam</td><td>ab102919</td><td>Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td></tr></tbody></table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

적절한 면역 반응 동안 대기 T 세포는 항원 특이 적 T 세포 수용체에 대한 항원 제시에 따라 활성화된다. 이 항원을 인식하는 수용체를 부담 만 T 세포 클론의 증식을 이끈다. 염색질 decondensation는 T 세포 활성화의 특징이며, T 세포는 항원 결합 후에 증식하는 능력을 획득하기 위해 요구된다. 염색질 응축의 변화는 히스톤 단백질에 대해 발생 된 항체를 사용하여 검출 할 수있다. 이 항체는 활성화 된 T 세포에서뿐만 아니라 그들이 할 수 나이브 T 세포에서의 항원에 결합 할 수 없습니다. 우리는 동시에 고칠 수 죽은 세포 얼룩 T 세포의 특정 표면 마커, 추적 가능성을 얼룩 및 히스톤 H3 단백질의 세포 내 염색을 통해 염색질 상태를 측정하는 방법에 대해 설명합니다. 염색 된 세포는 유세포 분석되고 염색질 응축 상태는 히스톤 H3 염색의 평균 형광 강도 (MFI)로 측정된다. ChromatT 세포의 활성화 과정에서 decondensation MFI의 증가로 입증된다

C57B / 6 마​​우스에서 림프구 프로토콜에 따라 단일 세포 현탁액으로 처리하고 표준 혈구를 사용하여 계수 하였다. 세포를 2 × T 세포 배지에서 6 / ㎖ 15 ㎖의에 중으로 원추형 튜브에 시딩하고 방치하거나, ​​37 ℃에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체 (클론 4C11)로 자극했다 표준 조직 문화 인큐베이터. 죽은 세포를 염색 한 후 세포는 프로토콜에 따라 FITC-CD8 및 APC-CD4 항체를 사용하여 염색 표면했다. 히스톤 접근성 유동 세포 계측법 (그림 4)을 통해 분석 하였다. 두 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포, 평균 형광 강도 (MFI)를 축합 염색질 상태를 나타내는, 낮다. 세포를 항 CD3과 활성화되면 염색질이 decondensed 것을 나타내는 (p &lt;0.001, 학생 t 검정) 상당히 MFI 증가 항체. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> 젖 현미경 슬라이드를 사용하여 단일 세포 현탁액으로 비장을 처리하기위한도 1 기법. (A) 비장 두 현미경 슬라이드의 표면에 대하여 가압 젖된다. (B) 슬라이드 비장의 유물이 흰색 때까지 100mm 페트리 접시에 앞뒤로 서로 해제 림프구에 대한 이동합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> 비장 후에 남아 70mm 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 눌러 스토퍼 주사기를 사용하여도 2. (A) 펄프 나 레드<html> 단일 세포 현탁액으로 처리되고 70mm 세포 여과기를 통과 s는. (B) 3 ㎖ 주사기의 스토퍼 부 부드럽게 셀 스트레이너를 통해 적색 펄프 잔존 누르 사용된다. (C) 주사기를 사용한 후 거의 셀 스트레이너에 남아있는 빨간 펄프가 없어야합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> 적혈구도 3 ACK 용해. 용해 ACK로 종래 단일 마우스 비장으로부터 생성 단일 세포 현탁액 (A) 원심 분리. (B) 적혈구 ACK 용해 후, 세포 펠렛은 백색이어야한다.= &quot;_ 빈&quot;을 얻을&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> 도 4 프로토콜의 대표적인 결과. (A) 게이팅 방식은 CD4 + T 림프구에 염색질 상태를 분석하기 위해 사용했다. (B 및 C) T 세포를 방치하거나 (삼중)에서 3 시간 동안 1 ㎎ / ㎖ 수용성 항 CD3 항체로 활성화 하였다. 세포는 CD4 + 세포 (B) 및 CD8 + 세포 (C) 내의 염색질 응축을 결정하는 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 데이터 H3K4me1 염색의 평균 형광 강도의 표준 편차 ± 수단이다. * P &lt;0.001 (학생의 T- 테스트) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">시간을 클릭하세요</a>감수는이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> 표 1. 문제 해결 설명서 일반적인 문제와 가능한 해결책에 대한 빠른 참조.

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The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

유동 세포 계측법의 사용은 T 세포의 염색질의 상태를 평가하기 위해

유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

the-use-of-flow-cytometry-to-assess-the-state-of-chromatin-in-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K 조회수.  Furman University.  유동 세포 계측법하는 T 세포 내의 염색질의 상태를 평가하기 위해 이용 될 수있다. 이 프로토콜은 과학자 형광 히스톤 H3 항체의 평균 개화 강도 (MFI)의 증가에 의해 입증 T 세포 활성화시 염색질 decondensation의 기록을 해석 할 수 있도록 

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

마우스 T- 세포주에서 Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

연구

유전학

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

유동 세포 계측법에 의한 Thymic 긍정적이고 부정적인 선택의 시험

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

면역학 및 감염병학

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

케모카인 시그널링에 의해 유도 된 세포 및 분자 양극화의 신속하고 강력한 분석

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

이미징 유동 세포 계측법을 사용하여 T 세포 Alloreactivity의 측정

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

유세포분석을 사용한 마우스 뇌 히스톤 변형 정량화

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

저자 스포트라이트: 유전자 발현 조절 연구의 개선 사항

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

분리된 마우스 뇌 미세아교세포에서 핵내 유세포 분석을 사용한 글로벌 히스톤 번역 후 변형의 정량화

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