Name: the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells
Uploaded: 2015-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

Bu proje Ulusal Sağlık Enstitüleri (5 P20 RR016461 ve 8 P20 GM103499) hibe tarafından desteklenen, Ulusal Bilim Vakfı (EPS-0903795). Furman Üniversitesi Araştırma ve Mesleki Büyüme ve Furman Avantajı ödülleri tarafından sağlanan fazla destek.

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. Hayvan protokolü Furman Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (: A3242-01 İzni numarası) tarafından onaylanmıştır. Kullanılan tamponlar Tamponlar ve Çözümleri Tablo bulunabilir yaparken bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve ekipmanlar, Malzeme ve Ekipmanları Tablo bulunabilir. Fare dalaklarından Lenfositler 1. Tek Hücre Süspansiyon <ol><li> CO 2 boğulma yoluyla fareler Kurban. Servikal dislokasyon ile ötenazi onaylayın. Not: Aynı cinsiyetten (örneğin / 6 C57B) iki 6-8 haftalık izojenik farelerden alınan dalak kullanın. Tipik olarak, iki dalak işlenir. </li><li> Bolca% 70 etanol çözeltisi ve baş sola dönük öyle ki şark hayvanları püskürtün. </li><li> Forseps kullanarak, yukarı ve uzağa t hayvanın derisini kaldırınO beden. Makas kullanarak, hayvanın karın yakın deri yoluyla küçük bir çentik kesti. Parmaklarınızı kullanarak, arka ayakları başından boyundan periton maruz çentik her tarafını çekin. Dalak periton altında doğrudan görünür olmalıdır. </li><li> Forseps kullanarak, periton kaldırın ve dalak maruz küçük bir kesi yapmak. Forseps ile dalak çıkarın ve herhangi bir yağ ve bağ dokusu uzak kızdırmak için makas kullanın. </li><li> % 2 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 10 ml PBS içeren 50 ml&#39;lik bir konik tüp içine dalak yerleştirin (bundan sonra PBS + 2% &#39;si adlandırılır). Tek hücre süspansiyonu başlamak için hazır olana kadar buz üzerinde tüp tutun. Not: tipik geri kazanım dalak başına milyon 60-90 arasındaki hücreleri, ve tipik olarak, 2.000.000 hücre numune başına ihtiyaç vardır. Bir doku kültürü kaputu aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirir. </li><li> Steril 100 mm doku kültürü çanak içine dalak süzün. </li><li> T iki buzlu mikroskop slaytlar elde edilir ve basılı tutuniki kaba buzlu yüzeyler birbirlerine karşı içe bakacak şekilde o slaytlar. PBS +% 2 çözeltisi içinde slaytlar Islak petri tabak içine dökülmüştür. </li><li> Hala batık kenarları, kızakların buzlu yüzeyleri arasındaki dalak tutun ve birbirlerine (Şekil 1A) karşı ileri ve geri slaytlar hareket ettirerek yavaşça dalak öğütmek. Hücreler Petri kabı içine düşecek. Tüm hücreleri serbest ve dalak kalıntıları (Şekil 1B) beyaz görünür edilene kadar taşlama devam edin. </li><li> Bir pipet hücre süspansiyonu çizin ve yeni bir steril 50 ml konik tüp içine 70 mikron filtre ile yavaşça filtre. Kırmızı hamurun küçük parçalar filtresi (Şekil 2A) üzerinde mevcut olacağını not edin. <ol><li> Filtre yükselir, hafifçe gerekli bu süreci tekrarlayarak, sıvı süzülmesini ve 50 ml konik tüp içine geri filtreyi yerleştirin ve devam etmesi için hafifçe yukarı kaldırın. Fazla 5 sple işleme durumundaens, bu iki grup halinde bölmek ve her biri için yeni bir filtre kullanmak gerekli olabilir. </li></ol></li><li> 3 ml şırınga durdurucu kısmı kullanılarak yavaşça süzgeç (Şekil 2B) üzerinden kalan hücrelerin içeren kırmızı bir hamuru basın. Tüm kırmızı pulpa filtresi (Şekil 2C) geçti emin olmak için filtre alt ve yanları hem de basın emin olun. </li><li> Doku kültürü çanak 10 mlof PBS +% 2 ekleyin ve kalan hücrelerin kurtarmak için slaytlar, şırınga tıpa ve çanak yıkamak için kullanabilirsiniz. 50 ml konik tüp içine aynı 70 mikron hücre süzgecinden bu geçirin. Bu adımı Gerektiği kadar tekrarlayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de filtre hücre süspansiyonu santrifüj. </li><li> Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. PBS +% 2 eser miktarda bir tüp içinde kalır. Tüp Cap ve pelet tamamen yeniden süspanse kadar pelet fiske. </li><li> Reklama göre Lyse kırmızı kan hücreleriACK Liziz Tamponu Ding 2 mL (0.15 M NH4CI, 1 mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, 4 ° C &#39;de 7.2, mağaza pH) konik tüp dalak başına döndürmek ve sağlamak için tüp ters tüm hücrelerin ACK tamponu ile temas durumuna gelir. Yavaşça oda sıcaklığında 1 dakika boyunca girdap tüp. </li><li> PBS +% 2 ACK tamponu nötralize etmek için tüp ekleyerek 50 ml hücre süspansiyonu hacmi getirin. 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca tüpü 10 kez ve santrifüj ters çevirin. Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra, pelet, beyaz (Şekil 3) az olmalıdır. </li><li> Yavaşça süzün ve atın süpernatant dikkatli değil pelet rahatsız. , Tüp içinde PBS +% 2 eser miktarda bırakın tüp kap, ve onu tekrar süspansiyon pelet fiske. </li><li> T hücre ortamı [% 10 FBS, 10 mM HEPES (pH 7.0), 2 mM Glutamax, 1 mM sodyum piruvat, 1 x temel olmayan amino asitler, 1 x penisilin / streptomisin ve 50 mM β-merkaptoetanol] ve ayrıca 10 ml ekleme nazikçe tarafından pelletiniYukarı ve aşağı pipetleme. Sonra yeni 50 ml konik tüp içine yeni bir 70 mikron filtre ile süspansiyon filtre. </li><li> Orijinal tüp durulayın ve filtre hücrelerin geri kalanını içeren tüp içine 70 mikron filtre ile bu geçmek için T hücre medya başka bir 5-10 ml kullanın. Ikiden fazla dalak işleme durumunda, T-hücresi ortamı hacmi geri kazanımı maksimize etmek arttırılabilir. </li><li> Hazır boyanmış olması kadar buz üzerinde hücreleri tutun. Hücreler sayıldı ve canlılığı erişilebilir olmalıdır. <ol><li> Hücreleri saymak için, 24 PBS +% 2 ilave edildi ve 3 ml 0.4% tripan mavisi ile hücrelerin 3 ml birleştirir. Yük, gelişmiş bir Neubauer hemasitometre Her hazne içine bu 10 mi. Tripan mavisi eksklüzyonu ile değerlendirilen Canlılık,% 85-95 arasında, tipik olarak. </li></ol></li></ol> 2. Canlılık ve Yüzey Boyama <ol><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile pellet hücreleri. 1 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyona kadar, T hücresi ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri. TransfU-altlı 96-gözlü doku kültür plakasının bir oyuğuna er 2.000.000 hücreleri (100 mi). </li><li> 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika boyunca 96-kuyu plaka santrifüjleyin. </li><li> Iyi lavabonun içine plaka içindeki sıvıyı iterek her süpernatantı (hücre pelet kuyuda kalır) ve temiz bir kağıt havlu üzerine plakayı dabbing. 200 ul PBS içinde yeniden süspanse bunların hücreleri yıkayın 4 ° C &#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile takip etti. Aksi belirtilmedikçe tüm yıkar bu şekilde gerçekleştirin. Not: düzeltilebilir PI leke engel olacak şekilde PBS +% 2 kullanmayınız. </li><li> Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve her kuyuya taze hazırlanmış ticari leke (örneğin, düzeltilebilir kırmızı ölü hücre leke) 100 ml ekleyin. <ol><li> PBS içinde 1:10 seyreltilmiştir DMSO içinde reaktif boya stok çözeltisi 1:10 seyreltilmesiyle leke sağlayın. Işıktan koruyarak 30 dakika boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin plaka. </li></ol></li><li> P santrifüjGeç 4 ° C&#39;de 300 x g&#39;de 10 dakika süre ile. Ileri Bu noktada, kapalı doku kültürü kaput ışığı ile plaka ile tüm çalışmaları gerçekleştirmek. </li><li> Plaka hafifçe vurarak Süpernatantı ve sonra Fc blok çözeltisi 100 ml ekleyin. Fc blok stok çözelti 1 seyreltilmesi ile Fc blok çözüm olun: PBS içinde 100. </li><li> Seyreltik antikorlar, PBS içinde yüzeyi boyama (örneğin, anti-CD4 veya anti-CD8) kullanılmış ve her bir oyuğa 100 ml ilave edilmesi. Işıktan korunan 4 ° C &#39;de 30 dakika süre ile 96 oyuklu plaka inkübe edin. Not: Yüzey leke antikorları en iyi performans için titre edilmelidir. Üreticinin protokolü, 400 seyreltme: 200 ya da 1: Tipik haliyle, bir 1 kullanılır. </li></ol> Histon H3 3. Hücre içi Boyama <ol><li> Yüzey leke inkübe edildikten sonra, PBS içinde iki kere yıkama hücreleri. </li><li> Son yıkamadan sonra, her bir göze% 4 paraformaldehit içinde 100 ul ilave edin. Oda sıcaklığında 5 dakika için 96 oyuklu plaka inkübe edin. Olduğu zaman dilüe olabilme tarafından% 4 paraformaldehid olunPBS içinde% 16 paraformaldehit ing. Bu taze olun. </li><li> PBS içinde iki kere hücreleri yıkayın. </li><li> Perm / blokaj çözeltisi Yap (stok Perm çözeltisi PBS +% 2 civarında,% 0.02 Triton X-100, mağaza, 4 ° C) 100 ml stok Perm solüsyonu için normal tavşan serumu 2 ml karıştırılarak hazırlanır. 60 ml / numune için yeterli olun. </li><li> Hafifçe kabarcıklar yapmamaya özen, aşağı yukarı pipetleme iyi de her bir örnek için 40 ml Perm / Blok ekleyin ve karıştırın. Karanlıkta 45 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka inkübe edin. Adım 3.6 Perm / Blok kalan kaydedin. </li><li> Aşama 3.5 ayrılmış Perm / Blok çözeltisi içinde floresan konjuge Histon H3K4me1 antikor seyreltilir ve her oyuğa, bu seyreltme 10 ul ekle. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 4 ° C&#39;de 1 saat boyunca karanlıkta 96 oyuklu plaka inkübe edin. Not: Üreticinin talimatları izleyerek R-Fikoeritrin çekimi kiti kullanılarak konjuge bir H3K4me1 antikor kullanın. </li><li> Iki kez PBS +% 2 hücreleri yıkayın. </li><li> 200 hücrelerin yeniden süspansePBS +% 2 ul akış sitometri analizi için FACS tüpler örnekleri aktarın. Numuneler, karanlıkta 4 ° C&#39;de saklanabilir. Optimal sonuçlar için iki gün içinde numuneleri analiz. Tekli boyanan numuneler tazminat kontrol akış sitometrisi olarak kullanılabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Ferrada, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+surface+damage+on+cell+envelope+assesed+by+afm+and+flow+cytometry+of+lactobacillus+plantarum+exposed+to+ethanol+and+dehydration.">Study of surface damage on cell envelope assesed by afm and flow cytometry of lactobacillus plantarum exposed to ethanol and dehydration.</a> J Appl Microbiol. , (2015).</li><li>Agola, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Bead-Based+Flow+Cytometry+for+Assaying+Rab7+GTPase+Interaction+with+the+Rab-Interacting+Lysosomal+Protein+(RILP)+Effector+Protein.">Quantitative Bead-Based Flow Cytometry for Assaying Rab7 GTPase Interaction with the Rab-Interacting Lysosomal Protein (RILP) Effector Protein.</a> Methods Mol Biol. 1298, 331-354 (2015).</li><li>Toh, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+flow+cytometry+to+analyze+intracellular+location+and+trafficking+of+cargo+in+cell+populations.">Application of flow cytometry to analyze intracellular location and trafficking of cargo in cell populations.</a> Methods Mol Biol. 1270, 227-238 (2015).</li><li>Rawlings, J. S., Gatzka, M., Thomas, P. G., Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+condensation+via+the+condensin+II+complex+is+required+for+peripheral+T-cell+quiescence.">Chromatin condensation via the condensin II complex is required for peripheral T-cell quiescence.</a> EMBO J. 30, 263-276 (2011).</li><li>Lee, M. D., Bingham, K. N., Mitchell, T. Y., Meredith, J. L., Rawlings, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+is+both+required+and+sufficient+for+initiating+chromatin+decondensation+during+activation+of+peripheral+T-cells.">Calcium mobilization is both required and sufficient for initiating chromatin decondensation during activation of peripheral T-cells.</a> Mol Immunol. 63, 540-549 (2015).</li><li>Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental immunology. , (2013).</li><li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease.">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7, 690-702 (2007).</li><li>Isakov, N., Altman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C(theta)+in+T+cell+activation.">Protein kinase C(theta) in T cell activation.</a> Annu Rev Immunol. 20, 761-794 (2002).</li><li>Macian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+proteins:+key+regulators+of+T-cell+development+and+function.">NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function.</a> Nat Rev Immunol. 5, 472-484 (2005).</li><li>Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+by+calcium,+calcineurin+and+NFAT.">Transcriptional regulation by calcium, calcineurin and NFAT.</a> Genes Dev. 17, 2205-2232 (2003).</li><li>Rawlings, J. S., Rosler, K. M., Harrison, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+JAK/STAT+signaling+pathway.">The JAK/STAT signaling pathway.</a> J Cell Sci. 117, 1281-1283 (2004).</li><li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STATs:+signal+transducers+and+activators+of+transcription.">STATs: signal transducers and activators of transcription.</a> Cell. 84, 331-334 (1996).</li><li>Moriggl, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stat5+is+required+for+IL-2-induced+cell+cycle+progression+of+peripheral+T+cells.">Stat5 is required for IL-2-induced cell cycle progression of peripheral T cells.</a> Immunity. 10, 249-259 (1999).</li><li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+modifications+and+their+function.">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li></ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını var olduğunu beyan ederiz.

Biz T hücrelerinde kromatin yoğunlaşması değerlendirilmesi için izin veren bir protokol geliştirmiştir. Bu Histon H3 antikorlar saf hücrelerde kolaylıkla kendi epitoplarını erişemez basit bir gözleme dayanır fakat T hücresi aktivasyonu üzerine, bu aynı antikorlar epitoplara bağlanan edebiliyoruz. Tedavi grupları arasında MFI Histon H3 lekelenmesini karşılaştırarak, yoğunlaşma veya yoğunlaşması nispi derecede tespit edilebilir. Biz timosit geliştirme sırasında ve T hücre aktivasyonu 4 sırasında göreceli yoğunlaşma durumunu belirlemek için bu protokolü kullanılır. Biz de Dekondenzasyon sürecini 5 kontrol mekanizmaları araştırmak için bu protokolü kullanılır. Bu protokol, kromatin kondensasyonu durumunu tespit etmek için bir histon H3 antikoru kullanımına dayanır. T hücresi aktivasyonu 4 boyunca histon modifikasyon hiçbir genel değişiklik olduğundan, kromatin değerlendirmek için H3K4me1 antikor kullanabilmektedirlerBu protokolde durum. Biz değiştirilmemiş histon H3 karşı ortaya antikorlar kullandık; Ancak, üretilen sinyal çok daha zayıf genel oldu. Değiştirilmemiş histon H3 karşı antikorlar Western blot daha iyi çalışırken bizim deneyim, modifiye Histone H3 karşı yükseltilmiş antikorlar, immünofloresan daha iyi çalışması ve sitometri deneyleri akış. Biz bu teşebbüs değil, her ne kadar diğer histon proteinlere karşı antikorların kullanımı mümkün olduğuna dikkat edilmelidir. Perm / Blok ve Histone H3 antikor adımlar protokolde en kritik adımlar. Kullanılan Perm / Blok çözeltisi miktarı hazır Perm çözeltisi yapılan her optimize edilmesi gerekmektedir. Bu stok çözeltinin farklı yoğunluktaki performansının karşılaştırılması ile yapılabilir. Tipik bir deneyde, 3 saat (Şekil 4) aktive kişilerce naiv T hücrelerinde kromatin durumunu karşılaştırılmasını içerir. Bir aşkın MFI en büyük değişiklik üreten seyreltme seçmelisinizsüre analiz. Stok çözeltisi, birinci aşamada 3,5 Perm / Block ilave o zaman adım 3,4 sonrasında kadar 100 ml olarak PBS +% 2 içinde yeniden süspansiyona tarafından Perm / Blok gücünü azaltmak için PBS +% 2 seyreltilebilir. Benzer bir deney, bir pilot floresan konjuge Histon H3 antikoru, antikorun, bir yeni bir parti etiketli her defasında farklı bir dilüsyonları test etmek için kullanılır. Bu adımlar (aktivasyon 3 saat içerisinde, örneğin) ilk T hücresi aktivasyonunda kondansasyon farklılıkların başarılı bir şekilde saptanması için özellikle kritiktir. Bazen, Histon H3 antikoru ile leke yapmaz dolayısıyla permeabilize olsun ve do not hücreler vardır. Bu Perm / Blok eklerken hücreleri de yeniden süspanse değilse ne ya edebilir Perm / Blok yeterince güçlü değilse. Bu hücreler histon H3 boyanma bir histogram görüntülenmesi sırasında eksene karşı bastırdı olaylar gibi görünecektir. Genel MFI çarpık olacak bu olaylar bu yana, bu olaylar gatin tarafından analiz ihmal edilebilirg histon H3 pozitif hücrelerin normal dağılım. Ek destek Sorun Giderme Kılavuzu (Tablo 1) bulunabilir. Bir tamir edilebilir ölü hücre leke dahil tahlilinde hücre canlılığının değerlendirmesi için olanak sağlar. Bazı uyaranlara hücre ölümüne neden olabilir, çünkü T hücresi aktivasyonunu manipüle bu derece önemlidir. Böyle bir durumda, histon H3 antikoru sonuçlarının yanlış yorumlanmasına yol canlı hücrelere göre farklı ölü hücreleri histonlar bağlanabilir. Bu protokol, kromatin durum yüksek bir verim analizine izin, 96 kuyucuklu bir plaka biçiminde kullanım için tasarlanmıştır. 6-8 haftalık dişi fareden bir dalak genellikle protokolü kullanılarak milyon 60-90 arası hücreleri verecektir. Boyama protokolü örnek başına 2.000.000 hücre gerektirdiğinden, kolayca tek bir 96-çukurlu plaka tek bir dalak üç kopya halinde birden fazla tedavi grupları ve zaman noktaları test edilebilir. Bu p mümkündürörnek başına daha az hücreleri ile protokol ERFORM; Bununla birlikte, bağlı santrifüj adımları sayısı ve bu adımların her biri hücrelerin doğal kaybı, çok hücrelerin sayısını azaltmak için tavsiye edilmez. Biz başarıyla numune başına 1.000.000 hücreleri ile protokol tamamladık. Bu CD4 + T yardımcı hücreleri ve CD8 + sitotoksik T-hücrelerinde, kromatin durumunu incelemek için bu protokolü kullanılır. Protokol standardı bir yüzey boyama dahildir, bu mümkün olmaktadır. Protokolü kolay popülasyon spesifik yüzey belirteçleri karşı antikorlar kullanılarak, diğer lenfosit alt bölgesindeki kromatin incelenmesi için adapte edilebilir. Bu protokol, aynı zamanda kolayca ilgili yüzey belirteçleri tanıyan antikorlar sürece diğer hücre türleri için kullanılabilir ve uygun sabitleme / permeabilizasyon koşulları bilinmektedir olan uyarlanabilir.

Akış sitometri hücre popülasyonlarında birden fazla fiziksel ve floresan parametre analizi için geliştirilmiş bir lazer tabanlı bir teknolojidir. Bu teknoloji ile ilgili veya hücre içindeki sıvı karşılaşma akımında süspanse hücreler olarak bir lazer, heyecan verici bir floresan markör çalışır. Bu işaretler daha sonra tespit edilir ve foto-çoklayıcı tup ile belirlenir ışık yayar. Akış sitometrisi, geleneksel hücre popülasyonları tanımlamak için kullanılmış olsa da, bu, hücre zarı bütünlüğünün, protein-protein etkileşimleri ve protein değiş 1-3 dahil olmak üzere hücre özelliklerinin bir dizi incelenirken yararlı bir teknoloji olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknolojisi, in vitro 4&#39;te aktive T hücrelerinde kromatin durumunu tespit etmek için kullanılabilir sağlayan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca T hücrelerinin 5 aktivasyonu ile uyarılan kromatin yoğunlaşması mekanizmasını araştırmak için bu protokolü kullanılır. T hücresi activation ve proliferasyonu uygun bir immün tepkisi için kritik öneme sahiptir. T hücreleri, bağışıklık sistemi içinde lenfositlerin belirli bir alt grubu, uygun bağışıklık tepkilerinin ve immünolojik hafızanın geliştirilmesi için gereklidir. Bir antijen (6 gözden) hareketsiz T hücrelerinin hücre dışı yüzeyinde yer alan, T hücre reseptörünün (TCR), başlıca uyumluluk kompleksi içinde mevcut olduğunda Aktivasyon başlatılır. Bu hücre içi Ca2 + konsantrasyonu 7 ve (8-10 gözden) aktivasyonu için gerekli transkripsiyon faktörlerinin nükleer translokasyonunun bir artışa sonuçlanan T hücreleri içinde, dinamik ve çok düzenli moleküler olaylar dizisi tetikler. Bir kez, T hücreleri, interlökin-2 (IL-2), JAK (Janus Kinaz) / STAT kullanan güçlü bir büyüme faktörü yanıt yeteneği kazandırmak aktif (sinyal ileticisi ve bir aktivatör) yolu aktive T klonal proliferasyonunu tahrik etmek Hücreler 11. Kısaca, IL-2 ile uyarılması,STAT proteinleri latent sitosolik transkripsiyon faktörü ailesinin bir fosforilasyon ile sonuçlanır. Fosforile sonra STAT proteinleri dimerize, nükleuslar transloke edilebilir ve hücre döngüsü ilerlemesinde yer de dahil olmak üzere gen ekspresyonunu tahrik. T hücrelerinde, T hücre çoğalması için gerekli olan 12,13 STAT5 yoluyla, IL-2 sinyaller. Aktive edilmiş T hücrelerinin klonal genişlemesini sağlamak için, antijen TCR nişan (naif T hücreleri) yaşamamış bu hücrelerin, IL-2 için güçlü etkileri göz ardı etmek için bir mekanizma olmalıdır. Bu kromatin durumunun düzenlenmesi yoluyla elde edilir. Saf T hücreleri, IL-2 bir uyarıya yanıt olarak STAT5 DNA nişan yasaklayan bir yoğunlaştırılmış kromatin sahiptirler. Aktivasyonu üzerine, kromatin decondenses ve STAT5 klonal proliferasyonunu 4 izin hedef genlerin promotörleri erişebilir. İlginç bir şekilde, kromatin durumundaki bu değişiklik histon protein, epigenetik modifikasyonu bağımlı değildirns (inceleme için, 14 bakınız) Ayrıca T-hücresi aktivasyonu sırasında 4 histon modifikasyonu hiçbir genel bir değişiklik görüldüğü gibi. Bu çalışmaları gerçekleştirirken, biz histon proteinlerine karşı yükseltilmiş antikorlar da naif hücrelerde kendi epitopları erişim zorluk olduğunu keşfetti, ama aktivasyon üzerine bu daha kolay kendi epitopları 4 bağlamak olabilir. Bu nedenle, histon, antikor kromatin yoğunlaşması durum için bir okuma olarak hizmet vermektedir. Burada yöntem, T hücrelerinin kromatin durumunu değerlendirmek için floresan konjuge Histon H3 antikorları tespit etmek için akış sitometrisi kullanımı sunulmaktadır. Bir hücre popülasyonunda kromatin kondensasyonu Histon H3 boyama ortalama florasan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. Kromatin dekondenzasyon anlamına T hücresi aktivasyonu, Histone H3 boyama artar MFI, bağlamında. Hücre içi Histon H3 boyama ile kromatin durumunu ölçülmesine ek olarak, bu protokol, aynı zamanda incorporates hücre alt popülasyonlarının analizini izin, boyama ve canlı hücreler için bir fixable leke yüzey.

<table><tbody><tr><td>100 mm tissue culture dish</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Precleaned frosted microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 70 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe, Luer-Lok tip</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml polypropylene conical tube</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable red dead cell stain kit</td><td>Life Technologies</td><td>L23102</td><td>Life Technologies sells versions of this kit with different colors</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Normal rabbit serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H3K4me1 antibody</td><td>Abcam</td><td>ab8895</td><td></td></tr><tr><td>R-Phycoerythrin conjugation kit</td><td>Abcam</td><td>ab102919</td><td>Alternatively, the LYNX rapid RPE kit from AbD Serotec can be used</td></tr></tbody></table>

the use of flow cytometry to assess the state of chromatin in t cells

Uygun bir immün tepkisi sırasında hareketsiz T hücrelerinin, antijen-spesifik T hücre reseptörü antijen sunma üzerine aktive olmaktadır. Bu antijeni tanıyan bir reseptör taşıyan yalnızca T hücrelerinin klonal bir çoğalmaya neden olur. Kromatin Dekondenzasyon T hücre aktivasyonunun bir özelliğidir ve T hücreleri antijen nişan sonra çoğalmaya yeteneği kazanmak için gereklidir. Kromatin yoğunlaşması bu değişiklik, histon proteinlere karşı antikorlar kullanılarak tespit edilebilir. Bu antikorlar aktive T hücreleri yanı olabildiğince naif T hücrelerinin kendi epitoplara bağlanan olamaz. Biz aynı anda fixable ölü hücre leke T hücre-spesifik yüzey belirteçleri, parça canlılığını leke ve Histone H3 proteinlerinin hücre içi boyama yoluyla kromatin durumunu ölçmek için nasıl açıklar. Boyanmış hücreler akış sitometrisi ile analiz edilir ve kromatin kondensasyonu durumu Histon H3 leke ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak ölçülür. ChromatT hücresi aktivasyonu sırasında yoğunlaşması olarak MFI bir artış olarak gösterilmiştir

Bir C57B / 6 fare lenfositler protokole göre tek bir hücre süspansiyonu içine işlenmiş ve standart bir hemasitometre kullanılarak sayıldı. Hücreler 2 x 10 T-hücresi ortamında, 6 / ml 15 ml&#39;lik üç kopya halinde konik tüpler tohumlandı ve tedavi edilmezse, ya da 37 ° C &#39;de 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünür anti-CD3 antikorları (klon 4C11) ile uyarıldı standart bir doku kültürü kuluçka makinesine kondu. Ölü hücreler boyandı ve daha sonra hücreler, daha sonra protokole göre FITC CD8 ve CD4 APC-antikorları kullanılarak boyandı sathı edildi. Histone erişilebilirlik akış sitometri (Şekil 4) ile analiz edilmiştir. Her iki naif CD4 + ve CD8 + T hücreleri, ortalama floresan yoğunluğu (MFI) bir yoğunlaştırılmış kromatin durumunu gösteren, düşüktür. Hücreler, anti-CD3 ile aktif hale zamanda kromatin yoğunluğu azaltılmış olduğunu göstermektedir (p &lt;0.001, Student t-testi) belirgin bir MFI artar antikorlar. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533fig1.jpg" /> Buzlu mikroskop slaytlar kullanarak tek bir hücre süspansiyonu içine dalak işlemek için Şekil 1. Tekniği. (A) dalak iki mikroskop slaytlar buzlu yüzeylerde bastırılır. (B) slaytlar dalak kalıntıları beyaz olana kadar 100 mm Petri kabı içine ileri geri birbirlerine serbest lenfositler karşı taşınır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig2.jpg" /> Bir dalak sonra kalan 70 mm&#39;lik hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın bir şırınga tıpa kullanılması Şekil 2. (A). Kırmızı hamuru i<html> tek bir hücre süspansiyonu içine işlenir ve 70 mm&#39;lik bir hücre süzgecinden geçirildi s. (B) 3 ml&#39;lik şırınga durdurucu kısmı hafifçe hücre süzgecinden kırmızı hamuru kalan basın için kullanılır. (C) şırınga kullandıktan sonra, neredeyse hücre süzgecinden sol hiçbir kırmızı hamuru olmamalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig3.jpg" /> Kırmızı kan hücrelerinin Şekil 3. ACK lisiz. Lizizi ACK önce tek bir fare dalak oluşturulan tek bir hücre süspansiyonu (A) Santrifüj. (B), kırmızı kan hücrelerinin lize ACK sonra hücre topağı beyaz olmalıdır.= &quot;_ blank&quot; olsun&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/53533/53533fig4.jpg" /> Şekil protokolünün 4. Temsilcisi sonuçları. (A) Ayırıcı şeması CD4 + T lenfositleri kromatin durumunu analiz etmek için kullanılır. (B ve C) T hücreleri tedavi edilmediği ya da (üç kopya halinde), 3 saat boyunca 1 mg / ml çözünebilir anti-CD3 antikorları ile aktive edildi. Hücreler daha sonra CD4 + hücreleri (B) ve CD8 + hücreleri (C) kromatin yoğunlaşması belirlemek için akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Veri H3K4me1 boyamanın ortalama floresan yoğunluğu Standart Sapma ± araçlardır. * p &lt;0.001 (Öğrenci t testi) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53533/53533fig4large.jpg" target="_blank">h tıklayınız</a>ere bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için. <img alt="tablo 1" src="/files/ftp_upload/53533/53533table1.jpg" /> Tablo 1:. Sorun Giderme Kılavuzu ortak sorunları ve olası çözümleri hızlı bir başvuru.

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells at JoVE.com

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

the-use-of-flow-cytometry-to-assess-the-state-of-chromatin-in-t-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.8K Görüntüleme.  Furman University.  Akış sitometri T hücreleri içinde kromatin durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu protokol, bilim adamları, floresan Histon H3 antikorların ortalama florasan yoğunluğu (MFI) bir artış gösterdiği, T hücresi aktivasyonu sırasında kromatin yoğunlaşması kanıt yorumlama sağlar 

Video: The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the T cell receptor (TCR) &alpha; and &beta; loci generates a T cell repertoire with vast diversity in antigen specificity, both to self and foreign. Selection of the repertoire during development in the thymus is critical for generating safe and useful T cells. Defects in thymic selection contribute to the development of autoimmune and immunodeficiency disorders1-4. 
T cell progenitors enter the thymus as double negative (DN) thymocytes that do not express CD4 or CD8 co-receptors. Expression of the &alpha;&beta;TCR and both co-receptors occurs at the double positive (DP) stage. Interaction of the &alpha;&beta;TCR with self-peptide-MHC (pMHC) presented by thymic cells determines the fate of the DP thymocyte. High affinity interactions lead to negative selection and elimination of self-reactive thymocytes. Low affinity interactions result in positive selection and development of CD4 or CD8 single positive (SP) T cells capable of recognizing foreign antigens presented by self-MHC5.
Positive selection can be studied in mice with a polyclonal (wildtype) TCR repertoire by observing the generation of mature T cells. However, they are not ideal for the study of negative selection, which involves deletion of small antigen-specific populations. Many model systems have been used to study negative selection but vary in their ability to recapitulate physiological events6. For example, in vitro stimulation of thymocytes lacks the thymic environment that is intimately involved in selection, while administration of exogenous antigen can lead to non-specific deletion of thymocytes7-9. Currently, the best tools for studying in vivo negative selection are mice that express a transgenic TCR specific for endogenous self-antigen. However, many classical TCR transgenic models are characterized by premature expression of the transgenic TCR&alpha; chain at the DN stage, resulting in premature negative selection. Our lab has developed the HYcd4 model, in which the transgenic HY TCR&alpha; is conditionally expressed at the DP stage, allowing negative selection to occur during the DP to SP transition as occurs in wildtype mice10.
Here, we describe a flow cytometry-based protocol to examine thymic positive and negative selection in the HYcd4 mouse model. While negative selection in HYcd4 mice is highly physiological, these methods can also be applied to other TCR transgenic models. We will also present general strategies for analyzing positive selection in a polyclonal repertoire applicable to any genetically manipulated mice.

We present a flow cytometry-based method to examine T cell development in vivo using genetically manipulated mice on a wildtype or T cell receptor transgenic background.

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

A healthy immune system requires that T cells respond to foreign  antigens while remaining tolerant to self-antigens. Random rearrangement of the  T cell ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Rapid and Robust Analysis of Cellular and Molecular Polarization Induced by Chemokine Signaling

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many proteins. Classic imaging techniques have been used to study these phenomena. However, they required the manual acquisition of many cells followed by time consuming quantification of the morphology and the co-localization of the staining of tens of cells. Here, a rapid and powerful method is described to study these phenomena on samples consisting of several thousands of cells using an imaging flow cytometry technology that combines the advantages of a microscope with those of a cytometer. Using T lymphocytes stimulated with CCL19 and staining for MHC Class I molecules and filamentous actin, a gating strategy is presented to measure simultaneously the degree of shape alterations and the extent of co-localization of markers that are affected by CCL19 signaling. Moreover, this gating strategy allowed us to observe the segregation of filamentous actin (at the front) and phosphorylated Ezrin-Radixin-Moesin (phospho-ERM) proteins (at the rear) in polarized T cells after CXCL12 stimulation. This technique was also useful to observe the blocking effect on polarization of two different elements: inhibition of actin polymerization by a pharmacological inhibitor and expression of mutants of the Par6/atypical PKC signaling pathway. Thus, evidence is shown that this technique is useful to analyze both morphological alterations and protein redistributions.

Chemokine signaling elicits marked alterations of cellular morphology and some important redistributions of intracellular proteins. Here, a rapid and detailed protocol is provided to study these events.

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Cells respond to chemokine stimulation by losing their round shape in a process called polarization, and by altering the subcellular localization of many ...

Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal of immunosuppression. The mixed leukocyte reaction (MLR), limiting dilution assays, and trans-vivo delayed-type hypersensitivity (DTH) assay have all been applied to this question, but these methods have limited predictive ability and/or significant practical limitations that reduce their usefulness. Imaging flow cytometry is a technique that combines the multiparametric quantitative powers of flow cytometry with the imaging capabilities of fluorescent microscopy. We recently made use of an imaging flow cytometry approach to define the proportion of recipient T cells capable of forming mature immune synapses with donor antigen-presenting cells (APCs). Using a well-characterized mouse heart transplant model, we have shown that the frequency of in vitro immune synapses among T-APC membrane contact events strongly predicted allograft outcome in rejection, tolerance, and a situation where transplant survival depends on induced regulatory T cells. The frequency of T-APC contacts increased with T cells from mice during acute rejection and decreased with T cells from mice rendered unresponsive to alloantigen. The addition of regulatory T cells to the in vitro system reduced prolonged T-APC contacts. Critically, this effect was also seen with human polyclonally expanded, naturally occurring regulatory T cells, which are known to control the rejection of human tissues in humanized mouse models. Further development of this approach may allow for a deeper characterization of the alloreactive T-cell compartment in transplant recipients. In the future, further development and evaluation of this method using human cells may form the basis for assays used to select patients for immunosuppression minimization, and it can be used to measure the impact of tolerogenic therapies in the clinic.

This paper describes a method for measuring alloreactivity in a mixed population of T cells using imaging flow cytometry.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

The measurement of immunological reactivity to donor antigens in transplant recipients is likely to be crucial for the successful reduction or withdrawal ...

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular components responsible for supplying cell energy; however, excess mitochondria also produce reactive oxygen species (ROS) that could cause cell death. Therefore, the number of mitochondria must constantly be adjusted to fit the needs of the cells. This dynamic regulation is achieved in part through the function of lysosomes that remove surplus/damaged organelles and macromolecules. Hence, cellular mitochondrial and lysosomal contents are key indicators to evaluate the metabolic adjustment of cells. With the development of probes for organelles, well-characterized lysosome or mitochondria-specific dyes have become available in various formats to label cellular lysosomes and mitochondria. Multicolor flow cytometry is a common tool to profile cell phenotypes, and has the capability to be integrated with other assays. Here, we present a detailed protocol of how to combine organelle-specific dyes with surface markers staining to measure the amount of lysosomes and mitochondria in different T cell populations on a flow cytometer.

This article illustrates a powerful method to quantify mitochondria or lysosomes in living cells. The combination of lysosome- or mitochondria-specific dyes with fluorescently conjugated antibodies against surface markers allows the quantification of these organelles in mixed cell populations, like primary cells harvested from tissue samples, by using multicolor flow cytometry.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

Flow Cytometric Characterization of Murine B Cell Development

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells have been isolated and developed into well-established therapeutics. Validation of murine B cell development, in the context of autoimmune prone mice, or in mice with modified immune systems, is a crucial component of developing or testing therapeutic agents in mice and is an appropriate use of flow cytometry. Well established B cell flow cytometric parameters can be used to evaluate B cell development in the murine peritoneum, bone marrow, and spleen, but a number of best practices must be adhered to. In addition, flow cytometric analysis of B cell compartments should also complement additional readouts of B cell development. Data generated using this technique can further our understanding of wild type, autoimmune prone mouse models as well as humanized mice that can be used to generate antibody or antibody-like molecules as therapeutics.

We describe herein a simple analysis of the heterogeneity of the murine immune B cell compartment in the peritoneum, spleen, and bone marrow tissues by flow cytometry. The protocol can be adapted and extended to other mouse tissues.

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Extensive studies have characterized the development and differentiation of murine B cells in secondary lymphoid organs. Antibodies secreted by B cells ...

A DNA/Ki67-Based Flow Cytometry Assay for Cell Cycle Analysis of Antigen-Specific CD8 T Cells in Vaccinated Mice

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine (BrdU) marks cells that are in or recently completed S-phase, and carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) detects daughter cells after division. However, these dyes do not allow identification of the cell cycle phase at the time of analysis. An alternative approach is to exploit Ki67, a marker that is highly expressed by cells in all phases of the cell cycle except the quiescent phase G0. Unfortunately, Ki67 does not allow further differentiation as it does not separate cells in S-phase that are committed to mitosis from those in G1 that can remain in this phase, proceed into cycling, or move into G0.
Here, we describe a flow cytometric method for capturing a &#34;snapshot&#34; of T cells in different cell cycle phases in mouse secondary lymphoid organs. The method combines Ki67 and DNA staining with major histocompatibility complex (MHC)-peptide-multimer staining and an innovative gating strategy, allowing us to successfully differentiate between antigen-specific CD8 T cells in G0, in G1 and in S-G2/M phases of the cell cycle in the spleen&#160;and draining lymph nodes of mice after vaccination with viral vectors carrying the model antigen gag of human immunodeficiency virus (HIV)-1.
Critical steps of the method were the choice of the DNA dye and the gating strategy to increase the assay sensitivity and to include highly activated/proliferating antigen-specific T cells that would have been missed by current criteria of analysis. The DNA dye, Hoechst 33342, enabled us to obtain a high-quality discrimination&#160;of the G0/G1 and G2/M DNA peaks, while preserving membrane and intracellular staining. The method has great potential to increase knowledge about T cell response in vivo and to improve immuno-monitoring analysis.

Clonal expansion is a key feature of antigen-specific T cell response. However, the cell cycle of antigen-responding T cells has been poorly investigated, partly because of technical limitations. We describe a flow cytometric method to analyze clonally expanding antigen-specific CD8 T cells in spleen and lymph nodes of vaccinated mice.

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

The cell cycle of antigen-specific T cells in vivo has been examined by using a few methods, all of which possess some limitations. Bromodeoxyuridine ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Biyoloji

Akış Sitometrisi Kullanılarak Fare Beyni Histon Modifikasyonu Miktar Tayini

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

Yazar Spotlight: Gen İfadesi Düzenleme Araştırmasındaki Gelişmeler

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...

Akış Sitometrinin Kullanımı T Hücrelerinde Kromatin Devleti değerlendirmek için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Kemokin Sinyalizasyonu Bağlı Hücresel ve Moleküler Polarizasyon Hızlı ve Sağlam Analizi

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Murine B Hücre Gelişiminin Akış Sitometrik Karakterizasyonu

Aşılanmış Farelerde Antijene Özgü CD8 T Hücrelerinin Hücre Döngüsü Analizi için DNA/Ki67 Tabanlı Akış Sitometrisi Tahlili

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini

İzole Fare Beyni Mikrogliasında İntranükleer Akış Sitometrisi Kullanılarak Global Histon Post Translasyonel Modifikasyonların Miktar Tayini