Los autores desean agradecer al Centro Bloomington de valores, Liqun Luo, Charles Zuker, y Lily y Yuh Nung Jan como la generosa distribución de las poblaciones de la mosca y la siguiente para su financiación: SOMAS-URM (JD y SW), Licenciado Ford Facultad Summer Fellowship (SW), BD Corporación Summer Research Fellowship (a CL y DL), El Renee y Anthony M. Marlon, MD &#39;63 Summer Research Fellowship (DL) James C. &#39;75 y Jane Colihan verano Becas de Investigación (A) a través de los Antiguos Alumnos / Padres Fondo de Investigación de Verano de la Universidad de la Santa Cruz y la Fundación de Investigación de Verano Stransky Fellowship (TO). Un agradecimiento especial al Departamento de Biología y la Oficina del Decano de Colegio de la Santa Cruz por el apoyo de todo el trabajo en el laboratorio.

1. Los cruces de generar moscas MARCM <ol><li> Mantener moscas en medios de harina de maíz melaza (6,5 g / L de agar; 23.5 g / L de levadura; 60 g / L de harina de maíz, 60 ml de melaza / l; 4 ml / mezcla de ácido L; 0,13% Tegosept) o medios de comunicación estándar de Drosophila a 22 grados Celsius en una luz de 12 h / oscuridad ciclo. Nota: A Inferior a temperatura estándar se utiliza para mantener MARCM stocks saludable. Esto amplía el tiempo de desarrollo entre el huevo y la edad adulta a 14 días. </li><li> Utilice hembras vírgenes (aproximadamente 1 - 8 días de edad) de una población-MARCM listo que contiene los elementos genéticos necesarios (GFP bajo el control de una secuencia de activación aguas arriba (UAS-GFP), la proteína represora GAL80, el factor de transcripción Gal4, una choque térmico recombinasa impulsada, y un sitio de recombinación FRT). Nota: Nuestro MARCM listos stocks contienen los siguientes genotipos: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / CyO; tubGal4 / TM3Sb. Nota: El sitio FRT específico dependerá de la localización de la mutaciónen el genoma. Por ejemplo, FRT40A se utiliza para probar las mutaciones en el brazo izquierdo del cromosoma 2, como NOMPC (ver 10 para obtener más detalles sobre los protocolos MARCM). </li><li> Cross-MARCM listo hembras vírgenes a los varones que contienen una mutación de interés y su sitio FRT correspondiente (por ejemplo, en peso; NOMPC3, FRT40A / CYO; + / +). Para controlar para la inducción MARCM eficaz, establecer una segunda cruz usando las moscas macho que contienen el mismo sitio de FRT, pero sin una mutación. Utilice una relación aproximada de 5 hembras: 1 masculina en cruces. </li></ol> 2. Programado Huevo Acostado <ol><li> Después de permitir que las moscas para aparearse durante al menos una noche, mover adultos en nuevos viales con medio fresco. Permitir a las moscas a poner huevos en un ambiente oscuro durante aproximadamente 4 horas antes de transferir nuevamente las cruces en nuevos viales. Tenga en cuenta los tiempos de inicio y fin del período de puesta de huevos. Nota: Los intervalos más cortos son aceptables cuando parece que hay un alto número de huevos en los medios de comunicación antes de la final de la InterVA 4-hrl. <ol><li> Mantenga los frascos con un número suficiente de huevos (aproximadamente es mayor de 20) y almacenar en una luz de 12 h / oscuridad ciclo a 22 grados Celsius a ser calor conmocionado después. Nota: Frascos con un bajo número de huevos en los medios de comunicación (menos de aproximadamente el 20) es poco probable que producir un número suficiente de moscas adultas para las pruebas de comportamiento, y en aras de la eficiencia, se recomienda que no se conservarán para su análisis posterior. Nota: Nuestros moscas se crían con las luces encendidas 08 a.m.-8 p.m.. Hemos encontrado el tiempo de la tarde puntos conducen a densidades más altas de huevo, por lo tanto, por lo general realizar cruces cronometrados entre 4-8 pm y 20:00 medianoche. Las moscas ponen sus huevos a temperatura ambiente en un armario oscuro y luego se devuelven a la incubadora al día siguiente con el fin de no perturbar el ciclo luz-oscuridad regular en la incubadora. </li></ol></li></ol> 3. Realice choque térmico para inducir recombinación mitótica <ol><li> Aproximadamente 85 a 100 horas después de la puesta de huevos, lugar vmate- en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 1 hora. Asegúrese de que el nivel del agua alcanza por encima de la altura de los medios de comunicación en los viales, pero no anula completamente los viales para evitar que las larvas de ahogarse. </li><li> Retirar los viales del baño de agua y permitir un período de recuperación de 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Coloque los viales de nuevo en 37 grados centígrados baño de agua durante 1 hora. </li><li> Retire los viales de baño de agua y almacenar en la incubadora de 12 horas de luz / oscuridad ciclo a los 22 grados Celsius, hasta la eclosión. </li></ol> 4. Preparación para las pruebas de comportamiento <ol><li> Tras la eclosión, anestesiar las moscas en el hielo. Seleccione moscas con genotipos que contienen todos los elementos genéticos para MARCM e indican probablemente se observaron clones de expresión marcadas GFP a partir de los marcadores fenotípicos observables utilizados en las existencias de los padres. Decapitar a las moscas con iridectomía tijeras. Nota: Por ejemplo, hemos seleccionado para las moscas sin los marcadores genéticos CyO (alas rizadas) y Sb (cerda rastrojo) para identimoscas fy que contener todos los elementos genéticos necesarios para crear regiones de mosaico marcadas con GFP. Nota: La decapitación es necesario para prevenir los adultos a partir de volar lejos cuando son estimuladas. </li><li> Coloque moscas sin cabeza en un ambiente cerrado, húmedo y permitir que aproximadamente el 10 - 20 h de recuperación. Sólo uso vuela sí mismos ese derecho cuando perturbado para su análisis posterior. Prueba vuela dentro de 30 horas de la decapitación. </li></ol> 5. Pruebas de Comportamiento <ol><li> Mediante la observación de las moscas decapitados bajo un microscopio de fluorescencia de disección, identificar clones homocigotos marcados con GFP en los órganos sensoriales externas de cerdas. Registre el nombre de cerdas y el lado izquierdo o derecho. Para eliminar cualquier sesgo potencial, el miembro del laboratorio que realiza la estimulación de cerdas debe ser ciego al genotipo de la cerda, de tipo salvaje o mutante. </li><li> Provocar un reflejo de aseo desviando la GFP marcado cerdas hacia el cuerpo de la mosca con un pelo tieso o unas pinzas finas y observar la pierna rerespuesta. Dar una puntuación de uno a moscas que levantan la pierna en respuesta a la estimulación de cerdas y una puntuación de cero a las moscas que no se mueven sus piernas. Nota: Previo estudios 6,7 han caracterizado la respuesta de la pierna que está provocada por la estimulación de una cerda en particular. Esto incluye la pierna que responde a cada cerda y la proporción de moscas que responden a la estimulación de ese cerdas particular. Sólo nos marcamos para los movimientos de la pierna que esperábamos para responder en base a la clasificación de Vandervorst 6. </li><li> Llevar a cabo cinco ensayos espaciados 2 minutos de diferencia. </li></ol>

<ol>
	<li>Gr&#252;nert, U., Gnatzy, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=K++and+Ca+++in+the+receptor+lymph+of+arthropod+cuticular+mechanoreceptors.">K+ and Ca++ in the receptor lymph of arthropod cuticular mechanoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 161, 329-333 (1987).</li><li>Kernan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+and+auditory+transduction+in+Drosophila.">Mechanotransduction and auditory transduction in Drosophila.</a> Pflugers Arch. 454, 703-720 (2007).</li><li>Gillespie, P. G., Walker, R. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel.">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li><li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation.">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li><li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels.">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li><li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+in+mechanosensation:+direct+or+indirect+activation?.">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion.">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+TRPN(=NOMPC)+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia.">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012 (2010).</li><li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOMPC,+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family,+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells.">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li><li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system.">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li><li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+mechanosensation+using+the+fly.">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li></ol>

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Este protocolo utiliza un ensayo de comportamiento adulto para la detección de mutaciones que afectan mechanosensation en Drosophila. Debido a que la colección de mutantes contiene letales mutaciones p-elemento que impida la detección como adultos, este protocolo hace uso de una técnica genética compleja primero descrito por Lee y Luo , (1999) y detallada como un protocolo por Wu y Luo, (2006) para eludir la letalidad adulto. MARCM induce la recombinación mitótica entre cromosomas homólogos para generar...

Humans rely on the ability to convert mechanical stimuli from their environment, such as touch, pressure, vibration, or sound waves, into sensory information that can be processed by the nervous system, in a process termed mechanotransduction. Many of the overall mechanistic features of mechanotransduction between humans and invertebrates are the same1, making Drosophila a useful model to study the molecular mechanisms of mechanotransduction. Drosophila melanogaster contain two sets of specialized sensory organs (Type I and II) that are capable of converting mechanical stimuli into action potentials. Type I mechanoreceptors have a neuron with a single dendrite or sensory process, surrounded by three support cells2. The Type I mechanoreceptors include bristle mechanoreceptors, hearing sensitive chordotonal organs (the Johnston's organ), and campaniform sensilla that convey information about wing beats3. The bristles that cover the dorsal side of the fly are the most abundant and easily accessible of the Type I organs. Similar to the extracellular environment of hair cells associated with hearing and balance in vertebrates, the support cells surrounding fly mechanosensitive neurons secrete a high potassium endolymph that creates an unusual concentration gradient for potassium1. Mechanosensitive neurons, of both the mammalian and fly systems, utilize this high extracellular potassium to depolarize the cell. In response to mechanical stimulation of the macrochaete bristles towards the body wall, the sensory neurons respond with a burst of action potentials driven by this potassium depolarization of the cell membrane4. The Drosophila sensory neurons that innervate bristles resemble the mechanosensitive cells of other organisms, including vertebrate hair cells, in both structure and function1,5. The accessibility of Drosophila external sense organs to experimental manipulation and the abundance of genetic techniques available to researchers make Drosophila an excellent model system to investigate the molecular underpinnings of mechanosensation. 
In the fly, stimulation of a single sensory neuron that innervates a bristle leads to an observable behavioral response. Stimulation of different bristles evokes specific, reproducible behavioral responses, depending on the bristle that is stimulated. Upon tactile stimulation, decapitated wild-type flies exhibit a complex grooming reflex wherein they clean the area near the stimulated bristle with a patterned set of leg movements5-7. When homozygous for known single-gene mutations that interfere with learning7 or coordination and locomotor activity5, flies respond abnormally to mechanical stimulation. This grooming reflex is therefore a useful tool to study the effects of single-gene mutations on a specific, replicable behavior.
The robust behavioral response to stimulation of a single macrochaete bristle holds the potential to assist in identifying new genes involved in mechanotransduction. This protocol being used to test a collection of mutant flies for the absence of a behavioral response to indicate that the mutation interferes with mechanosensation. In the mutant collection selected for screening, the mutations cause lethality before adulthood, and therefore would be impossible to test using traditional adult behavior screens. Originally, this collection of lethal p-elements was combined with FRT recombination sites to test cell growth defects in clones. The clones were made specifically in the eye because adult flies can survive in the lab setting without functional vision8. However, removal of all mechanosensation can cause adults to be severely uncoordinated or die before eclosion5. This protocol uses a mosaic approach to circumvent the lethality of the mutations and allow for adult stage testing. A genetic technique called Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM)9 is used to generate homozygous mutant cells in a limited number of adult fly sensory organs, while the rest of the organism remains heterozygous. These MARCM flies readily survive until adulthood, yet the bristles are homozygous for the lethal genes of interest.
MARCM allows for regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP), while the rest of the organism remains heterozygous at that particular locus and unmarked9. MARCM combines individual p-element mutations with five common genetic elements: GFP under the control of an upstream-activating sequence (UAS-GFP), Gal80 repressor protein under control of a general promoter (tub-Gal80), Gal4 transcription factor under control of a general promoter (tub-Gal4), the FRT recombinase enzyme expressed through a heat-shock controlled promoter, and a FRT recombination site10. By driving mitotic recombination through a heat-shock activated recombinase, a limited number of cells are made homozygous for the mutation and marked with GFP. GFP expression is repressed in heterozygous cells by the presence of Gal80 on the wild-type copy of the chromosome. 
A heat-shock protocol for MARCM was optimized to induce recombination in the fly bristle external sense organs, while much of the organism remains heterozygous, and thus unmarked with GFP. Mosaic flies generated using this protocol contained homozygous mutations most frequently in the post alar or dorsal central bristles on the surface of the notum. 
We have tested the utility of this combination of MARCM and the grooming behavior screen with a known mechanosensitive mutant, NOMPC. The ion channel, no mechanoreceptor potential C (NOMPC), is an essential component of the mechanotransduction pathway in Drosophila5,11-13. NOMPC belongs to the transient receptor potential (TRP) superfamily of cation channels5 and satisfies all of the criteria to qualify as a mechanosensitive channel in Drosophila14,15: 1) NOMPC is expressed in the ciliate tips of type 1 sensory neurons of Drosophila 13,16-18, 2) NOMPC null larvae do not have an electrical response to tactile stimulation13, 3) Ectopic expression of NOMPC in touch insensitive cells can induce sensitivity to mechanical stimulation13, 4) heterologous expression of NOMPC in Schneider 2 cells yields a mechanosensitive channel13, and 5) NOMPC adult mutants display defects in their response to mechanical stimulation5. Given this evidence, we predicted that NOMPC mutant clones would show an altered or inhibited grooming response in response to mechanical stimulation of bristles.
A MARCM-stock containing the NOMPC mutation was developed for use in a proof of principle experiment of the grooming assay. Mosaic flies were stimulated at macrochaete bristles containing homozygous NOMPC mutant cells. We expected an inhibition of the grooming response following stimulation of the macrochaete bristle. We found that only 2 of 14 mutant bristle flies tested gave a single response to repeated stimulation; most did not respond to stimulation of the homozygous mutant bristle. Having confirmed that this MARCM-based behavioral assay produces an abnormal grooming reflex in a known mechanosensitive mosaic mutant, this technique can be used in a screen for additional mechanosensitive mutations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Brewers Yeast (25 lb)</td>
			<td style="width:163px;">MP Biomedicals&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ICN90331225&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Corn (25lb)</td>
			<td style="width:163px;">MP Biomedicals&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ICN90141125&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Agar (1lb)</td>
			<td style="width:163px;">MoorAgar Inc.</td>
			<td style="width:163px;">41004</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Tegosept (5kg)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">20-259</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Molasses (1Gallon)</td>
			<td style="width:163px;">Sugarmill Brand - Thomsen Food Service</td>
			<td style="width:163px;">0 2625</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Propionic Acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">A258-500</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Phosphoric acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">A260-500</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Drosophila Vials, Narrow (PS)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">32-109</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">6oz Square Bottom Bottle (PP)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">32-130</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Flugs - Plastic Fly Bottles</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">49-100</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Rayon Balls, Large</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">51-100</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Droso-Filler, Narrow</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">59-168</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Droso-Filler, Bottles</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">59-170</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:163px;">8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount&#160; 1/15HP, 700RPM variable speed, 115V, 50/60Hz</td>
			<td style="width:163px;">Cleveland Mixer</td>
			<td style="width:163px;">8A-C</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Water jacketed Kettle</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Diurnal Growth Chamber</td>
			<td style="width:163px;">Forma Scientific</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">Temperature and light/dark cycle controlled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Water bath</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">For heat shock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MicroScissors&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">&#160;15000-08</td>
			<td style="width:163px;">For removing heads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fluroscence Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">SteREO Discovery V8&#160;</td>
			<td style="width:163px;">With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Fluroscence Light Source</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">X-Cite 120</td>
			<td style="width:163px;">Fiber optic light pipe makes this easy to configure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Camera for Scope</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">AxioCam ICc1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Image acquistion software</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for cold anthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Homemade cold anthesia tray</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for cold anthesia decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Plastic boxes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for recovery of decaptitated flies in humid environment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a behavioral assay for mechanosensation of marcm-based clones in drosophila melanogaster

Debido a la homología estructural y funcional de las células pilosas del oído interno de los mamíferos, las neuronas que inervan los órganos de los sentidos externos de Drosophila proporcionan un excelente sistema modelo para el estudio de mechanosensation. Este protocolo describe un comportamiento simple toque en moscas de la fruta que se pueden usar para identificar mutaciones que interfieren con mechanosensation. La estimulación táctil de un macrochaete de cerdas en el tórax de la mosca provoca un reflejo de aseo de la primera o tercera pierna. Las mutaciones que interfieren con mechanotransduction (tales como NOMPC), o con otros aspectos del arco reflejo, pueden inhibir la respuesta preparación. Una pantalla tradicional de conductas adultas habría perdido mutantes que tienen un papel esencial durante el desarrollo. En lugar de ello, este protocolo combina la pantalla táctil con el análisis de mosaico con un marcador de células reprimible (MARCM) para permitir sólo las regiones limitadas de células mutantes homocigotos para ser generado y marcado por la exprESIÓN de la proteína fluorescente verde (GFP). Al probar clones MARCM para las respuestas de comportamiento anormales, es posible para escrutar una colección de mutaciones letales p de elementos para buscar nuevos genes implicados en mechanosensation que habrían sido perdidas por métodos más tradicionales.

El éxito de este protocolo depende en gran medida del rendimiento total de moscas comprobables, la eficacia del choque térmico para inducir recombinación mitótica, y la capacidad de obtener una respuesta de comportamiento robusto en moscas estimuladas a intervalos de 2 min. Dado que aproximadamente el 12,5% de los embriones contiene los elementos necesarios MARCM y un estimado de 16,67% de los adultos que Eclose tener el potencial para la expresión de GFP, es crítica para obtener u...

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A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

10.1K vistas.  College of the Holy Cross. In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.