Die Autoren danken danken der Bloomington Stock Center, Liqun Luo, Charles Zuker und Lily und Yuh Nung Jan für die großzügige Aufteilung der Fliege Aktien und den folgenden für die Finanzierung: SOMAS-URM (JD und SW), Bachelor Ford Fakultät Sommer Fellowship (bis SW), BD Corporation, Sommer-Forschungsstipendium (CL und DL), der Renee und Anthony M. Marlon, MD &#39;63 Summer Research Fellowship (DL) James C. &#39;75 und Jane Colihan Sommer-Forschungsstipendium (TO) durch die Alumni / Eltern Sommerforschungsfonds der Universität vom Heiligen Kreuz und der Stransky Foundation Sommer-Forschungsstipendium (TO). Besonderer Dank gebührt dem Institut für Biologie und das Dekanat bei College des Heiligen Kreuzes für die Unterstützung von all der Arbeit im Labor.

1. Kreuze zu MARCM Flies generieren <ol><li> Aufrechtzuerhalten Fliegen auf Maismehl Melasse-Medien (6,5 g / l Agar; 23,5 g / l Hefe, 60 g / L Maismehl, 60 ml / l Melasse, 4 ml / l Säuremischung; 0,13% Tegosept) oder Standard Drosophila Medium bei 22 Grad Celsius in einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus. Hinweis: eine niedrigere als Standardtemperatur wird verwendet, um MARCM-Aktien gesund zu halten. Dadurch verlängert sich die Entwicklungszeit zwischen Ei und Erwachsenenalter bis 14 Tagen. </li><li> Verwenden jungfräulichen Weibchen (ca. 1-8 Tage alt) aus einem MARCM-ready Lager, die die notwendigen genetischen Elemente (GFP unter der Kontrolle von einem vorgeschalteten-Aktivierungssequenz (UAS-GFP), der Gal80 Repressor-Protein, das Gal4-Transkriptionsfaktor, ein Hitzeschock angetrieben Rekombinase und eine FRT-Rekombinationsstelle). Hinweis: Unsere MARCM ready-Aktien die folgenden Genotypen enthalten: elavGal4, UAS-CD8-GFP, hs-flipase; FRT40A, tubGal80 / Cyo; tubGal4 / TM3Sb. Anmerkung: Die spezifische FRT-Stelle ist am Ort der Mutation abhängtim Genom. So wird beispielsweise verwendet werden, um Mutationen FRT40A am linken Arm von Chromosom 2, wie zum Beispiel NOMPC (siehe 10 für weitere Details über MARCM Protokolle) zu testen. </li><li> Quer MARCM-ready jungfräulichen Weibchen zu Männchen, die eine Mutation von Interesse und seine entsprechende FRT-Stelle enthalten (beispielsweise w-; NOMPC3, FRT40A / Cyo; + / +). Für eine wirksame MARCM Induktions steuern, stellen eine zweite Quer mit männlichen Fliegen denselben FRT-Stelle enthielt, aber ohne Mutation. Verwenden Sie einen ungefähren Verhältnis von 5 Frauen: 1 Männchen im Kreuze. </li></ol> 2. Timed Eiablage <ol><li> Nachdem man fliegt, für mindestens eine Nacht paaren, bewegen Erwachsenen in neue Flaschen mit frischem Medium. Lassen Sie entfernt, um Eier in einer dunklen Umgebung für ca. 4 Stunden vor dem erneuten Übertragen der Kreuze in neue Gefäße zu legen. Beachten Sie die Start- und Endzeit der Eiablage Periode. Anmerkung: Kürzere Intervalle akzeptabel sind, wenn es angezeigt wird, um eine hohe Anzahl von Eiern auf dem Medium vor dem Ende der 4-stündigen Interval. <ol><li> Halten Sie Durchstechflaschen mit einer ausreichenden Anzahl von Eiern (ungefähr größer als 20) und an einem 12-stündigen Hell / Dunkel-Zyklus bei 22 Grad Celsius zu sein Wärme später schockiert. Anmerkung: Ampullen mit einer geringen Anzahl von Eiern auf dem Medium (weniger als etwa 20), sind wahrscheinlich nicht ausreichende Zahl Ausbeute von erwachsenen Fliegen für Verhaltenstests und im Interesse der Effizienz ist es empfehlenswert, sie nicht für weitere Tests erhalten werden. Hinweis: Unsere Fliegen sind mit den Lichtern auf 08.00 bis 20.00 angehoben. 08.00 Uhr und 08.00 Uhr bis Mitternacht - Wir haben die Zeit des Abends Punkte führen zu höheren Eierdichten, also in der Regel führen zeitgesteuerten Kreuzungen zwischen 4 gefunden. Die Fliegen legen ihre Eier bei RT in einem dunklen Schrank und dann am folgenden Tag in den Inkubator gegeben, um nicht das normale Licht-Dunkel-Zyklus in den Inkubator zu stören. </li></ol></li></ol> 3. Führen Sie Heat Shock mitotische Rekombination induzieren <ol><li> Etwa 85 bis 100 Stunden nach Eiablage statt vrialien in ein Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Stellen Sie sicher, dass der Wasserstand erreicht, über die Höhe der Medien in den Fläschchen, aber nicht vollständig versenken die Fläschchen, um die Larven vor dem Ertrinken zu verhindern. </li><li> Fläschchen entfernen Wasserbad und ermöglichen eine 1 Stunde Erholungszeit bei RT. </li><li> Platz Fläschchen zurück in 37 Grad Celsius Wasserbad für 1 Stunde. </li><li> Fläschchen aus Wasserbad und bewahren Sie im Inkubator auf 12-Stunden-Hell / Dunkel-Zyklus bei 22 Grad Celsius bis zum Schlüpfen. </li></ol> 4. Vorbereitung für Behavioral Testing <ol><li> Nach dem Schlüpfen, betäuben Fliegen auf Eis. Wählen Fliegen mit Genotypen, die alle genetischen Elemente für MARCM enthalten und zeigen GFP-Expression markierte Klone wird wahrscheinlich auf der Grundlage der beobachtbaren Phänotyp-Marker in den Mutter Lagerbestände zu beobachten. Enthaupten Fliegen mit Iridektomie Schere. Hinweis: Zum Beispiel für Fliegen wählten wir ohne die genetische Marker Cyo (geschweifte Flügel) und Sb (Stoppelborsten) zu identify Fliegen, die alle genetischen Elemente notwendig, Mosaik Regionen zu schaffen enthalten würde mit GFP markiert. Hinweis: Enthauptung ist nötig, die Erwachsenen aus fliegen weg, wenn stimuliert verhindern. </li><li> Zeigen kopflose Fliegen in einem geschlossenen, feuchten Umgebung und lassen Sie ca. 10 - 20 Stunden der Erholung. Nur Verwendung fliegt dieses Recht selbst, wenn eine weitere Prüfung erforderlich gestört. Test fliegt innerhalb von 30 Stunden der Enthauptung. </li></ol> 5. Behavioral Testing <ol><li> Durch die Beobachtung enthauptet Fliegen unter dem Fluoreszenz Binokular, identifizieren homozygot Klone mit GFP an den Borsten äußeren Sinnesorgane markiert. Notieren Sie sich die Borsten Namen und linken oder rechten Seite. Um eine mögliche Voreingenommenheit zu beseitigen, sollte die Labor Mitglied Durchführung des Borsten Stimulation blind gegenüber dem Genotyp des Borsten, Wildtyp oder Mutante sein. </li><li> Rufen eine grooming Reflex durch Ablenken des GFP markierte Borsten in Richtung der Flugkörper mit einem steifen Haaren oder feinen Pinzette und das Bein re beobachtenAntwort. Geben Sie einen Wert von eins bis Fliegen, die das Bein heben in Reaktion auf die Stimulation und eine Punktzahl von null auf Fliegen, die ihre Beine nicht bewegen Borsten. Hinweis: Frühere Studien 6,7 haben die Bein Reaktion, die durch die Förderung eine besondere Borsten ausgelöst wird gekennzeichnet. Dies schließt die Schenkel, die an jeder Borste anspricht und den Anteil an Fliegen, die auf die Stimulation des jeweiligen Borsten reagieren. Wir erzielte nur für Bewegungen des Beins, die wir erwartet, basierend auf Vandervorst Klassifizierung 6 reagieren. </li><li> Führen Sie fünf Studien 2 Minuten Abstand voneinander. </li></ol>

<ol>
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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mechanosensory+transduction+channel.">A Drosophila mechanosensory transduction channel.</a> Science. 287, 2229-2234 (2000).</li><li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation.">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493, 221-225 (2013).</li><li>Arnadottir, J., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+Mechanosensitive+Channels.">Eukaryotic Mechanosensitive Channels.</a> Annual Review of Biophysics. 39, 111-137 (2010).</li><li>Christensen, A. P., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+in+mechanosensation:+direct+or+indirect+activation?.">TRP channels in mechanosensation: direct or indirect activation?.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8, 510-521 (2007).</li><li>Cheng, L. E., Song, W., Looger, L. L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+TRP+Channel+NompC+in+Drosophila+Larval+and+Adult+Locomotion.">The Role of the TRP Channel NompC in Drosophila Larval and Adult Locomotion.</a> Neuron. 67, 373-380 (2010).</li><li>Lee, J., Moon, S., Cha, Y., Chung, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+TRPN(=NOMPC)+channel+localizes+to+the+distal+end+of+mechanosensory+cilia.">Drosophila TRPN(=NOMPC) channel localizes to the distal end of mechanosensory cilia.</a> PLoS One. 5, e11012 (2010).</li><li>Liang, X., Madrid, J., Saleh, H. S., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NOMPC,+a+Member+of+the+TRP+Channel+Family,+Localizes+to+the+Tubular+Body+and+Distal+Cilium+of+Drosophila+Campaniform+and+Chordotonal+Receptor+Cells.">NOMPC, a Member of the TRP Channel Family, Localizes to the Tubular Body and Distal Cilium of Drosophila Campaniform and Chordotonal Receptor Cells.</a> Cytoskeleton. 68, 1-7 (2011).</li><li>de Vries, S. E., Clandinin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loom-sensitive+neurons+link+computation+to+action+in+the+Drosophila+visual+system.">Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system.</a> Curr Biol. 22, 353-362 (2012).</li><li>Jarman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+mechanosensation+using+the+fly.">Studies of mechanosensation using the fly.</a> Hum Mol Genet. 11, 1215-1218 (2002).</li></ol>

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Dieses Protokoll verwendet eine erwachsene Verhaltenstest für Mutationen, Mechanosensation in Drosophila beeinflussen screenen. Da die Sammlung von Mutanten enthält letale p-Element Mutationen, Screening ausschließen würden als Erwachsene Dieses Protokoll verwendet eine komplexe genetische Technik zuerst durch Lee und Luo beschrieben , (1999) und detaillierter als Protokoll von Wu und Luo, (2006) bis zur Erwachsenen Letalität zu umgehen. MARCM induziert mitotische Rekombination zwischen homologen ...

Humans rely on the ability to convert mechanical stimuli from their environment, such as touch, pressure, vibration, or sound waves, into sensory information that can be processed by the nervous system, in a process termed mechanotransduction. Many of the overall mechanistic features of mechanotransduction between humans and invertebrates are the same1, making Drosophila a useful model to study the molecular mechanisms of mechanotransduction. Drosophila melanogaster contain two sets of specialized sensory organs (Type I and II) that are capable of converting mechanical stimuli into action potentials. Type I mechanoreceptors have a neuron with a single dendrite or sensory process, surrounded by three support cells2. The Type I mechanoreceptors include bristle mechanoreceptors, hearing sensitive chordotonal organs (the Johnston's organ), and campaniform sensilla that convey information about wing beats3. The bristles that cover the dorsal side of the fly are the most abundant and easily accessible of the Type I organs. Similar to the extracellular environment of hair cells associated with hearing and balance in vertebrates, the support cells surrounding fly mechanosensitive neurons secrete a high potassium endolymph that creates an unusual concentration gradient for potassium1. Mechanosensitive neurons, of both the mammalian and fly systems, utilize this high extracellular potassium to depolarize the cell. In response to mechanical stimulation of the macrochaete bristles towards the body wall, the sensory neurons respond with a burst of action potentials driven by this potassium depolarization of the cell membrane4. The Drosophila sensory neurons that innervate bristles resemble the mechanosensitive cells of other organisms, including vertebrate hair cells, in both structure and function1,5. The accessibility of Drosophila external sense organs to experimental manipulation and the abundance of genetic techniques available to researchers make Drosophila an excellent model system to investigate the molecular underpinnings of mechanosensation. 
In the fly, stimulation of a single sensory neuron that innervates a bristle leads to an observable behavioral response. Stimulation of different bristles evokes specific, reproducible behavioral responses, depending on the bristle that is stimulated. Upon tactile stimulation, decapitated wild-type flies exhibit a complex grooming reflex wherein they clean the area near the stimulated bristle with a patterned set of leg movements5-7. When homozygous for known single-gene mutations that interfere with learning7 or coordination and locomotor activity5, flies respond abnormally to mechanical stimulation. This grooming reflex is therefore a useful tool to study the effects of single-gene mutations on a specific, replicable behavior.
The robust behavioral response to stimulation of a single macrochaete bristle holds the potential to assist in identifying new genes involved in mechanotransduction. This protocol being used to test a collection of mutant flies for the absence of a behavioral response to indicate that the mutation interferes with mechanosensation. In the mutant collection selected for screening, the mutations cause lethality before adulthood, and therefore would be impossible to test using traditional adult behavior screens. Originally, this collection of lethal p-elements was combined with FRT recombination sites to test cell growth defects in clones. The clones were made specifically in the eye because adult flies can survive in the lab setting without functional vision8. However, removal of all mechanosensation can cause adults to be severely uncoordinated or die before eclosion5. This protocol uses a mosaic approach to circumvent the lethality of the mutations and allow for adult stage testing. A genetic technique called Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM)9 is used to generate homozygous mutant cells in a limited number of adult fly sensory organs, while the rest of the organism remains heterozygous. These MARCM flies readily survive until adulthood, yet the bristles are homozygous for the lethal genes of interest.
MARCM allows for regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP), while the rest of the organism remains heterozygous at that particular locus and unmarked9. MARCM combines individual p-element mutations with five common genetic elements: GFP under the control of an upstream-activating sequence (UAS-GFP), Gal80 repressor protein under control of a general promoter (tub-Gal80), Gal4 transcription factor under control of a general promoter (tub-Gal4), the FRT recombinase enzyme expressed through a heat-shock controlled promoter, and a FRT recombination site10. By driving mitotic recombination through a heat-shock activated recombinase, a limited number of cells are made homozygous for the mutation and marked with GFP. GFP expression is repressed in heterozygous cells by the presence of Gal80 on the wild-type copy of the chromosome. 
A heat-shock protocol for MARCM was optimized to induce recombination in the fly bristle external sense organs, while much of the organism remains heterozygous, and thus unmarked with GFP. Mosaic flies generated using this protocol contained homozygous mutations most frequently in the post alar or dorsal central bristles on the surface of the notum. 
We have tested the utility of this combination of MARCM and the grooming behavior screen with a known mechanosensitive mutant, NOMPC. The ion channel, no mechanoreceptor potential C (NOMPC), is an essential component of the mechanotransduction pathway in Drosophila5,11-13. NOMPC belongs to the transient receptor potential (TRP) superfamily of cation channels5 and satisfies all of the criteria to qualify as a mechanosensitive channel in Drosophila14,15: 1) NOMPC is expressed in the ciliate tips of type 1 sensory neurons of Drosophila 13,16-18, 2) NOMPC null larvae do not have an electrical response to tactile stimulation13, 3) Ectopic expression of NOMPC in touch insensitive cells can induce sensitivity to mechanical stimulation13, 4) heterologous expression of NOMPC in Schneider 2 cells yields a mechanosensitive channel13, and 5) NOMPC adult mutants display defects in their response to mechanical stimulation5. Given this evidence, we predicted that NOMPC mutant clones would show an altered or inhibited grooming response in response to mechanical stimulation of bristles.
A MARCM-stock containing the NOMPC mutation was developed for use in a proof of principle experiment of the grooming assay. Mosaic flies were stimulated at macrochaete bristles containing homozygous NOMPC mutant cells. We expected an inhibition of the grooming response following stimulation of the macrochaete bristle. We found that only 2 of 14 mutant bristle flies tested gave a single response to repeated stimulation; most did not respond to stimulation of the homozygous mutant bristle. Having confirmed that this MARCM-based behavioral assay produces an abnormal grooming reflex in a known mechanosensitive mosaic mutant, this technique can be used in a screen for additional mechanosensitive mutations.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="648">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Brewers Yeast (25 lb)</td>
			<td style="width:163px;">MP Biomedicals&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ICN90331225&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Corn (25lb)</td>
			<td style="width:163px;">MP Biomedicals&#160;</td>
			<td style="width:163px;">ICN90141125&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Agar (1lb)</td>
			<td style="width:163px;">MoorAgar Inc.</td>
			<td style="width:163px;">41004</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Tegosept (5kg)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">20-259</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Molasses (1Gallon)</td>
			<td style="width:163px;">Sugarmill Brand - Thomsen Food Service</td>
			<td style="width:163px;">0 2625</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Propionic Acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">A258-500</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Phosphoric acid</td>
			<td style="width:163px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">A260-500</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">Drosophila Vials, Narrow (PS)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">32-109</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:163px;">6oz Square Bottom Bottle (PP)</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">32-130</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Flugs - Plastic Fly Bottles</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">49-100</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Rayon Balls, Large</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">51-100</td>
			<td style="width:163px;">Fly Cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Droso-Filler, Narrow</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">59-168</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Droso-Filler, Bottles</td>
			<td style="width:163px;">Genesee</td>
			<td style="width:163px;">59-170</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="95">
			<td height="95" style="height:95px;width:163px;">8A-C / gear driven lab stirrer with c-clamp mount&#160; 1/15HP, 700RPM variable speed, 115V, 50/60Hz</td>
			<td style="width:163px;">Cleveland Mixer</td>
			<td style="width:163px;">8A-C</td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Water jacketed Kettle</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">Fly Food Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Diurnal Growth Chamber</td>
			<td style="width:163px;">Forma Scientific</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">Temperature and light/dark cycle controlled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Water bath</td>
			<td style="width:163px;">VWR</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">For heat shock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">MicroScissors&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:163px;">&#160;15000-08</td>
			<td style="width:163px;">For removing heads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fluroscence Dissecting Microscope</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">SteREO Discovery V8&#160;</td>
			<td style="width:163px;">With GFP cube (KSC295-814D) band pass filter</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Fluroscence Light Source</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">X-Cite 120</td>
			<td style="width:163px;">Fiber optic light pipe makes this easy to configure&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Camera for Scope</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;">AxioCam ICc1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Image acquistion software</td>
			<td style="width:163px;">Zeiss</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ice bucket</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for cold anthesia</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Homemade cold anthesia tray</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for cold anthesia decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">Plastic boxes</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:163px;">for recovery of decaptitated flies in humid environment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a behavioral assay for mechanosensation of marcm-based clones in drosophila melanogaster

Aufgrund der strukturellen und funktionellen Homologie zu den Haarzellen des Innenohrs Säuger, die Neuronen, die Drosophila externen Sinnesorgane innervieren einen hervorragenden Modellsystem für das Studium der Mechanosensation. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Berührung Verhalten in Fruchtfliegen, die verwendet werden, um Mutationen, die mit Mechanosensation stören zu identifizieren. Die taktile Stimulation eines macrochaete Borsten auf den Brustkorb von Fliegen löst eine grooming Reflex entweder aus der ersten oder dritten Bein. Mutationen, die mit mechanotransduction (wie NOMPC) eingreifen, oder in Verbindung mit anderen Aspekten der Reflexbogen kann die Optimierungs Reaktion hemmen. Eine traditionelle Bildschirm des Erwachsenen Verhaltensweisen würden Mutanten, die eine essentielle Rolle während der Entwicklung haben verpasst. Stattdessen Dieses Protokoll verbindet die Touch-Screen mit Mosaik-Analyse mit einem repressible Zellmarker (MARCM), die für nur eine begrenzte Regionen homozygot mutierten Zellen zu ermöglichen, erzeugt und durch den expr markiert werdenession des grün fluoreszierenden Proteins (GFP). Durch Testen MARCM Klone für anormalen Verhaltens-Reaktionen ist es möglich, eine Sammlung von letalen p-Element-Mutationen zu screenen, um neue Gene, die durch die herkömmlichen Methoden entgangen wären in Mechanosensation beteiligt suchen.

Der Erfolg dieses Protokoll hängt weitgehend von der Gesamtausbeute von testbaren Fliegen, die Wirksamkeit des Hitzeschock mitotische Rekombination und die Fähigkeit, einen robusten Verhaltensreaktion bei Fliegen in 2 min Intervallen stimuliert erhalten induzieren. Gegeben, dass schätzungsweise 12,5% der Embryonen enthalten alle notwendigen MARCM Elemente und eine geschätzte 16,67% der Erwachsenen, die das Potential für eine GFP-Expression schlüpfen, ist es wichtig, eine hohe Anzah...

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A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Ein Verhaltenstest für Mechanosensation der MARCM-basierte Klonen in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

10.1K Aufrufe.  College of the Holy Cross. In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.