We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Nota: El siguiente protocolo está diseñado para la síntesis de un bioconjugado de proteína-colorante como se muestra en la Figura 1 Se trata de un protocolo general para la reacción de una maleimida con las proteínas de cisteína superficie libre que contienen, con notas insertan en su caso para ayudar con la proteína de la membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, y dímero de proteínas sintéticas (proteína-proteína) bioconjugados. En este caso particular, la proteína de iso-1 citocromo c tiene un residuo de cisteína de superficie disponible para reaccionar que permite un etiquetado altamente específico que se produzca. Si una proteína de interés tiene múltiples residuos de cisteína, se aplica el mismo protocolo, aunque con la pérdida de la especificidad y la homogeneidad del producto. Química de orientación residuos de lisina superficie, usando N -hydroxysuccinimidyl ésteres o isotiocianatos, pueden ser un enfoque más simple si no se requiere la especificidad. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Esquema de Reacción bioconjugación. Como un caso ejemplo, un captador de luz, molécula de antena basado en rutenio se adjuntará al citocromo c a través de adición de Michael de una maleimida colgante en la molécula de la antena a base de rutenio y un residuo de cisteína expuesta (CYS102) en la proteína. El área roja de la superficie cyt c indica el grupo hemo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 1. Purificación de citocromo c Nota: Este paso no es aplicable a todas las proteínas. Sin embargo, es importante saber que una proteína obtenida de un proveedor comercial puede contener otras isoformas de proteínas no deseadas, que pueden necesitar ser eliminado por purificación adicional 13. <ol><li> Disolver 2,4 g de dihidrogenofosfato de sodio (M w = 120 g mol -1) en 1 L de agua ultrapura a prepare una solución tampón que contiene 20 mM NaH 2 PO 4. Se ajusta el pH con NaOH 1 M a pH 7. Nota: Los tampones de fosfato utilizados en este protocolo deben prepararse recientemente sobre una base diaria, y se filtraron a través de un filtro de membrana de 0,2 micras de celulosa antes de su uso. </li><li> Disolver 29,22 g de cloruro de sodio (M w = 58,44 g mol -1) en 500 ml de la NaH 2 PO 4 20 mM tampón para hacer una mM NaH 2 PO 4 20 y tampón M NaCl 1. Este es el tampón de elución para la purificación en el paso 1.6). </li><li> Disolver 12,0 mg de liofilizado citocromo c (cyt c) en 6 ml de pH 7 20 mM de tampón de fosfato. </li><li> Por separado se disuelven 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) en 95,3 l de agua ultrapura para preparar una solución madre 1 M. Nota: La solución de TDT Debe prepararse, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa. </li><li> Pepitaette 60 l de la solución 1 M de DTT en la solución de proteína para reducir el cyt c. El color de la solución cambia de color rojo oscuro a rojo claro tras la mezcla. </li><li> Se filtra la solución de proteína reducida a través de un filtro de jeringa de PVDF de 0,22 micras de unión baja en proteínas antes de inyectar en cualquier medio cromatográfico. </li><li> Adjuntar una columna de intercambio catiónico 3,3 ml fuerte entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis de un instrumento de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC). </li><li> Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de agua ultrapura, seguidos por 3 volúmenes de columna de pH 7 tampón fosfato 20 mM, utilizando una velocidad de flujo de 1 ml / min. </li><li> Cargar 1 ml de crudo reducido cyt c en el circuito de inyección, y comenzar un método de gradiente desde 328 - 450 mM de NaCl, en 5 volúmenes de columna. Monitorear los canales de 280 nm y 410 nm del detector de UV-Vis, y recoger el pico más grande. </li><li> Aumentar la concentración de sal de 1 M de 2 volúmenes de columna para eluir iso-2 citocromoe c, y después de la columna ha sido lavado, re-equilibrar la columna con 2 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM antes de la inyección de la siguiente parte alícuota crudo. </li><li> Repita los pasos del 01/09 a 01/10 hasta que toda la proteína cruda se ha purificado. </li><li> Se combinan las fracciones que contienen iso-1 y concentrarlos usando un (MWCO) filtro giratorio 3.5 kDa de peso molecular de corte y centrifugación a 3.000 x g. </li><li> Cargar la proteína concentrada en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua. </li><li> Determinar la concentración de la solución de proteína pura, se concentró mediante la adopción de 10 l, diluir a 100 l con agua ultrapura, y teniendo un espectro de absorbancia. Use un volumen bajo, 100 l cubeta de cuarzo para obtener espectros de absorción de proteínas. Típicamente, la concentración de proteína sin diluir es del orden de 50 - 100 mM. <ol><li> Utilice la característica pico de 410 nm de cyt c para cuantificar el concentration utilizando la ley de Beer-Lambert con un valor de absortividad molar de 97,6 cm-1 mM -1: A = ε × c × ι donde A es la absorbancia, ε es la absortividad molar, c es la concentración en mM, y ι es la longitud de la trayectoria de la cubeta en cm 13. </li></ol></li><li> En este punto, se divide la proteína en alícuotas de 1 ml y mantener congelada a -20 ° C hasta que se necesiten. Cyt c puede congelarse y descongelarse sin pérdida de estructura o función, pero los ciclos de repetición comenzará a desnaturalizar la proteína. Nota: Las proteínas resiste heladas en diferentes grados. Por ejemplo, las proteínas fluorescentes verdes 5,9 no debe congelarse, ahora almacenadas en un refrigerador. </li></ol> 2. Síntesis de citocromo c bioconjugados <ol><li> Disolver 0,9 mg de rutenio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 maleimida, 0,975 mmol, 6 equivalentes) en 600 l de acetonitrilo. Nota: Si la maleimida utilizado es soluble en agua, preparar una solución madre en agua en lugar de acetonitrilo. Es importante para la maleimida a ser soluble en el tampón de reacción. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo y se utilizan todos comúnmente adyuvantes para ayudar en la disolución de bajo peso molecular 12, a menudo los reactivos de maleimida hidrófobos. </li><li> Preparar una solución tampón que contiene tampón fosfato 100 mM y 100 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, M w = 292,24 g / mol), que cuando se diluye a 20 mM está en pH 7. Añadir hidróxido de sodio sólido hasta que se disuelva el EDTA (varios gramos típicamente ) y ajustar el pH a 7. </li><li> Disolver 2,87 mg de Tris (2-carboxietil) fosfina clorhidrato (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) en 1 ml de agua ultrapura para preparar una solución madre 10 mM. Este paso es la importaciónhormiga para asegurar que la cisteína en la proteína está totalmente reduce antes de maleimida de acoplamiento 15. Nota: La solución de TCEP Debe prepararse para cada reacción, ya que este reactivo es susceptible a la desactivación oxidativa en solución acuosa. </li><li> Combinar 11,4 ml de agua ultrapura con 3 ml de solución de fosfato / EDTA de stock 100 mM en un tubo de plástico de 50 ml. Cuando se diluye aún más con las soluciones de proteínas y de existencias de maleimida la concentración del tampón será de 20 mM. Nota: Si la proteína de ser etiquetado es una proteína transmembrana, asegurar que un detergente adecuado se añade a la memoria intermedia para solubilizar la proteína. Si no se usa un detergente la proteína de membrana puede precipitar lentamente, lo que afectará negativamente los rendimientos de reacción. Utilice el detergente en todas las etapas de purificación posteriores. </li><li> Añadir 0,15 mmol (3 ml de una solución 50 mM, 1 equivalente) de purificado cyt c en el búfer de fosfato-EDTA. </li><li> Añadir 7,5 l de la TCEP Stock solution (0,075 mol, 0,5 equivalentes) a la solución de proteína y dejar de agitar durante 5 min para reducir cualquier proteína que pueda haber dimerizada debido a la oxidación de cisteína. Nota: No agregue TCEP si la proteína de interés no dimerize fácilmente. Comprobarlo ejecutando un gel de proteína en condiciones no reductoras. </li><li> Añadir 600 l de la solución de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) 2 maleimida a la solución reducida, tamponada de cyt c, y dejar la mezcla de reacción bajo agitación, en la oscuridad, a temperatura ambiente, durante 24 horas. </li><li> Se concentra la mezcla de reacción usando filtros de giro de 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3.000 xg, repitiendo 2-3 veces con tampón fosfato 20 mM frescas hasta que el filtrado salga clara. Eliminar la mayor cantidad de maleimida sin reaccionar de la mezcla de reacción como sea posible antes de la siguiente etapa de purificación. Nota: En este punto, la mezcla de bioconjugación crudo se puede almacenar en el refrigerador, en la oscuridad. Es importante eliminar tinte de maleimida sin reaccionar por centrifuge diálisis antes del almacenamiento como la maleimida puede reaccionar lentamente y no específicamente con residuos de lisina en la superficie de la proteína. </li></ol> 3. Purificación de bioconjugados citocromo C <ol><li> Disolver 2,4 g de dihidrógeno fosfato de sodio y 29,22 g de cloruro sódico en 1 L de agua ultrapura para preparar una solución tampón que contiene 20 mM NaH 2 PO 4 y 0,5 M NaCl. Este es el tampón de ejecución para la purificación cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC). </li><li> Disolver 17 g de imidazol (M w = 68.077 g mol -1) en 500 ml de la 20 mM NaH 2 PO 4 y tampón de NaCl 0,5 M. Este es el tampón de elución para la purificación IMAC. </li><li> Ajustar el pH de ambos tampones a pH 7 con NaOH 1 M o HCl, y filtrar a través de membranas de 0,22 micras de celulosa regenerada antes de su uso en la FPLC. </li><li> Como las columnas IMAC comprados se envían sin ningún tipo de iones metálicos cargados en la colUMN, preparar la columna para un Ni 2+ purificación basado lavando la columna con 3 ml de agua ultrapura, 3 ml de solución de acetato de níquel 100 mM, y 6 ml de agua ultrapura. Si la columna no es para ser usado inmediatamente lavar a través de 3 ml de etanol al 20% y almacenar la columna en la nevera para evitar el crecimiento bacteriano. </li><li> Adjuntar un 2 + Ni RESORTE 1 ml de columna IMAC a la FPLC entre el bucle de inyección y detector de UV-Vis. </li><li> Equilibrar la columna con 3 volúmenes de columna de fosfato 20 mM, tampón NaCl 0,5 M usando una tasa de flujo de 0,5 ml / min. </li><li> Carga de 100 l de mezcla de reacción bruta (filtrada a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras) en la columna de Ni 2+ IMAC. Lavar la columna con 3 volúmenes de columna de tampón de ejecución para eluir no reaccionado cyt C, seguido de un gradiente de imidazol 0 a 125 mM más de 3 volúmenes de columna para eluir el c bioconjugado bisterpyridine-citocromo de rutenio (Ru (II) Cyt c) . </li><li> Se lava la cOLUMNA con tampón de imidazol 250 mM durante 5 volúmenes de columna, a continuación, volver a equilibrar la columna con fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M y repita el paso 3.7 hasta que todo el bioconjugado bruto ha sido purificada. </li><li> Reunir las fracciones Bioconjugate y concentrar utilizando un filtro de giro 3,5 kDa MWCO, centrifugación a 3000 x g. </li><li> Cargar el bioconjugado se concentra en casetes de diálisis de 3,5 kDa MWCO y dializar contra ultrapura agua durante la noche, con 2 cambios de agua. </li><li> Determinar la concentración de la solución de bioconjugado puro, se concentró por UV-Vis, usando el mismo valor de absortividad molar como iso-1 citocromo c (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Típicamente, la concentración bioconjugado es del orden de 50 - 100 mM. </li><li> Divida el bioconjugado en 25 ml de alícuotas congeladas y mantener a -20 ° C hasta que se necesiten. </li></ol> 4. Caracterización de bioconjugados citocromo C <ol><li> Desalentarminación de la masa bioconjugado por MALDI-TOF MS <ol><li> Disolver 10 mg de ácido cafeico en 1 ml de una solución de ácido acetonitrilo / agua / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v). </li><li> Diluir 5 l de solución de proteína concentrada con 5 l de solución de ácido cafeico. </li><li> Punto de 0,5 l de solución de ácido cafeico en la placa de MALDI objetivo y permita que la solución se seque. </li><li> Punto 0.5 l de la solución de la muestra / de la matriz en la parte superior de este punto de ácido cafeico, permita que el punto de que se seque. Detectar otros 0,5 l de matriz de la muestra en la parte superior de este a &quot;sándwich&quot; la muestra entre las capas de la matriz, y dejar secar. </li><li> Adquirir los espectros de masas en modo lineal utilizando los ajustes del instrumento adecuados para las proteínas 16. </li></ol></li><li> Investigación de bioconjugados por electroforesis en gel <ol><li> Preparar 10 l de cada muestra de proteína que se ejecutan mediante la dilución de las muestras de proteínas con sulfato dodecil premezclada de litio (LDS, pH 8,4) tampón (4x) tOA concentración final de aproximadamente 20 mg por pocillo. Para los pozos que requieren condiciones reductoras, añadir 1 l de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) reducir. </li><li> muestras de calor a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Añadir 50 ml de premezcla 1 M MES, base de 1 M Tris, 2% de SDS, EDTA 20 mM (pH 7,7) que se ejecuta mezcla tampón (20x) de una fuente comercial a 950 ml de agua ultrapura para preparar el tampón de gel en funcionamiento. </li><li> Retire el peine de plástico a partir del gel y colocar el gel en el depósito de gel en marcha. Llenar el tanque con tampón de gel de ejecución, por lo que los pozos se cubren con tampón. </li><li> Cargar las muestras con cuidado en un prefabricado 12% Bis-Tris, 1 mm, gel de 10 pocillos usando puntas de pipeta largos para ayudar en la carga. Cargar el prestained proteína 10 peso molecular marcador (3-188 kDa) en un pozo medio del gel para ayudar a análisis. </li><li> Correr el gel a 200 V de tensión constante durante 35 min. </li><li> Teñir el gel con una solución de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, y lavar con ultrapUre agua durante 48 horas. </li></ol></li><li> Determinación de la pureza bioconjugado mediante espectroscopía de UV-Vis <ol><li> Preparar 120 l de 5 M soluciones de Ru (II) (tpa) 2 maleimida, iso-1 cyt c, y Ru (II) Cyt c. </li><li> Medir el espectro de línea base de la cubeta de cuarzo que contiene sólo agua ultrapura, de 250 nm a 650 nm. </li><li> Medir el espectro de cada componente, garantizando la cubeta se enjuaga y se seca entre cada medición. </li><li> Trazar la absorbancia de cada componente como una función de longitud de onda, y comparar la suma lineal de los materiales de partida con el producto final para determinar si una relación 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 maleimida a cyt c ha reaccionado. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La purificación de los materiales de partida antes de una bioconjugation es de suma importancia. Las proteínas obtenidas a partir de fuentes recombinantes comerciales contienen a menudo otras isoformas de la proteína de interés, que puede tener diferente química de la superficie y reactividad. Por ejemplo, en la bioconjugación descrito, el cyt c comercialmente disponible contiene una mezcla de ambos cyt c 12,14,17 iso-1 e iso-2. Iso-2 y las formas de citocromo c 1 Iso-son en g...

La bioconjugación implica la unión covalente de una biomolécula con otra o con una molécula sintética, tal como un tinte, fármaco o un polímero. Métodos bioconjugation proteína ahora se utilizan ampliamente en muchos grupos de investigación química, biología y nanotecnología con aplicaciones que van desde el etiquetado colorante fluorescente 1,2, haciendo de proteína (anticuerpo) -prodrugs 3 (conjugados de fármaco anticuerpo - ADC) síntesis de dímeros de proteína de 4,5 , a través de los híbridos de proteína-polímero auto-montaje de 6,7 utilizadas en nanomedicina 8 y 9 sistemas de la química. La especificidad de la química utilizada para bioconjugation, aunque no siempre crítico, es de suma importancia para bioconjugados proteína más funcionales, a fin de no interferir con el sitio activo de la proteína diana. La reacción bioconjugation ideales necesita cumplir varios criterios, incluyendo: i) dirigidas a sitios raros o únicos en la proteína de interés,ii) ser selectiva hacia este objetivo, iii) proceda en condiciones no desnaturalizantes para evitar desplegamiento de la proteína y iv) ser de alto rendimiento como la proteína diana es por lo general sólo está disponible a una concentración sub-milimolar. La maleimida - cisteína adición de Michael se acerca a cumplir con todos estos criterios, y tiene por ello reclamó durante mucho tiempo un estatus especial en el campo de la química de bioconjugados 10. Esto se debe a que i) muchas proteínas que contienen residuos sólo una cisteína en su superficie pueden ser modificadas por ingeniería genética allí, ii) en el pH correcto de la reacción es altamente selectiva hacia cisteína, iii) se produce más fácilmente en tampones acuosos y iv) es muy rápido con la segunda constante de velocidad orden de maleimidas a las proteínas que contienen cisteína reportados exceda de 5.000 M -1 s -1 en algunos casos 11. Siempre que la proteína de interés puede tolerar una cantidad pequeña (≈ 5-10%) de co-disolvente orgánico 12, casi cualquier colorante de maleimida-funcionalizado, poLymer, superficie u otra proteína puede estar ligada a las proteínas. Además, maleimidas son más específicos para las cisteínas en proteínas que yodoacetamidas, que son más propensos a reaccionar con otros nucleófilos a pH elevado; y más estable que conjugaciones a base de disulfuro que deben mantenerse a un pH ácido para impedir el intercambio de disulfuro de 13. Aquí se presenta un protocolo genérico para la conjugación de moléculas de maleimida-funcionalizado para una proteína que contiene un único residuo de cisteína mediante la reacción entre un cromóforo Ru basado en (II) y la proteína citocromo c redox como un ejemplo. Este protocolo es igualmente aplicable a la mayoría de otras proteínas que contienen un residuo de cisteína superficie accesible y el objetivo maleimida-funcionalizado correspondiente, ya sea otra proteína, un colorante fluorescente, un cromóforo o un polímero sintético.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71496</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">dithiothreitol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">TSKgel SP-5PW</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Tosoh SP-5PW, 07161</td>
			<td>3.3 mL strong cation exchange column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">UFC900308</td>
			<td>3.5 kDa spin filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">66333</td>
			<td>3.5 kDa dialysis cassetes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ru(II) bisterpyridine maleimide</td>
			<td style="width:196px;">Lab made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>see ref (14)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">03609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">93284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">imidazole</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">nickel acetate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">244066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">AcroSep IMAC Hypercell column</td>
			<td style="width:196px;">Pall</td>
			<td style="width:151px;">via VWR: 569-1008</td>
			<td>1 mL IMAC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron cellulose membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Whatman</td>
			<td style="width:151px;">Z697958</td>
			<td>47 mm filter for buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron PVDF membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td>syringe filters for proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hydrochloric acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">84426</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">caffeic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">60018</td>
			<td>MALDI matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">91707</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC6060</td>
			<td>Coomassie blue solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0342BOX</td>
			<td>precast protein gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC5925</td>
			<td>premade protein ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0008</td>
			<td>premade gel sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0004</td>
			<td>premade gel reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>premade gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Acta FPLC</td>
			<td style="width:196px;">GE</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cary 50 Bio Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Varian-Agilent</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Milli-Q ultrapure water dispenser</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Low volume UV-Vis Cuvette</td>
			<td style="width:196px;">Hellma</td>
			<td style="width:151px;">105-201-15-40</td>
			<td>100 microliter cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

La síntesis de bioconjugados se confirma por tres métodos principales: Matrix-Assisted Laser Desorption ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF MS), electroforesis en gel de poliacrilamida, y ultravioleta-visible espectroscopia (UV-Vis), como se muestra en las figuras 2, 3 y 4. Un aumento de la masa correspondiente a la masa de la molécula pequeña anexa, y la falta de una proteína sin reaccionar demuestra la exitosa unión co...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.

Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Chemical Applications of Statistical Analyses

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38.2K vistas.  The University of New South Wales.  Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado. 

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Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order to streamline synthesis by saving steps, time and material compared to conventional methods that require the introduction and removal of activating or directing groups. Therefore, the functionalization of C-H bonds is also attractive for green chemistry. Under oxidative conditions, two C-H bonds or one C-H and one heteroatom-H bond can be transformed to C-C and C-heteroatom bonds, respectively. Often these oxidative coupling reactions require synthetic oxidants, expensive catalysts or high temperatures. Here, we describe a two-step procedure to functionalize indole derivatives, more specifically tetrahydrocarbazoles, by C-H amination using only elemental oxygen as oxidant. The reaction uses the principle of C-H functionalization via Intermediate PeroxideS (CHIPS). In the first step, a hydroperoxide is generated oxidatively using visible light, a photosensitizer and elemental oxygen. In the second step, the N-nucleophile, an aniline, is introduced by Br&#248;nsted-acid catalyzed activation of the hydroperoxide leaving group. The products of the first and second step often precipitate and can be conveniently filtered off. The synthesis of a biologically active compound is shown.

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

A two-step procedure for the synthesis of pharmaceutically active indole-derivatives by C-H functionalization with anilines is described, using photo- and Br&#248;nsted acid catalysis.

Síntesis de derivados Antiviral tetrahidrocarbazol por fotoquímica y catalizada por ácido CH funcionalización a través de intermedios peróxidos (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Investigación

Química

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Marcos de síntesis y caracterización de funcionalizado metal-orgánico

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the material with Au(III) ions. The synthesis method was derived from a sol-gel process used to produce micron-sized monosodium titanate (MST), with several key modifications, including altering reagent concentrations, omitting a particle seed step, and introducing a non-ionic surfactant to facilitate control of particle formation and growth. The resultant nMST material exhibits spherical-shaped particle morphology with a monodisperse distribution of particle diameters in the range from 100 to 150&#160;nm. The nMST material was found to have a Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area of 285 m2g-1, which is more than an order of magnitude higher than the micron-sized MST. The isoelectric point of the nMST measured 3.34 pH units, which is a pH unit lower than that measured for the micron-size MST. The nMST material was found to serve as an effective ion exchanger under weakly acidic conditions for the preparation of an Au(III)-exchange nanotitanate. In addition, the formation of the corresponding peroxotitanate was demonstrated by reaction of the nMST with hydrogen peroxide.

The surfactant mediated sol-gel synthesis of nanosized monosodium titanate is described, along with preparation of the corresponding peroxide modified material. An ion-exchange reaction with Au(III) is also presented.

Síntesis y Reacción Química de tamaño nanométrico monosódico titanato

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

The Synthesis of [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- Using a Metastable Sn(I) Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a sterically demanding ligand, has increased in recent years. The metastable Sn(I) halide is synthesized at&#160;&#34;outer space conditions&#34; via the preparative co-condensation technique. Thereby, the subhalide is synthesized in an oven at high temperatures, around 1,300 &#176;C, and at reduced pressure by the reaction of elemental tin with hydrogen halide gas (e.g., HCl). The subhalide (e.g., SnCl) is trapped within a matrix of an inert solvent, like toluene at -196 &#176;C. Heating the solid matrix to -78 &#176;C gives a metastable solution of the subhalide. The metastable subhalide solution is highly reactive but can be stored at -78 &#176;C for several weeks. On heating the solution to room temperature, a disproportionation reaction occurs, leading to elemental tin and the corresponding dihalide. By applying bulky ligands like Si(SiMe3)3, the intermediate metalloid cluster compounds can be trapped before complete disproportionation to elemental tin. Hence, the reaction of a metastable Sn(I)Cl solution with Li-Si(SiMe3)3 gives [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- 1 as black crystals in high yield. 1 is formed via a complex reaction sequence including salt metathesis, disproportionation, and degradation of larger clusters. Further, 1 can be analyzed by various methods like NMR or single crystal X-ray structure analysis.

The Synthesis of [Sn10SiSiMe334]2- Using a Metastable SnI Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The disproportionation reaction of a metastable Sn(I) chloride solution, obtained via the preparative co-condensation technique, is used for the synthesis of a metalloid tin cluster compound.

La Síntesis de [Sn<sub&gt; 10</sub&gt; (Si (de SiMe<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 4</sub&gt;]<sup&gt; 2</sup<sup&gt; -</sup&gt; Uso de un metaestable Sn (I) solución de haluro sintetizada a través de una técnica de co-condensación

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocolo para la síntesis en fase sólida de oligómeros de ARN que contiene un 2&#39;-<emO</em&gt; -tiofenilmetilo Modificación y caracterización mediante dicroísmo circular

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

Síntesis de nanocables de Au sustrato enlazado mediante un mecanismo activo crecimiento superficial

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Un método de síntesis rápida de Au, Pd y Pt Aerogels vía reducción directa basada en la solución

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Síntesis de ésteres mediante una esterificación Steglich más verde en acetonitrilo

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock copolymers are produced by one of three techniques: thin film rehydration, solvent switching or polymerization-induced self-assembly, and produce only flexible, polydisperse cylinders. Crystallization-driven self-assembly (CDSA) is a method which can produce cylinders with these properties, by stabilizing structures of a lower curvature due to the formation of a crystalline core. However, the living polymerization techniques by which most core-forming blocks are formed are not trivial processes and the CDSA process may yield unsatisfactory results if carried out incorrectly. Here, the synthesis of cylindrical nanoparticles from simple reagents is shown. The drying and purification of reagents prior to a ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone catalyzed by diphenyl phosphate is described. This polymer is then chain extended by methyl methacrylate (MMA) followed by N,N-dimethyl acrylamide (DMA) using reversible addition&#8722;fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, affording a triblock copolymer that can undergo CDSA in ethanol. The living CDSA process is outlined, the results of which yield cylindrical nanoparticles up to 500 nm in length and a length dispersity as low as 1.05. It is anticipated that these protocols will allow others to produce cylindrical nanostructures and elevate the field of CDSA in the future.

Crystallization-driven self-assembly (CDSA) displays the unique ability to fabricate cylindrical nanostructures of narrow length distributions. The organocatalyzed ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone and subsequent chain extensions of methyl methacrylate and N,N-dimethyl acrylamide are demonstrated. A living CDSA protocol that produces monodisperse cylinders up to 500 nm in length is outlined.

Síntesis de nanopartículas cilíndricas monodispersas mediante autoensamblaje basado en cristalización de copolímeros de bloques biodegradables

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...