We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Hinweis: Das folgende Protokoll wird für die Synthese eines Proteins-Farbstoff - Biokonjugat ausgelegt wie in Figur 1 gezeigt , ist es ein allgemeines Protokoll für die Reaktion einer Maleimid mit freien Oberfläche Cystein enthaltenden Proteinen, mit Anmerkungen eingefügt gegebenenfalls mit Membranprotein zu unterstützen. Biokonjugate, Protein-Polymer-Biokonjugate und synthetische Protein-Dimer (Protein-Protein) Biokonjugate. In diesem speziellen Fall das Protein iso-1 - Cytochrom c hat eine Oberfläche Cysteinrest Verfügung zu reagieren , die auftreten , eine hochspezifische Kennzeichnung ermöglicht. Wenn ein Protein von Interesse mehrere Cysteinreste hat, gilt das gleiche Protokoll, wenn auch mit dem Verlust der Spezifität und Produkthomogenität. Chemie Targeting Oberfläche Lysinresten unter Verwendung von N -hydroxysuccinimidyl Ester oder Isothiocyanate kann ein einfacherer Ansatz, wenn Spezifität nicht erforderlich ist. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt; Abbildung 1. Reaktionsschema Biokonjugation. Als Beispiel Fall einer Lichtsammlung, auf Rutheniumbasis Antennen Molekül wird über die Michael - Addition von einem Anhänger Maleimid auf der Basis von Ruthenium Antennen Molekül und einem freiliegenden Cystein - Rest (CYS102) an Cytochrom c befestigt werden auf dem Protein. Der rote Bereich des cyt c Oberfläche zeigt die Häm - Gruppe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> 1. Reinigung von Cytochrom c Hinweis: Dieser Schritt für alle Proteine, die nicht anwendbar ist. Jedoch ist es wichtig , dass ein Protein von einem kommerziellen Lieferanten erhalten wissen kann andere unerwünschte Protein - Isoformen enthalten , die durch weitere Reinigung 13 entfernt werden müssen. <ol><li> Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat (M w = 120 g mol -1) in 1 l Reinstwasser prepare eine Pufferlösung 20 mM NaH 2 PO 4 enthält. Den pH-Wert mit 1 M NaOH auf pH 7 gestellt. Anmerkung: Die Phosphatpuffer in diesem Protokoll verwendet werden, sollten frisch auf einer täglichen Basis hergestellt werden, und filtriert durch ein 0,2 um Cellulose-Membranfilter vor der Verwendung. </li><li> Man löst 29,22 g Natriumchlorid (M w = 58.44 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 Puffer 20 mM NaH 2 PO 4 und 1 M NaCl - Puffer zu machen. Dies ist der Elutionspuffer für die Reinigung in Schritt 1.6). </li><li> Man löst 12,0 mg lyophilisiertes Cytochrom C (cyt c) in 6 ml pH 7 20 mM Phosphatpuffer. </li><li> Auflösen Getrennt 14,7 mg Dithiothreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) in 95,3 ul Reinstwasser zu einer 1 M Stammlösung vorzubereiten. Hinweis: Die DTT-Stammlösung sollte frisch hergestellt werden, da dieses Reagenz zu oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. </li><li> Pipette 60 ul der 1 M DTT - Lösung in die Proteinlösung den cyt c zu reduzieren. Die Farbe der Lösung von dunkelrot bis hellrot ändern beim Mischen. </li><li> Filtern Sie die reduzierte Proteinlösung durch ein 0,22 &amp; mgr; m geringer Proteinbindung PVDF-Spritzenfilter, bevor sie auf jedem chromatographischen Medium zu injizieren. </li><li> Bringen Sie ein 3,3 ml starke Kationenaustauschsäule zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis-Detektor eines Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) Instrument. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina Reinstwasser, gefolgt von 3 Säulenvolumina 20 mM pH 7 Phosphatpuffer, eine Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird. </li><li> Last 1 ml reduziertes Rohöl cyt c in die Injektionsschleife, und starten Sie eine Gradientenmethode 328-450 mM NaCl, über 5 Säulenvolumen. Überwachen Sie die 280 nm und 410 nm Kanäle des UV-Vis-Detektor, und sammeln die größte Spitze. </li><li> Erhöhung der Salzkonzentration auf 1 M für 2 Säulenvolumina iso-2 Cytochrom zu eluierene c, und nachdem die Säule gespült wurde, Re-Äquilibrieren der Säule mit 2 Säulenvolumina von 20 mM Phosphatpuffer , bevor der nächste grobe Aliquot einzuspritzen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9-1,10, bis das gesamte rohe Protein gereinigt worden ist. </li><li> Pool, die iso-1 enthaltenden Fraktionen und konzentriert sie mit einem 3,5 kDa Molekulargewichtsgrenze (MWCO) Spinfilter und Zentrifugieren bei 3000 x g. </li><li> Legen Sie das konzentrierte Protein in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel. </li><li> Bestimmen Sie die Konzentration des reinen, konzentrierten Proteinlösung von 10 &amp; mgr; l nehmen, Verdünnen auf 100 ul mit Reinstwasser und unter ein Absorptionsspektrum. Verwenden Sie ein geringes Volumen, 100 &amp; mgr; l Quartzküvette Protein Absorptionsspektren zu erhalten. Typischerweise ist das unverwässerte Proteinkonzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 &amp; mgr; M. <ol><li> Verwenden Sie die charakteristische 410 nm - Spitze von Cyt c , um den concentratio quantifizierenn mit dem Beer-Lambert - Gesetz mit einem molaren Absorptionswert von 97,6 cm -1 mM -1: A = ε × c × ι wobei A die Extinktion ist, ε der molare Extinktionskoeffizient, c die Konzentration in mM ist und ι die Weglänge der Küvette in cm 13. </li></ol></li><li> An dieser Stelle teilen das Protein in 1 ml Aliquots und gefroren halten bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. Cyt c kann ohne Verlust der Struktur oder Funktion eingefroren und aufgetaut werden, aber Wiederholungszyklen beginnt das Protein zu denaturieren. Hinweis: Die Proteine ​​tolerieren Einfrieren in unterschiedlichem Ausmaß. Zum Beispiel sollte grün fluoreszierende Proteine ​​5,9 nicht eingefroren werden, statt in einem Kühlschrank gelagert. </li></ol> 2. Synthese von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> Man löst 0,9 mg Ruthenium (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (jato) 2 -Maleimid, 0,975 &amp; mgr; mol, 6 Äquivalente) in 600 &amp; mgr; l Acetonitril. Hinweis: Bei Verwendung der Maleimid in Wasser löslich ist, um eine Stammlösung in Wasser herzustellen, anstatt Acetonitril. Es ist wichtig für das Maleimid löslich in dem Reaktionspuffer sein. Dimethylsulfoxid, N, N - Dimethylformamid und Acetonitril werden alle Hilfsstoffe gemeinhin verwendet in der Auflösung von niedrigem Molekulargewicht , 12 zu unterstützen, häufig hydrophobe Maleimid Reaktanden. </li><li> Bereiten einer Pufferlösung , enthaltend 100 mM Phosphatpuffer und 100 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, M w = 292,24 g / mol), die , wenn sie 7 bis 20 mM bei pH verdünnt festes Natriumhydroxid hinzu , bis das EDTA gelöst (mehrere Gramm typischerweise ) und stellen Sie den pH-Wert auf 7. </li><li> Man löst 2,87 mg Tris (2-carboxyethyl) phosphin - Hydrochlorid (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) in 1 ml Reinstwasser eine 10 mM Stammlösung herzustellen. Dieser Schritt ist der Important , um sicherzustellen , daß das Cystein auf dem Protein vollständig vor verringert Kupplung 15 an Maleimid. Anmerkung: Die Stammlösung sollte TCEP frisch für jede Reaktion hergestellt werden, da dieses Reagenz oxidative Deaktivierung in wässriger Lösung anfällig ist. </li><li> Kombinieren 11,4 ml Reinstwasser mit 3 ml 100 mM Phosphat / EDTA-Stammlösung in einem 50 ml Kunststoffröhrchen. Wenn weiter verdünnt mit Protein und Maleimid Stammlösungen der Pufferkonzentration 20 mM sein. Hinweis: Wenn das Protein markiert ist ein Transmembranprotein ist, stellen Sie sicher, dass ein geeignetes Reinigungsmittel zu dem Puffer hinzugefügt wird, das Protein löslich zu machen. Wenn ein Reinigungsmittel nicht verwendet wird, kann das Membranprotein langsam auszufallen, was sich negativ auf die Reaktionsausbeuten auswirken wird. Verwenden Sie das Waschmittel in allen nachfolgenden Reinigungsschritte. </li><li> 0.15 &amp; mgr; mol (3 ml einer 50 uM - Lösung, 1 Äquivalent) gereinigt cyt c mit dem Phosphat-EDTA - Puffer. </li><li> 7.5 ul der TCEP Lager solutIon (0,075 &amp; mgr; mol, 0,5 Äquivalente) zu der Proteinlösung und lassen Sie für 5 min Rühren jedes Protein zu reduzieren, die aufgrund Cysteinoxidation dimerisierte haben. Hinweis: TCEP nicht hinzufügen, wenn das Protein von Interesse nicht ohne weiteres dimerisieren. Überprüfen Sie dies durch ein Protein-Gel unter nicht reduzierenden Bedingungen läuft. </li><li> Hinzufügen 600 ul der Acetonitrillösung von Ru (II) (tpy) 2 -maleinimid der reduzierten, gepufferten Lösung von cyt c und lassen das Reaktionsgemisch unter Rühren im Dunkeln bei RT 24 h. </li><li> Konzentriere das Reaktionsgemisch mit 3,5 kDa MWCO Spinfilter, bei 3000 × g zentrifugiert, wiederholen 2-3 mal mit frischem 20 mM Phosphatpuffer, bis das Filtrat klar bleibt. Entfernen Sie so viel nicht umgesetzte Maleimid aus dem Reaktionsgemisch wie möglich, bevor die nächste Stufe der Reinigung. Anmerkung: An diesem Punkt kann die rohe Biokonjugation Gemisch im Kühlschrank aufbewahrt werden, in der Dunkelheit. Es ist wichtig, um nicht umgesetztes Maleimid centr Farbstoff zu entfernenifuge Dialyse vor der Lagerung als Maleinimid langsam und unspezifisch mit Lysinresten auf der Oberfläche des Proteins reagieren. </li></ol> 3. Reinigung von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> Man löst 2,4 g Natriumdihydrogenphosphat und 29.22 g Natriumchlorid in 1 l Reinstwasser eine Pufferlösung herzustellen , die 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl. Dies ist der Laufpuffer für die immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie (IMAC) Reinigung. </li><li> Man löst 17 ​​g Imidazol (M w = 68,077 g mol -1) in 500 ml des 20 mM NaH 2 PO 4 und 0,5 M NaCl - Puffer. Dies ist der Elutionspuffer für die IMAC-Reinigung. </li><li> Der pH-Wert beider Puffer pH 7 unter Verwendung von 1 M NaOH oder HCl, und filtern sie durch 0,22 um regenerierte Cellulosemembranen vor der Verwendung in der FPLC. </li><li> Da die IMAC Spalten gekauft werden ohne Metallionen ausgeliefert auf den col geladenUMN, bereiten Sie die Spalte für eine Ni 2+ -basierten Reinigung durch die Säule mit 3 ml Reinstwasser Waschen, 3 ml 100 mM Nickelacetat - Lösung und 6 ml Reinstwasser. Wenn die Spalte nicht sofort durch 3 ml 20% igem Ethanol und speichern die Säule im Kühlschrank waschen verwendet werden Bakterienwachstum zu verhindern. </li><li> Bringen Sie ein Ni 2+ -beladene 1 ml IMAC - Säule auf die FPLC zwischen der Injektionsschleife und UV-Vis - Detektor. </li><li> Äquilibrierung der Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl-Puffer mit einem Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml / min verwendet wird. </li><li> Last 100 ul des rohen Reaktionsgemisches (filtriert durch ein 0,22 um - Spritzenfilter) auf der Ni 2+ IMAC - Säule. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer läuft nicht umgesetztem cyt c zu eluieren, gefolgt von einem Imidazol - Gradienten von 0 bis 125 mM über 3 Säulenvolumina des Rutheniums bisterpyridine-Cytochrom c Biokonjugat zu eluieren (Ru (II) -cyt c) . </li><li> Waschen Sie die cPALTE mit 250 mM Imidazol-Puffer für 5 Säulenvolumina, anschließend erneut äquilibriert Die Säule wird mit 20 mM Phosphat, 0,5 M NaCl und wiederhole Schritt 3.7, bis das gesamte rohe Biokonjugat gereinigt wurde. </li><li> Pool die Biokonjugat Fraktionen und konzentrieren sie mit einem 3,5 kDa MWCO Spinfilter, Zentrifugieren bei 3000 x g. </li><li> Legen Sie das konzentrierte Biokonjugat in 3,5 kDa MWCO Dialysekassetten und dialysiert gegen Reinstwasser über Nacht, mit 2 Wasserwechsel. </li><li> Bestimmung der Konzentration des reinen, konzentrierten Biokonjugat Lösung durch UV-Vis, unter Verwendung der gleichen molaren Absorptionswert als iso-1 - Cytochrom c (97,6 mM -1 cm -1) bei 410 nm. Typischerweise ist die Biokonjugat Konzentration in der Größenordnung von 50 bis 100 uM. </li><li> Teilen Sie die Biokonjugat in 25 ul Aliquots und halten gefroren bei -20 ° C, bis sie benötigt werden. </li></ol> 4. Charakterisierung von Cytochrom c -Biokonjugaten <ol><li> AbhaltenDigen Biokonjugat Masse durch MALDI-TOF-MS <ol><li> Man löst 10 mg Kaffeesäure in 1 ml eines Acetonitril / Wasser / Trifluoressigsäure-Lösung (80: 20: 0,1, v / v / v). </li><li> Verdünne 5 &amp; mgr; l konzentrierte Proteinlösung mit 5 ul Kaffeinsäure Lösung. </li><li> Spot 0,5 ul Kaffeinsäure Lösung auf dem MALDI Zielplatte und die Lösung zu trocknen. </li><li> Spot 0,5 &amp; mgr; l der Probe / Matrix-Lösung im oberen Teil der Kaffeesäure Stelle, kann der Stelle zu trocknen. Beschmutzen weitere 0,5 &amp; mgr; l Probenmatrix auf dieses auf &quot;Sandwich&quot; der Probe zwischen den Schichten der Matrix und trocknen lassen. </li><li> Erwerben Massenspektren im linearen Modus geeignet Geräteeinstellungen für Proteine ​​16 verwenden. </li></ol></li><li> Untersuchung der Biokonjugate durch Gelelektrophorese <ol><li> Herstellung von 10 ul jeder Proteinprobe durch Verdünnen von Proteinproben mit vorgemischten Lithiumdodecylsulfat (LDS, pH 8,4) Puffer (4x) t zu laufenoa Endkonzentration von etwa 20 &amp; mgr; g pro Vertiefung. Für Brunnen, die reduzierenden Bedingungen benötigen, fügen 1 ul 500 mM Dithiothreitol (DTT) Reduktionsmittel (10x). </li><li> Wärme Proben bei 70 ° C für 10 min. </li><li> 50 ml vorgemischtes 1 M MES, 1 M Tris-Base, 2% SDS, 20 mM EDTA (pH 7,7) Laufpuffergemisch (20x) von einer handelsüblichen Quelle auf 950 ml Reinstwasser des Gel-Laufpuffer herzustellen. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Kamm aus dem Gel und legen Sie das Gel in dem Gel Lauftank. Füllen Sie den Tank mit Gel-Laufpuffer, so dass die Vertiefungen mit Puffer bedeckt sind. </li><li> Laden Sie die Proben vorsichtig auf eine Fertig 12% Bis-Tris, 1 mm, 10-Well-Gel lange Pipettenspitzen beim Laden zu unterstützen. Laden Sie das färbten 10 Protein-Molekulargewichtsmarker (3-188 kDa) in eine mittlere Vertiefung der Gel-Analyse zu unterstützen. </li><li> Führen Sie das Gel bei 200 V konstanter Spannung für 35 min. </li><li> Stain das Gel mit einem kommerziellen Coomassieblau-Lösung für 2 Stunden und waschen mit ultrapure Wasser für 48 Stunden. </li></ol></li><li> Bestimmung von Biokonjugat Reinheit durch UV-Vis - Spektroskopie <ol><li> Bereiten 120 &amp; mgr; l von 5 &amp; mgr; M Lösungen von Ru (II) (tpy) 2 -maleimid, iso-1 cyt c und Ru (II) -cyt c. </li><li> Messen der Basislinienspektrum der Quarzküvette nur Reinstwasser, von 250 nm bis 650 nm enthält. </li><li> Messen Sie das Spektrum der einzelnen Komponenten gewährleistet die Küvette gespült und zwischen jeder Messung getrocknet. </li><li> Plotten die Absorption jeder Komponente als eine Funktion der Wellenlänge, und vergleichen die lineare Summe der Ausgangsmaterialien mit dem Endprodukt zu bestimmen , ob eine 1: 1 - Verhältnis von Ru (II) (tpy) -maleinimid 2 bis cyt c reagiert hat. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Reinigung der Ausgangsmaterialien vor einer Biokonjugation ist von größter Bedeutung. Proteine, erhalten aus kommerziellen rekombinanten Quellen enthalten oft andere Isoformen des Proteins von Interesse, die unterschiedliche Oberflächenchemie und Reaktivität aufweisen. Beispielsweise in dem beschriebenen Biokonjugation, enthält das handelsübliche cyt c ein Gemisch aus beiden iso-1 und iso-cyt c 2 12,14,17. Iso-2 und iso-1 Formen von Cytochrom c sind weitgehend homolog mit der ...

Biokonjugation beinhaltet die Verknüpfung kovalent ein Biomolekül mit einem anderen oder mit einem synthetischen Molekül, wie ein Farbstoff, Arzneimittel oder einem Polymer. Protein Biokonjugation Methoden werden nun ausführlich in vielen Chemie, Biologie und Nanotechnologie Forschungsgruppen mit Anwendungen , die von fluoreszierenden Farbstoffmarkierung 1,2, Herstellung von Protein (Antikörper) -prodrugs 3 (Antikörper - Wirkstoff - Konjugate - ADCs) verwendet Synthese von Protein - Dimere 4,5 bis hin zu selbstorganisierenden Protein-Polymer - Hybriden 6,7 verwendet in den Bereich Nanomedizin 8 und Systemchemie 9. Spezifität der Chemie für die Biokonjugation verwendet, während nicht immer kritisch, ist von größter Bedeutung für die meisten funktionellen Protein Biokonjugate, um nicht mit der aktiven Stelle des Zielproteins zu stören. Die ideale Biokonjugation Reaktion muss mehrere Kriterien erfüllen, darunter: i) Targeting seltene oder einzigartige Stellen auf dem Protein von Interesse,ii) werden selektiv in Richtung auf dieses Ziel, iii) gehen unter nicht-denaturierenden Bedingungen Proteins zu vermeiden Entfalten und iv) werden mit hoher Ausbeute als das Zielprotein bei unteratmosphärischem millimolar Konzentration der Regel nur zur Verfügung steht. Das Maleimid - Cystein Michael Zusätzlich kommt in der Nähe , alle diese Kriterien zu erfüllen, und hat aus diesem Grund lange einen besonderen Status im Bereich der Biokonjugat Chemie 10 beansprucht. Dies ist, weil i) viele Proteine ​​nur einen Cysteinrest an ihrer Oberfläche enthalten, können genetisch es so konstruiert werden, ii) in der richtigen pH der Reaktion auf Cystein hochselektiv ist, iii) es verläuft glatt in wässrigen Puffern und iv) es ist sehr schnell mit der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von Maleimiden in Cystein enthaltenden Proteinen berichtet überschreiten 5,000 M -1 sec -1 in einigen Fällen 11. Sofern das Protein von Interesse einen kleinen (≈ 5-10%) Menge an organischem Co-Lösungsmittel 12, fast jede Maleimid-funktionalisierten Farbstoff tolerieren kann, polymer, Oberfläche oder ein anderes Protein können an Proteine ​​gebunden werden. Darüber hinaus sind Maleinimide spezifischer für Cysteine ​​an Proteinen als iodoacetamides, die Reaktion mit anderen Nucleophilen bei erhöhten pH anfälliger sind; und stabiler als Disulfid-basierte Konjugationen , die bei einem sauren pH gehalten werden müssen Disulfidaustausch 13 zu verhindern. Hier berichten wir über ein generisches Protokoll für die Konjugation von Maleimid-funktionalisierten Molekülen an ein Protein , einen einzelnen Cysteinrest unter Verwendung der Reaktion zwischen einem Ru (II) -Basis Chromophor und dem Redoxprotein Cytochrom c als Beispiel enthalten. Dieses Protokoll ist gleichermaßen auf die meisten anderen Proteine, die eine zugängliche Oberfläche Cysteinrest und das entsprechende Maleimid-funktionalisierten Ziel, sei es ein anderes Protein, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Chromophor oder ein synthetisches Polymer enthält.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71496</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">dithiothreitol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">TSKgel SP-5PW</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Tosoh SP-5PW, 07161</td>
			<td>3.3 mL strong cation exchange column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">UFC900308</td>
			<td>3.5 kDa spin filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">66333</td>
			<td>3.5 kDa dialysis cassetes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ru(II) bisterpyridine maleimide</td>
			<td style="width:196px;">Lab made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>see ref (14)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">03609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">93284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">imidazole</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">nickel acetate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">244066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">AcroSep IMAC Hypercell column</td>
			<td style="width:196px;">Pall</td>
			<td style="width:151px;">via VWR: 569-1008</td>
			<td>1 mL IMAC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron cellulose membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Whatman</td>
			<td style="width:151px;">Z697958</td>
			<td>47 mm filter for buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron PVDF membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td>syringe filters for proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hydrochloric acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">84426</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">caffeic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">60018</td>
			<td>MALDI matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">91707</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC6060</td>
			<td>Coomassie blue solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0342BOX</td>
			<td>precast protein gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC5925</td>
			<td>premade protein ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0008</td>
			<td>premade gel sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0004</td>
			<td>premade gel reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>premade gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Acta FPLC</td>
			<td style="width:196px;">GE</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cary 50 Bio Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Varian-Agilent</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Milli-Q ultrapure water dispenser</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Low volume UV-Vis Cuvette</td>
			<td style="width:196px;">Hellma</td>
			<td style="width:151px;">105-201-15-40</td>
			<td>100 microliter cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Die Synthese von Biokonjugaten wird durch drei primäre Methoden bestätigt: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), Polyacrylamid - Gelelektrophorese und UV-VIS (UV-Vis) Spektroskopie, wie in den 2, 3 und 4. Eine Massenzunahme der Masse des beigefügten kleine Molekül und das Fehlen eines nicht - umgesetztem Protein entspricht zeigt die erfolgreiche kovalente Verknüpfung von Ru (II) (tpy) -maleinimi...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat.

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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38.2K Aufrufe.  The University of New South Wales.  Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat. 

Serie: Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order to streamline synthesis by saving steps, time and material compared to conventional methods that require the introduction and removal of activating or directing groups. Therefore, the functionalization of C-H bonds is also attractive for green chemistry. Under oxidative conditions, two C-H bonds or one C-H and one heteroatom-H bond can be transformed to C-C and C-heteroatom bonds, respectively. Often these oxidative coupling reactions require synthetic oxidants, expensive catalysts or high temperatures. Here, we describe a two-step procedure to functionalize indole derivatives, more specifically tetrahydrocarbazoles, by C-H amination using only elemental oxygen as oxidant. The reaction uses the principle of C-H functionalization via Intermediate PeroxideS (CHIPS). In the first step, a hydroperoxide is generated oxidatively using visible light, a photosensitizer and elemental oxygen. In the second step, the N-nucleophile, an aniline, is introduced by Br&#248;nsted-acid catalyzed activation of the hydroperoxide leaving group. The products of the first and second step often precipitate and can be conveniently filtered off. The synthesis of a biologically active compound is shown.

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

A two-step procedure for the synthesis of pharmaceutically active indole-derivatives by C-H functionalization with anilines is described, using photo- and Br&#248;nsted acid catalysis.

Synthese von Antivirale Tetrahydrocarbazolderivate durch photochemische und Säure-katalysierten CH-Funktionalisierung über Zwischen Peroxide (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Forschung

Chemie

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Synthese und Charakterisierung von funktionalisierten Metall-organische Gerüste

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the material with Au(III) ions. The synthesis method was derived from a sol-gel process used to produce micron-sized monosodium titanate (MST), with several key modifications, including altering reagent concentrations, omitting a particle seed step, and introducing a non-ionic surfactant to facilitate control of particle formation and growth. The resultant nMST material exhibits spherical-shaped particle morphology with a monodisperse distribution of particle diameters in the range from 100 to 150&#160;nm. The nMST material was found to have a Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area of 285 m2g-1, which is more than an order of magnitude higher than the micron-sized MST. The isoelectric point of the nMST measured 3.34 pH units, which is a pH unit lower than that measured for the micron-size MST. The nMST material was found to serve as an effective ion exchanger under weakly acidic conditions for the preparation of an Au(III)-exchange nanotitanate. In addition, the formation of the corresponding peroxotitanate was demonstrated by reaction of the nMST with hydrogen peroxide.

The surfactant mediated sol-gel synthesis of nanosized monosodium titanate is described, along with preparation of the corresponding peroxide modified material. An ion-exchange reaction with Au(III) is also presented.

Synthese und Reaktionschemie von nanoskaligen Mononatrium Titanat

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

The Synthesis of [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- Using a Metastable Sn(I) Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a sterically demanding ligand, has increased in recent years. The metastable Sn(I) halide is synthesized at&#160;&#34;outer space conditions&#34; via the preparative co-condensation technique. Thereby, the subhalide is synthesized in an oven at high temperatures, around 1,300 &#176;C, and at reduced pressure by the reaction of elemental tin with hydrogen halide gas (e.g., HCl). The subhalide (e.g., SnCl) is trapped within a matrix of an inert solvent, like toluene at -196 &#176;C. Heating the solid matrix to -78 &#176;C gives a metastable solution of the subhalide. The metastable subhalide solution is highly reactive but can be stored at -78 &#176;C for several weeks. On heating the solution to room temperature, a disproportionation reaction occurs, leading to elemental tin and the corresponding dihalide. By applying bulky ligands like Si(SiMe3)3, the intermediate metalloid cluster compounds can be trapped before complete disproportionation to elemental tin. Hence, the reaction of a metastable Sn(I)Cl solution with Li-Si(SiMe3)3 gives [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- 1 as black crystals in high yield. 1 is formed via a complex reaction sequence including salt metathesis, disproportionation, and degradation of larger clusters. Further, 1 can be analyzed by various methods like NMR or single crystal X-ray structure analysis.

The Synthesis of [Sn10SiSiMe334]2- Using a Metastable SnI Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The disproportionation reaction of a metastable Sn(I) chloride solution, obtained via the preparative co-condensation technique, is used for the synthesis of a metalloid tin cluster compound.

Die Synthese von [Sn<sub&gt; 10</sub&gt; (Si (SiMe<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 4</sub&gt;]<sup&gt; 2</sup<sup&gt; -</sup&gt; Eine metastabile Sn (I) halogenidlösung Verwendung über eine Co-Kondensationstechnik Synthetisierter

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

Synthese von Substrat-gebundenen Au Nanodrähten über eine aktive Oberfläche Wachstumsmechanismus

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Eine schnelle Synthese-Methode für Au, Pd und Pt-Aerogelen über lösungsorientierte Direktreduktion

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Synthese von Estern über ein grüner Steglich-Veresterung in Acetonitril

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-basierte zellfreie Proteinsynthese: Protokolle für eine robuste, flexible und zugängliche Plattform-Technologie

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock copolymers are produced by one of three techniques: thin film rehydration, solvent switching or polymerization-induced self-assembly, and produce only flexible, polydisperse cylinders. Crystallization-driven self-assembly (CDSA) is a method which can produce cylinders with these properties, by stabilizing structures of a lower curvature due to the formation of a crystalline core. However, the living polymerization techniques by which most core-forming blocks are formed are not trivial processes and the CDSA process may yield unsatisfactory results if carried out incorrectly. Here, the synthesis of cylindrical nanoparticles from simple reagents is shown. The drying and purification of reagents prior to a ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone catalyzed by diphenyl phosphate is described. This polymer is then chain extended by methyl methacrylate (MMA) followed by N,N-dimethyl acrylamide (DMA) using reversible addition&#8722;fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, affording a triblock copolymer that can undergo CDSA in ethanol. The living CDSA process is outlined, the results of which yield cylindrical nanoparticles up to 500 nm in length and a length dispersity as low as 1.05. It is anticipated that these protocols will allow others to produce cylindrical nanostructures and elevate the field of CDSA in the future.

Crystallization-driven self-assembly (CDSA) displays the unique ability to fabricate cylindrical nanostructures of narrow length distributions. The organocatalyzed ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone and subsequent chain extensions of methyl methacrylate and N,N-dimethyl acrylamide are demonstrated. A living CDSA protocol that produces monodisperse cylinders up to 500 nm in length is outlined.

Synthese von monodispersen zylindrischen Nanopartikeln durch kristallisationsgesteuerte Selbstmontage von biologisch abbaubaren Blockcopolymeren

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...