We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.

Nota: O seguinte protocolo é concebido para a síntese de um bioconjugado de proteína-corante, como mostrado na Figura 1 É um protocolo geral para a reacção de uma maleimida com cisteína superfície livre que contêm proteínas, com as notas inseridas onde aplicável para ajudar com a proteína de membrana. bioconjugados, bioconjugados de proteína-polímero, e dímero de proteína sintética (proteína-proteína) bioconjugados. Neste caso particular, a proteína 1 de iso-citocromo C tem um resíduo de cisteína disponível para reagir superfície que permite uma marcação altamente específico para ocorrer. Se uma proteína de interesse tem múltiplos resíduos de cisteína, o mesmo protocolo aplicável, embora com a perda de especificidade e homogeneidade do produto. Resíduos de lisina superfície Química segmentação, usando n hidroxissuccinimidilo ésteres ou isotiocianatos, pode ser uma abordagem mais simples se a especificidade não é necessária. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54157/54157fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. Esquema de Reacção bioconjugação. Como um exemplo de caso, uma colheita de luz, molécula antena baseada em ruténio vai ser ligado a citocromo C por meio de adição de Michael de um pingente maleimida na molécula antena baseada em ruténio e um resíduo de cisteína exposto (CYS102) na proteína. A área vermelha da superfície do cit c indica o grupo heme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54157/54157fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 1. A purificação do citocromo C Nota: Este passo não é aplicável para todas as proteínas. No entanto, é importante saber que uma proteína obtida a partir de um fornecedor comercial, pode conter outras isoformas de proteínas não desejadas que podem necessitar de ser removido por purificação adicional 13. <ol><li> Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio (M w = 120 g mol-1) em 1 L de água ultrapura ao PRepare uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4. Ajustar o pH com NaOH 1 M para pH 7. Nota: Os tampões de fosfato utilizados no presente protocolo deve ser preparado de fresco numa base diária, e filtrada através de um filtro de membrana de celulose de 0,2 um antes da utilização. </li><li> Dissolve-se 29,22 g de cloreto de sódio (M w = 58,44 g mol-1) em 500 ml de tampão de NaH 2 PO 4 20 mM para fazer uma mM de NaH 2 PO 4 20 e tampão de NaCl 1 M. Este é o tampão de eluição para a purificação no passo 1.6). </li><li> Dissolve-se 12,0 mg de liofilizado de citocromo C (cyt C) em 6 ml de pH 7 a 20 mM de tampão de fosfato. </li><li> Separadamente dissolver 14,7 mg de ditiotreitol (DTT, M w = 154,25 g / mol) em 95,3 ul de água ultrapura para preparar uma solução de reserva 1 M. Nota: A solução de estoque de DTT deve ser preparado de fresco, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa. </li><li> Pipette 60 ul de solução de 1 M DTT para a solução de proteína para reduzir o citocromo c. A cor da solução muda de vermelho escuro para vermelho claro após a mistura. </li><li> Filtrar a solução de proteína reduzida através de um filtro de seringa PVDF de ligação 0,22 baixa proteína antes de injetar em qualquer mídia cromatográfica. </li><li> Anexar uma coluna de troca catiônica 3,3 ml forte entre o septo de injecção e detector UV-Vis de um Cromatografia Líquida (FPLC) instrumento rápido Protein. </li><li> Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de água ultrapura, seguido por 3 volumes de tampão fosfato pH 7 a 20 mM de coluna, utilizando uma taxa de fluxo de 1 ml / min. </li><li> Carga 1 ml de reduzida cit bruto c para o ciclo de injeção, e iniciar um método de gradiente de 328-450 mM de NaCl, ao longo de 5 volumes de coluna. Monitorar os 280 nm e 410 nm canais do detector UV-Vis, e recolher o maior pico. </li><li> Aumentar a concentração de sal a 1 M para 2 volumes de coluna para eluir iso-2 citocromoe C, e depois a coluna foi lavada, re-equilibrar a coluna com 2 volumes de tampão fosfato 20 mM de coluna antes de injectar o próximo aliquota em bruto. </li><li> Repita os passos 1,9-1,10 até que toda a proteína em bruto foi purificado. </li><li> Reunir as fracções contendo iso-1 e concentrá-los usando um 3,5 kDa de peso molecular de corte (MWCO) filtro de centrifugação e centrifugação a 3.000 x g. </li><li> Carregar a proteína concentrada em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água. </li><li> Determinar a concentração da solução de proteína pura, concentrou-se, tendo de 10 ul, diluindo-a com 100 ul de água ultrapura, e tendo um espectro de absorvância. Use um volume baixo, 100 ul cuvette de quartzo para obter espectros absorção de proteínas. Tipicamente, a concentração de proteína não diluído é da ordem de 50 - 100 pM. <ol><li> Use a característica de pico 410 nm de cit c quantificar o Concentraçãn usando a lei de Beer-Lambert com um valor de absortividade molar de 97,6 cm -1 mM -1: A = ε × c × ι em que A é a absorvância, ε é a absortividade molar, c é a concentração de mM, e ι é o comprimento do percurso da tina em 13 cm. </li></ol></li><li> Neste ponto, a proteína dividir em alíquotas de 1 ml e manter congelados a -20 ° C até serem necessárias. Cit c podem ser congeladas e descongeladas sem perda da estrutura ou função, mas os ciclos de repetição irá começar a desnaturar a proteína. Nota: Proteínas tolerar o congelamento em graus diferentes. Por exemplo, proteínas fluorescentes verdes 5,9 não deve ser congelado, em vez armazenada no frigorífico. </li></ol> 2. Síntese de citocromo c bioconjugados <ol><li> Dissolve-se 0,9 mg de ruténio (II) bisterpyridine maleimide (Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, 0,975 mol, 6 equivalentes) em 600 ul de acetonitrilo. Nota: Se a maleimida usado é solúvel em água, preparar uma solução de reserva em água em vez de acetonitrilo. É importante para a maleimida para ser solúvel no tampão de reacção. Dimetilsulfóxido, N, N-dimetilformamida, acetonitrilo e são comumente utilizados adjuvantes para auxiliar na dissolução de baixo peso molecular de 12, muitas vezes os reagentes de maleimida hidrofóbicos. </li><li> Prepara-se uma solução tampão contendo tampão fosfato 100 mM e 100 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, M w = 292,24 g / mol), que, quando diluídas para 20 mM a pH 7. Adiciona-se hidróxido de sódio sólido até que o EDTA é dissolvido (tipicamente vários gramas ) e ajustar o pH a 7. </li><li> Dissolve-se 2,87 mg de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP 15, M w = 286,65 g / mol) em 1 ml de água ultrapura para preparar uma solução stock de 10 mM. Esta etapa é a importaçãoformiga para assegurar que a cisteína na proteína é completamente reduzido antes da maleimida acoplamento 15. Nota: A solução stock de TCEP deve ser preparada de fresco para cada reacção, quando o reagente é susceptível a desactivação oxidativa em solução aquosa. </li><li> Combine 11,4 ml de água ultrapura com 3 ml de solução de partida de fosfato / EDTA 100 mM num tubo de plástico de 50 ml. Quando diluída ainda mais com soluções de proteína e banco de maleimida a concentração do tampão será de 20 mM. Nota: Se a proteína a ser marcado é uma proteína transmembranar, assegurar que um detergente adequado é adicionado ao tampão para solubilizar a proteína. Se um detergente não é utilizada a proteína de membrana pode-se lentamente precipitar, o que terá um impacto negativo rendimentos da reacção. Usar o detergente em todos os passos de purificação subsequentes. </li><li> Adicionar 0,15 umol (3 ml de uma solução a 50 ^ M, 1 equivalente) de purificado cit c para o tampão de fosfato-EDTA. </li><li> Adicionar 7,5 mL do estoque solut TCEPde iões (0,075 mol, 0,5 equivalentes) à solução de proteína e deixar de se agitar durante 5 minutos para reduzir qualquer proteína que pode ter dimerizado devido à oxidação de cisteína. Nota: Não adicione TCEP se a proteína de interesse não dimerize prontamente. Verifique isto executando um gel de proteína, sob condições não redutoras. </li><li> Adicionar 600 ul da solução de acetonitrilo de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para a solução reduzida, tamponada de citocromo C, e deixar a mistura reaccional sob agitação, no escuro, à TA, durante 24 h. </li><li> Concentra-se a mistura de reacção usando filtros de spin 3,5 kDa MWCO, centrifugação a 3000 xg, repetindo-se 2-3 vezes com tampão fosfato 20 mM fresco até que o filtrado corre claro. Remover o máximo de maleimida que não reagiu a partir da mistura reaccional quanto possível antes que a próxima etapa de purificação. Nota: Neste ponto, a mistura de bioconjugação em bruto pode ser armazenado no frigorífico, no escuro. É importante remover a tintura maleimida que não reagiu por centrifuge diálise antes da armazenagem como a maleimida pode-se lentamente e de forma não específica reagir com resíduos de lisina na superfície da proteína. </li></ol> 3. Purificação de citocromo c bioconjugados <ol><li> Dissolve-se 2,4 g de di-hidrogenofosfato de sódio e 29,22 g de cloreto de sódio em 1 L de água ultrapura para preparar uma solução tampão contendo 20 mM de NaH 2 PO 4 e NaCl 0,5 M. Este é o tampão de corrida para a purificação por cromatografia de afinidade de metal-imobilizado (IMAC). </li><li> Dissolve-se 17 g de imidazol (M w = 68,077 g mol-1) em 500 ml de 20 mM de NaH 2 PO 4 e tampão de 0,5 M de NaCl. Este é o tampão de eluição para a purificação IMAC. </li><li> Ajustar o pH de ambas as memórias intermédias para pH 7 utilizando 1 M de NaOH ou HCl, e filtrá-los através de membranas de 0,22 um antes da utilização de celulose regenerada na FPLC. </li><li> Como as colunas IMAC comprados são enviados sem quaisquer iões metálicos carregados no colUMN, preparar a coluna para um de Ni 2+ com base na purificação por lavagem da coluna com 3 ml de água ultrapura, 3 ml de solução de acetato de níquel de 100 mM, e 6 ml de água ultrapura. Se a coluna não é para ser utilizada imediatamente através de lavar 3 ml de etanol a 20% e armazenar a coluna no frigorífico para prevenir o crescimento bacteriano. </li><li> Anexar uma Ni 2+ -loaded 1 ml coluna IMAC ao FPLC entre o septo de injecção e detector UV-Vis. </li><li> Equilibrar a coluna com 3 volumes de coluna de fosfato de 20 mM, tampão de NaCl 0,5 M utilizando uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min. </li><li> Carga de 100 ul de mistura de reacção em bruto (filtrado através de um filtro de seringa de 0,22? M) na coluna de Ni 2+ IMAC. Lavar a coluna com 3 volumes de coluna de tampão de corrida para eluir não reagiu cyt C, seguido por um gradiente de imidazole 0-125 mM ao longo de 3 volumes de coluna para eluir o ruténio bisterpyridine-citocromo c bioconjugado (Ru (II) -CYT c) . </li><li> Lavou-se a column com tampão de imidazole 250 mM para 5 volumes de coluna, em seguida, re-equilibrar a coluna com fosfato 20 mM, NaCl 0,5 M e repetir o passo 3.7 até que todo o bioconjugado em bruto foi purificado. </li><li> Reunir as fracções Bioconjugate e concentrá-los usando um kDa MWCO filtro de rotação 3.5, centrifugação a 3.000 x g. </li><li> Carregar o bioconjugado concentrado em 3,5 cassetes de diálise kDa MWCO e diálise contra ultrapura água durante a noite, com 2 mudanças de água. </li><li> Determinar a concentração da solução bioconjugado puro, concentrou-se por UV-Vis, utilizando o mesmo valor de absortividade molar de iso-1 citocromo C (97,6 mM -1 cm -1) a 410 nm. Tipicamente, a concentração bioconjugado é da ordem de 50 - 100 pM. </li><li> Divida bioconjugado em 25 mL alíquotas e mantenha congelado a -20 ° C até serem necessárias. </li></ol> 4. Caracterização do citocromo C bioconjugados <ol><li> dissuadirminação da massa bioconjugado por MALDI-TOF MS <ol><li> Dissolve-se 10 mg de ácido cafeico, em 1 ml de uma solução de acetonitrilo / água / ácido trifluoroacético (80: 20: 0,1, v / v / v). </li><li> Dilui-se 5 ul de solução de proteína concentrada com 5 ul de solução de ácido cafeico. </li><li> Ponto de 0,5 uL de solução de ácido cafeico na placa alvo de MALDI e permitir que a solução seque. </li><li> Ponto de 0,5 ul da solução da amostra / matriz em cima deste local ácido cafeico, permitir que o local para secar. Manchar mais 0,5 ul de matriz da amostra no topo desta para &quot;sanduíche&quot; a amostra entre as camadas de matriz e deixar secar. </li><li> Adquirir espectros de massa no modo linear usando as configurações de instrumento adequado para proteínas 16. </li></ol></li><li> Investigação de bioconjugados por electroforese em gel <ol><li> Preparar 10 ul de cada amostra de proteína para ser executado por diluição de amostras de proteína pré-misturados com sulfato de dodecilo de lítio (LDS, pH 8,4) tampão (4x) tOA concentração final de aproximadamente 20 ug por poço. Para poços que requerem condições de redução, adicionar 1 ul de ditiotreitol 500 mM (DTT) agente (10x) de redução. </li><li> amostras de calor a 70 ° C durante 10 min. </li><li> Adicionar 50 ml da pré-mistura 1 M de MES, 1 de base Tris, 2% de SDS, 20 mM de EDTA (pH 7,7) executando mistura tampão (20x) de uma fonte comercial e 950 ml de água ultrapura para preparar o tampão de gel de escoamento. </li><li> Remover o pente de plástico a partir do gel e colocar o gel no tanque de gel de corrida. Encher o tanque com tampão de gel de corrida de modo que as cavidades são cobertas com tampão. </li><li> amostras de carga com cuidado sobre a pré-moldado 12% Bis-Tris, de 1 mm, gel de 10 poços utilizando pontas de pipeta longos para ajudar no carregamento. Carregar o prestained 10 proteína marcador de peso molecular (3-188 kDa) num poço de meio do gel para auxiliar a análise. </li><li> Submeter o gel a 200 V de voltagem constante durante 35 min. </li><li> Corar o gel com uma solução de azul de Coomassie comercial durante 2 horas, e lava-se com ultrapágua ure por 48 hr. </li></ol></li><li> Determinação da pureza bioconjugado por espectroscopia UV-Vis <ol><li> Prepare a 120 ul de 5 uM soluções de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida, iso-cit c 1, e Ru (II) -CYT C. </li><li> Medir o espectro de linha de base da cuvete de quartzo contendo apenas água ultrapura, de 250 nm a 650 nm. </li><li> Medir o espectro de cada componente, garantindo a cuvete é enxaguado e seco entre cada medição. </li><li> Traça-se a absorvância de cada componente como uma função do comprimento de onda, e comparar a soma linear dos materiais de partida com o produto final para determinar se uma proporção de 1: 1 de Ru (II) (tpa) 2 -maleimida para cit c reagiu. </li></ol></li></ol>

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	<li>Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+covalent+labeling+of+recombinant+protein+molecules+inside+live+cells.">Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells.</a> Science. 281, 269-272 (1998).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+Fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).</li><li>Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+of+anticancer+drugs+through+endogenous+monoclonal+antibody+cysteine+residues.">Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues.</a> Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).</li><li>Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+site-specific+ScFv+PEGylation+for+tumor-targeting+pharmaceuticals.">Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals.</a> Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).</li><li>Hvasanov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Pot+Synthesis+of+High+Molecular+Weight+Synthetic+Heteroprotein+Dimers+Driven+by+Charge+Complementarity+Electrostatic+Interactions.">One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions.</a> J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).</li><li>Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Well-defined+protein-polymer+conjugates--synthesis+and+potential+applications.">Well-defined protein-polymer conjugates--synthesis and potential applications.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).</li><li>Lutz, J. F., B&#246;rner, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modern+trends+in+polymer+bioconjugates+design.">Modern trends in polymer bioconjugates design.</a> Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).</li><li>Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+functionalization+strategies+and+biomedical+applications+of+targeted+biodegradable/biocompatible+polymer-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery.</a> Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).</li><li>Wong, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymersomes+Prepared+from+Thermoresponsive+Fluorescent+Protein-Polymer+Bioconjugates:+Capture+of+and+Report+on+Drug+and+Protein+Payloads.">Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads.</a> Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).</li><li>Hermanson, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioconjugate Techniques. , (2013).</li><li>Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+cysteines+substituted+in+the+amphipathic+N-terminal+tail+of+a+bacterial+potassium+channel+with+hydrophilic+and+hydrophobic+maleimides.">Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).</li><li>Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+room+temperature+photo-induced+electron+transfer+in+biologically+active+bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome+c+bioconjugates+and+the+effect+of+solvents+on+the+bioconjugation+of+cytochrome+c.">Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c.</a> Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).</li><li>Borges, C. R., Sherma, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+the+Analysis+of+Cysteine+Sulfhydryls+and+Oxidative+Protein+Folding.">Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding.</a> Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).</li><li>Peterson, J. R., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+purification+of+terpyridine-cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates.</a> Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).</li><li>Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimising+the+synthesis,+polymer+membrane+encapsulation+and+photoreduction+performance+of+Ru(II)-+and+Ir(III)-bis(terpyridine)+cytochrome+c+bioconjugates.">Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates.</a> Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).</li><li>Signor, L., Boeri Erba, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+Laser+Desorption/Ionization+Time+of+Flight+(MALDI-TOF)+Mass+Spectrometric+Analysis+of+Intact+Proteins+Larger+than+100+kDa.">Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa.</a> J. Vis. Exp. , e50635 (2013).</li><li>Foucher, M., Verdi&#232;re, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+presence+of+a+non-trimethylated+iso-1+cytochrome+c+in+a+wild-type+strain+of+Saccharomyces+cerevisiae).">On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae).</a> Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).</li><li>M&#252;ller, M., Azzi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+beef+heart+cytochrome+oxidase+subunit+III+with+eosin-5-maleimide.">Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide.</a> FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).</li><li>Shen, B. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conjugation+site+modulates+the+in+vivo+stability+and+therapeutic+activity+of+antibody-drug+conjugates.">Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates.</a> Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Purificação das matérias-primas antes de uma bioconjugação é de extrema importância. As proteínas obtidas a partir de fontes recombinantes comerciais muitas vezes contêm outros isoformas da proteína de interesse, que pode ter a química de superfície e reactividade diferente. Por exemplo, no bioconjugação descrito, o cit disponível comercialmente c contém uma mistura de ambos iso-1 e iso-2 cit c 12,14,17. Iso-2 e as formas de citocromo c 1 iso-são em grande parte hom...

Bioconjugação envolve a ligação covalente de biomoléculas com um outro ou com uma molécula sintética, tal como um corante, ou um polímero de drogas. Métodos bioconjugação proteína são agora amplamente utilizados em muitos grupos de pesquisa química, biologia e nanotecnologia, com aplicações que vão desde a rotulagem corante fluorescente 1,2, fazendo de proteínas (anticorpos) -prodrugs 3 (conjugados de medicamentos com anticorpos - ADCs) síntese de dímeros da proteína de 4,5 , por meio de híbridos de proteína-polímero de auto-montagem 6,7 utilizados em nanomedicina 8 e sistemas química 9. Especificidade da química utilizada para bioconjugação, embora nem sempre seja crítica, é de extrema importância para bioconjugados proteína mais funcionais, de modo a não interferir com o local activo da proteína alvo. A reação bioconjugação ideal precisa cumprir vários critérios, incluindo: i) segmentação locais raras ou únicas sobre a proteína de interesse,ii) ser selectivo em relação a este alvo, iii) prosseguir sob condições não desnaturantes para evitar a proteína se desdobrar e iv) ser de alto rendimento como a proteína alvo está geralmente disponível apenas em concentração sub-milimolar. A maleimida - cisteína Michael disso vem perto de cumprir todos estes critérios, e tem por essa razão muito reivindicada um estatuto especial no campo da química bioconjugado 10. Isto é porque i) muitas proteínas que contenham resíduos apenas uma cisteína na sua superfície podem ser geneticamente manipulados há, ii) ao valor de pH correcto a reacção é altamente selectiva para com a cisteína, iii) prossegue suavemente em tampões aquosos e IV) é muito rápido com a segunda constante de velocidade a fim de maleimidas a proteínas contendo cisteína relatados para exceder 5000 M-1 s-1, em alguns casos 11. Desde que a proteína de interesse pode tolerar uma quantidade pequena (≈ 5-10%) de co-solvente orgânico 12, quase todo o corante funcionalizado com maleimida, poLymer, ou outra proteína de superfície pode ser ligada a proteínas. Além disso, as maleimidas são específicas para mais cisteínas em proteínas do que iodoacetamidas, que são mais propensos a reagir com outros nucleófilos a pH elevado; e mais estável do que conjugações à base de dissulfureto, que devem ser mantidos a pH ácido para impedir a permuta de dissulfureto 13. Aqui relatamos um protocolo genérico para a conjugação de moléculas funcionalizado com maleimida para uma proteína que contém um único resíduo de cisteína utilizando a reacção entre um de Ru (II), com base na cromóforo e a proteína redox citocromo C como um exemplo. Este protocolo é igualmente aplicável para a maioria das outras proteínas contendo um resíduo de cisteína superfície acessível e o alvo funcionalizado com maleimida correspondente, seja uma outra proteína, um corante fluorescente, um cromóforo ou um polímero sintético.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium dihydrogen phosphate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71496</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium hydroxide</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">71691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">sodium chloride</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">73575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">C2436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">dithiothreitol</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">TSKgel SP-5PW</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">Tosoh SP-5PW, 07161</td>
			<td>3.3 mL strong cation exchange column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra-15&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">UFC900308</td>
			<td>3.5 kDa spin filter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slide-A-Lyzer mini dialysis units</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">66333</td>
			<td>3.5 kDa dialysis cassetes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ru(II) bisterpyridine maleimide</td>
			<td style="width:196px;">Lab made</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>see ref (14)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">acetonitrile</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">03609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">93284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">imidazole</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">nickel acetate</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">244066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">AcroSep IMAC Hypercell column</td>
			<td style="width:196px;">Pall</td>
			<td style="width:151px;">via VWR: 569-1008</td>
			<td>1 mL IMAC column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron cellulose membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Whatman</td>
			<td style="width:151px;">Z697958</td>
			<td>47 mm filter for buffers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">0.2 micron PVDF membrane filter</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;">SLGV013SL</td>
			<td>syringe filters for proteins</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">hydrochloric acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">84426</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">caffeic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">60018</td>
			<td>MALDI matrix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">trifluoroacetic acid</td>
			<td style="width:196px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">91707</td>
			<td>extremely corrosive! Use caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SimplyBlue SafeStain</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC6060</td>
			<td>Coomassie blue solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0342BOX</td>
			<td>precast protein gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">LC5925</td>
			<td>premade protein ladder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0008</td>
			<td>premade gel sample buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0004</td>
			<td>premade gel reducing agent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X)</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:151px;">NP0002</td>
			<td>premade gel running buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS</td>
			<td style="width:196px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Acta FPLC</td>
			<td style="width:196px;">GE</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Cary 50 Bio Spectrophotometer</td>
			<td style="width:196px;">Varian-Agilent</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>UV-Vis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Milli-Q ultrapure water dispenser</td>
			<td style="width:196px;">Merck-Millipore</td>
			<td style="width:151px;"></td>
			<td>ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Low volume UV-Vis Cuvette</td>
			<td style="width:196px;">Hellma</td>
			<td style="width:151px;">105-201-15-40</td>
			<td>100 microliter cuvette</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of protein bioconjugates via cysteine-maleimide chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

A sintese de bioconjugados é confirmada por três métodos principais: laser assistida por matriz de Dessorção Ionização Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS), electroforese em gel de poliacrilamida, e no ultravioleta-visível de espectroscopia (UV-VIS), como mostrado nas Figuras 2, 3 e 4. Um aumento de massa correspondente à massa da molécula pequena anexado, e a falta de uma proteína que não reagiu demonstra o êxito da ligação cov...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado.

Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

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Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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38.2K visualizações.  The University of New South Wales.  Detalhes do presente Protocolo, os passos importantes necessários para a bioconjugação de uma cisteína contendo proteína para uma maleimida, incluindo a purificação de reagentes, condições de reacção, purificação e caracterização de bioconjugados bioconjugado. 

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Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order to streamline synthesis by saving steps, time and material compared to conventional methods that require the introduction and removal of activating or directing groups. Therefore, the functionalization of C-H bonds is also attractive for green chemistry. Under oxidative conditions, two C-H bonds or one C-H and one heteroatom-H bond can be transformed to C-C and C-heteroatom bonds, respectively. Often these oxidative coupling reactions require synthetic oxidants, expensive catalysts or high temperatures. Here, we describe a two-step procedure to functionalize indole derivatives, more specifically tetrahydrocarbazoles, by C-H amination using only elemental oxygen as oxidant. The reaction uses the principle of C-H functionalization via Intermediate PeroxideS (CHIPS). In the first step, a hydroperoxide is generated oxidatively using visible light, a photosensitizer and elemental oxygen. In the second step, the N-nucleophile, an aniline, is introduced by Br&#248;nsted-acid catalyzed activation of the hydroperoxide leaving group. The products of the first and second step often precipitate and can be conveniently filtered off. The synthesis of a biologically active compound is shown.

Synthesis of Antiviral Tetrahydrocarbazole Derivatives by Photochemical and Acid-catalyzed C-H Functionalization via Intermediate Peroxides CHIPS

A two-step procedure for the synthesis of pharmaceutically active indole-derivatives by C-H functionalization with anilines is described, using photo- and Br&#248;nsted acid catalysis.

Síntese de Antiviral tetrahidrocarbazole Derivativos por fotoquímica e catalisada por ácido CH funcionalização via Peróxidos intermediários (CHIPS)

The direct functionalization of C-H bonds is an important and long standing goal in organic chemistry. Such transformations can be very powerful in order ...

Química

Synthesis and Characterization of Functionalized Metal-organic Frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and technological applications. Their signature property is their ultrahigh porosity, which however imparts a series of challenges when it comes to both constructing them and working with them. Securing desired MOF chemical and physical functionality by linker/node assembly into a highly porous framework of choice can pose difficulties, as less porous and more thermodynamically stable congeners (e.g., other crystalline polymorphs, catenated analogues) are often preferentially obtained by conventional synthesis methods. Once the desired product is obtained, its characterization often requires specialized techniques that address complications potentially arising from, for example, guest-molecule loss or preferential orientation of microcrystallites. Finally, accessing the large voids inside the MOFs for use in applications that involve gases can be problematic, as frameworks may be subject to collapse during removal of solvent molecules (remnants of solvothermal synthesis). In this paper, we describe synthesis and characterization methods routinely utilized in our lab either to solve or circumvent these issues. The methods include solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries, and materials activation (cavity evacuation) by supercritical CO2 drying. Finally, we provide a protocol for determining a suitable pressure region for applying the Brunauer-Emmett-Teller analysis to nitrogen isotherms, so as to estimate surface area of MOFs with good accuracy.

Synthesis, activation, and characterization of intentionally designed metal-organic framework materials is challenging, especially when building blocks are incompatible or unwanted polymorphs are thermodynamically favored over desired forms. We describe how applications of solvent-assisted linker exchange, powder X-ray diffraction in capillaries and activation via supercritical CO2 drying, can address some of these challenges.

Síntese e caracterização de funcionalizados metal-organic frameworks

Metal-organic frameworks have attracted extraordinary amounts of research attention, as they are attractive candidates for numerous industrial and ...

Synthesis and Reaction Chemistry of Nanosize Monosodium Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the material with Au(III) ions. The synthesis method was derived from a sol-gel process used to produce micron-sized monosodium titanate (MST), with several key modifications, including altering reagent concentrations, omitting a particle seed step, and introducing a non-ionic surfactant to facilitate control of particle formation and growth. The resultant nMST material exhibits spherical-shaped particle morphology with a monodisperse distribution of particle diameters in the range from 100 to 150&#160;nm. The nMST material was found to have a Brunauer-Emmett-Teller (BET) surface area of 285 m2g-1, which is more than an order of magnitude higher than the micron-sized MST. The isoelectric point of the nMST measured 3.34 pH units, which is a pH unit lower than that measured for the micron-size MST. The nMST material was found to serve as an effective ion exchanger under weakly acidic conditions for the preparation of an Au(III)-exchange nanotitanate. In addition, the formation of the corresponding peroxotitanate was demonstrated by reaction of the nMST with hydrogen peroxide.

The surfactant mediated sol-gel synthesis of nanosized monosodium titanate is described, along with preparation of the corresponding peroxide modified material. An ion-exchange reaction with Au(III) is also presented.

Síntese e Reacção Química de nanosize monossódico Titanate

This paper describes the synthesis and peroxide-modification of nanosize monosodium titanate (nMST), along with an ion-exchange reaction to load the ...

The Synthesis of [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- Using a Metastable Sn(I) Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a sterically demanding ligand, has increased in recent years. The metastable Sn(I) halide is synthesized at&#160;&#34;outer space conditions&#34; via the preparative co-condensation technique. Thereby, the subhalide is synthesized in an oven at high temperatures, around 1,300 &#176;C, and at reduced pressure by the reaction of elemental tin with hydrogen halide gas (e.g., HCl). The subhalide (e.g., SnCl) is trapped within a matrix of an inert solvent, like toluene at -196 &#176;C. Heating the solid matrix to -78 &#176;C gives a metastable solution of the subhalide. The metastable subhalide solution is highly reactive but can be stored at -78 &#176;C for several weeks. On heating the solution to room temperature, a disproportionation reaction occurs, leading to elemental tin and the corresponding dihalide. By applying bulky ligands like Si(SiMe3)3, the intermediate metalloid cluster compounds can be trapped before complete disproportionation to elemental tin. Hence, the reaction of a metastable Sn(I)Cl solution with Li-Si(SiMe3)3 gives [Sn10(Si(SiMe3)3)4]2- 1 as black crystals in high yield. 1 is formed via a complex reaction sequence including salt metathesis, disproportionation, and degradation of larger clusters. Further, 1 can be analyzed by various methods like NMR or single crystal X-ray structure analysis.

The Synthesis of [Sn10SiSiMe334]2- Using a Metastable SnI Halide Solution Synthesized via a Co-condensation Technique

The disproportionation reaction of a metastable Sn(I) chloride solution, obtained via the preparative co-condensation technique, is used for the synthesis of a metalloid tin cluster compound.

A síntese de [Sn<sub&gt; 10</sub&gt; (Si (SiMe<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 3</sub&gt;)<sub&gt; 4</sub&gt;]<sup&gt; 2</sup<sup&gt; -</sup&gt; Usando um Metastable Sn (I) Solução Halide Sintetizado por meio de uma técnica de co-condensação

The number of well-characterized metalloid tin clusters, synthesized by applying the disproportionation of a metastable Sn(I) halide in the presence of a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular methodology for applications in various fields and for different research purposes. The procedure described herein focuses on the synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA 5&#39;-[CUA CGG AAU CAU]-3&#39; containing zero, one, or two modifications located at the C2&#39;-O-position. The probes are based on 2-thiophenylmethyl groups, incorporated into RNA nucleotides via standard organic synthesis and introduced into the corresponding oligonucleotides via their respective phosphoramidites. This report makes use of phosphoramidite chemistry via the four canonical nucleobases (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), as well as 2-thiophenylmethyl functionalized nucleotides modified at the 2&#39;-O-position; however, the methodology is amenable for a large variety of modifications that have been developed over the years. The oligonucleotides were synthesized on a controlled-pore glass (CPG) support followed by cleavage from the resin and deprotection under standard conditions, i.e., a mixture of ammonia and methylamine (AMA) followed by hydrogen fluoride/triethylamine/N-methylpyrrolidinone. The corresponding oligonucleotides were purified via polyacrylamide electrophoresis (20% denaturing) followed by elution, desalting, and isolation via reversed-phase chromatography (Sep-pak, C18-column). Quantification and structural parameters were assessed via ultraviolet-visible (UV-vis) and circular dichroism (CD) photometric analysis, respectively. This report aims to serve as a resource and guide for beginner and expert researchers interested in embarking in this field. It is expected to serve as a work-in-progress as new technologies and methodologies are developed. The description of the methodologies and techniques within this document correspond to a DNA/RNA synthesizer (refurbished and purchased in 2013) that uses phosphoramidite chemistry.

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

This article provides a detailed procedure on the solid-phase synthesis, purification, and characterization of dodecamers of RNA modified at the C2&#39;-O-position. UV-vis and circular dichroism photometric analyses are used to quantify and characterize structural aspects, i.e., single-strands or double-strands.

Protocolo para síntese de fase sólida de oligómeros de ARN contendo um 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenilmetilo Modificação e Caracterização através do Dicroísmo Circular

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

Synthesis of Substrate-Bound Au Nanowires Via an Active Surface Growth Mechanism

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a challenge, as it requires asymmetric growth of symmetric crystals. Here, we report a distinctive synthesis of substrate-bound Au nanowires. This template-free synthesis employs thiolated ligands and substrate adsorption to achieve the continuous asymmetric deposition of Au in solution at ambient conditions. The thiolated ligand prevented the Au deposition on the exposed surface of the seeds, so the Au deposition only occurs at the interface between the Au seeds and the substrate. The side of the newly deposited Au nanowires is immediately covered with the thiolated ligand, while the bottom facing the substrate remains ligand-free and active for the next round of Au deposition. We further demonstrate that this Au nanowire growth can be induced on various substrates, and different thiolated ligands can be used to regulate the surface chemistry of the nanowires. The diameter of the nanowires can also be controlled with mixed ligands, in which another &#34;bad&#34; ligand could turn on the lateral growth. With the understanding of the mechanism, Au nanowire-based nanostructures can be designed and synthesized.

We report a solution-based method to synthesize substrate-bound Au nanowires. By tuning the molecular ligands used during the synthesis, the Au nanowires can be grown from various substrates with different surface properties. Au nanowire-based nanostructures can also be synthesized by adjusting the reaction parameters.

Síntese de nanofios de Au substrato ligados através de um mecanismo de crescimento ativo de superfície

Advancing synthetic capabilities is important for the development of nanoscience and nanotechnology. The synthesis of nanowires has always been a ...

A Rapid Synthesis Method for Au, Pd, and Pt Aerogels Via Direct Solution-Based Reduction

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various precursor noble metal ions with reducing agents in a 1:1 (v/v) ratio results in the formation of metal gels within seconds to minutes compared to much longer synthesis times for other techniques such as sol-gel. Conducting the reduction step in a microcentrifuge tube or small volume conical tube facilitates a proposed nucleation, growth, densification, fusion, equilibration model for gel formation, with final gel geometry smaller than the initial reaction volume. This method takes advantage of the vigorous hydrogen gas evolution as a by-product of the reduction step, and as a consequence of reagent concentrations. The solvent accessible specific surface area is determined with both electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry. After rinsing and freeze drying, the resulting aerogel structure is examined with scanning electron microscopy, X-ray diffractometry, and nitrogen gas adsorption. The synthesis method and characterization techniques result in a close correspondence of aerogel ligament sizes. This synthesis method for noble metal aerogels demonstrates that high specific surface area monoliths may be achieved with a rapid and direct reduction approach.

A rapid, direct solution-based reduction synthesis method to obtain Au, Pd, and Pt aerogels is presented.

Um método de síntese rápida para Au, Pd e Pt Aerogels através de redução direta baseada em solução

Here, a method to synthesize gold, palladium, and platinum aerogels via a rapid, direct solution-based reduction is presented. The combination of various ...

Synthesis of Esters Via a Greener Steglich Esterification in Acetonitrile

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the reaction is commonly performed using chlorinated or amide solvent systems, which are hazardous to human health and the environment. Our methodology utilizes acetonitrile as a greener and less hazardous solvent system. This protocol exhibits rates and yields that are comparable to traditional solvent systems and employs an extraction and wash sequence that eliminates the need for the purification of the ester product via column chromatography. This general method can be used to couple a variety of carboxylic acids with 1&#176; and 2&#176; aliphatic alcohols, benzylic and allylic alcohols, and phenols to obtain pure esters in high yields. The goal of the protocol detailed here is to provide a greener alternative to a common esterification reaction, which could serve useful for ester synthesis in both academic and industrial applications.

A modified Steglich esterification reaction was used to synthesize a small library of ester derivatives with primary and secondary alcohols. The methodology uses a non-halogenated and greener solvent, acetonitrile, and enables product isolation in high yields without the need for chromatographic purification.

Síntese de ésteres através de uma esterificação Steglich mais verde em acetonitrila

The Steglich esterification is a widely-used reaction for the synthesis of esters from carboxylic acids and alcohols. While efficient and mild, the ...

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity of cells within a test tube. By obviating the need to maintain the viability of the cell, and by eliminating the cellular barrier, CFPS has been foundational to emerging applications in biomanufacturing of traditionally challenging proteins, as well as applications in rapid prototyping for metabolic engineering, and functional genomics. Our methods for implementing an E. coli-based CFPS platform allow new users to access many of these applications. Here, we describe methods to prepare extract through the use of enriched media, baffled flasks, and a reproducible method of tunable sonication-based cell lysis. This extract can then be used for protein expression capable of producing 900 &#181;g/mL or more of super folder green fluorescent protein (sfGFP) in just 5 h from experimental setup to data analysis, given that appropriate reagent stocks have been prepared beforehand. The estimated startup cost of obtaining reagents is $4,500 which will sustain thousands of reactions at an estimated cost of $0.021 per &#181;g of protein produced or $0.019 per &#181;L of reaction. Additionally, the protein expression methods mirror the ease of the reaction setup seen in commercially available systems due to optimization of reagent pre-mixes, at a fraction of the cost. In order to enable the user to leverage the flexible nature of the CFPS platform for broad applications, we have identified a variety of aspects of the platform that can be tuned and optimized depending on the resources available and the protein expression outcomes desired.

Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology

This protocol details the steps, costs, and equipment necessary to generate E. coli-based cell extracts and implement in vitro protein synthesis reactions within 4 days or less. To leverage the flexible nature of this platform for broad applications, we discuss reaction conditions that can be adapted and optimized.

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Over the last 50 years, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) has emerged as a powerful technology to harness the transcriptional and translational capacity ...

Synthesis of Monodisperse Cylindrical Nanoparticles via Crystallization-driven Self-assembly of Biodegradable Block Copolymers

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock copolymers are produced by one of three techniques: thin film rehydration, solvent switching or polymerization-induced self-assembly, and produce only flexible, polydisperse cylinders. Crystallization-driven self-assembly (CDSA) is a method which can produce cylinders with these properties, by stabilizing structures of a lower curvature due to the formation of a crystalline core. However, the living polymerization techniques by which most core-forming blocks are formed are not trivial processes and the CDSA process may yield unsatisfactory results if carried out incorrectly. Here, the synthesis of cylindrical nanoparticles from simple reagents is shown. The drying and purification of reagents prior to a ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone catalyzed by diphenyl phosphate is described. This polymer is then chain extended by methyl methacrylate (MMA) followed by N,N-dimethyl acrylamide (DMA) using reversible addition&#8722;fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization, affording a triblock copolymer that can undergo CDSA in ethanol. The living CDSA process is outlined, the results of which yield cylindrical nanoparticles up to 500 nm in length and a length dispersity as low as 1.05. It is anticipated that these protocols will allow others to produce cylindrical nanostructures and elevate the field of CDSA in the future.

Crystallization-driven self-assembly (CDSA) displays the unique ability to fabricate cylindrical nanostructures of narrow length distributions. The organocatalyzed ring-opening polymerization of &#949;-caprolactone and subsequent chain extensions of methyl methacrylate and N,N-dimethyl acrylamide are demonstrated. A living CDSA protocol that produces monodisperse cylinders up to 500 nm in length is outlined.

Síntese de nanopartículas cilíndricas Monodispersa via auto-montagem orientada por cristalização de copolímeros de blocos biodegradáveis

The production of monodisperse cylindrical micelles is a significant challenge in polymer chemistry. Most cylindrical constructs formed from diblock ...