Este protocolo nos permite cultivar microglia en condiciones que imitan de cerca las características in vivo. Utilizando la tecnología de clasificación celular magnética, nuestro protocolo nos permite estimular la microglía solo dos días in vitro, sin usar ningún suero en el medio de cultivo. Para empezar, utiliza tijeras pequeñas para cortar la piel desde el cuello hasta la nariz, siguiendo la sutura sagital de 15 a 20 milímetros.
Inserte las puntas con el foramen magnum paralelo al cráneo. Corte desde cada lado hasta los ojos. Corte entre los ojos con tijeras pequeñas para separar el cráneo y el cerebro de la cabeza.
Con dos fórceps, agarre el cráneo cerca de los bulbos olfatorios y rasgue cuidadosamente el cráneo. Con una cuchilla de afeitar, retire el cerebelo y el bulbo olfativo, y corte el cerebro en dos pedazos. Coloque las piezas cerebrales en una placa de Petri que contenga 40 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio.
Prepare la mezcla de disociación de acuerdo con esta tabla. Transfiera 12 piezas cerebrales a un tubo C para un peso total de 1,2 gramos por tubo de disociación. Luego coloque tubos C en el disociador con calefacción.
Inicie el programa NTDK optimizado en el disociador. Centrifugar durante 20 segundos. Completa la disociación mecánica pipeteando tres veces.
Transfiera las células a cuatro tubos de 15 mililitros con filtros conectados. Enjuague los coladores con 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio. Centrifugar durante 10 minutos y retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mililitros.
Agregue cuidadosamente 10 mililitros de HBSS con calcio y magnesio, y vuelva a suspender el pellet. Nuevamente, centrifugar y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.
Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante. Luego agregue 200 microlitros de solución de microperlas CD11b e incube los tubos durante 15 a 20 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, vuelva a suspender el pellet con seis mililitros de tampón de clasificación.
Repita la centrifugación y vuelva a suspender el pellet con ocho mililitros de tampón de clasificación. A continuación, siga el programa Possel en el separador para preparar ocho columnas. Pase las células a través de la columna agregando un mililitro de suspensión celular a la vez.
Con un mililitro de tampón de clasificación, eluya las células CD11b positivas en una placa de elución estéril. Agrupe las células en un tubo de 50 mililitros. Centrifugar y volver a suspender el pellet con 10 mililitros de medio microglia frío.
Contar las células CD11b positivas. Vuelva a suspender las células en medio microglial frío para obtener una concentración final de 650, 000 a 700, 000 células por mililitro. Dispensar la suspensión en placas de cultivo celular.
Incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, reemplace el medio con un medio microglial precalentado y repita la incubación durante la noche. Estimular las células antes de este paso, y realizar un ensayo fagocítico durante las últimas tres horas de la estimulación.
Calcule el número de cuentas de acuerdo con esta tabla en una proporción de 50 cuentas por celda. Preparar la mezcla de cuentas. Incubar el tubo durante una hora en un baño de agua a 37 grados centígrados.
Vórtice cada 10 minutos. A cada pozo, agregue el volumen calculado de la solución de perlas e incube durante tres horas. Usando este enfoque, la actividad fagocítica de la microglía se evaluó después de la estimulación por factores proinflamatorios, como la interleucina-1 beta, más interferón gamma o lipopolisacáridos.
Después de la estimulación durante seis a 24 horas, las perlas fluorescentes de microglía Cy3 se analizaron con microscopio confocal. Después de seis horas, la microglía comienza a las perlas de fagocitos Cy3 solo bajo la condición de interleucina-1 beta más interferón gamma. Después de 24 horas, hubo un aumento de la fluorescencia Cy3 para ambos tipos de estimulación, destacando el aumento de la actividad fagocítica.
La pureza del cultivo microglial se elevó mediante citometría de flujo, que mostró un aumento en la viabilidad celular después de la clasificación. Utilizando citometría de flujo y marcadores de población de células RT-qPCR se analizaron antes y después de clasificar las células CD11b positivas de cerebros de ratones en el día ocho postnatal. Estos análisis distinguieron varias poblaciones de células cerebrales, como CX3CR135 para microglia, O4 u OLIG2 para oligodendrocitos, NeuN o sinaptofisina, para neuronas, y ACSA-2, o GFAP para astrocitos.
Después de la clasificación celular utilizando el anticuerpo CD11b, solo se obtuvieron microglías. Es importante pipetear muy suavemente mientras se agrega la suspensión a la columna para evitar obstrucciones y evitar la muerte celular mecánica. Después de este método, se puede realizar proteómica transcriptómica, como la sangre occidental o Luminex, e incluso inmunoquímica para ver el efecto de la estimulación microglial.
