TGK reconoce la Escuela Internacional de Posgrado de Ciencia e Ingeniería (IGGSE) de la Universidad Técnica de Múnich por su apoyo financiero. HK reconoce el Centro de Ciencias de la proteína integrada Múnich (CIPSM) por su apoyo.

Nota: Todos los reactivos y disolventes se obtuvieron de proveedores comerciales y se usaron sin purificación adicional. Precaución: Por favor, consultar a todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Utilice todo el equipo de seguridad adecuado al realizar la síntesis química (por ejemplo, campana extractora de humos, gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones de longitud completa, y zapatos cerrados). 1. Síntesis de los precursores Guanidinylation <ol><li> especies alquiladas <ol><li> especies metilados <ol><li> Disolver 1,0 g de N, N &#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1 eq.) Y 1,0 g de trifenilfosfina (PPh3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) En 10 ml de seco tetrahidrofurano (THF) en un matraz de fondo redondo de 50 ml en una atmósfera inerte utilizando un septo de goma a temperatura ambiente (RT). Añadir 194! ​​L de metanol seco mediante una jeringa (4,8 mmol, 1,5 eq.) Y let se agita a RT. </li><li> Por separado, preparar una solución con 747! L de azodicarboxilato de diisopropilo (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) En 2 ml de THF seco en un vial de vidrio pequeño. Mientras se agita, añadir la solución de DIAD en THF gota a gota a la solución de N, N &#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina, PPh3, y metanol usando una jeringa (más de 15 min). Deje que la agitación solución durante 2 h a TA. </li><li> Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio y se disuelve el producto bruto en 1 ml de diclorometano (DCM). Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en acetato de etilo 10% (EtOAc) en una solución de pentano. Cargar el producto bruto disuelto en la columna y añadir el disolvente a presión (1,5 bar). </li><li> Reunir las fracciones (sistema disolvente: isocrático 10% de EtOAc en pentano), identificar el punto de compuesto deseado por cromatografía en capa fina (TLC), y recogerlo (Rf = 0,4, EtOAc / pentano 1: 9, UV). Combinar el deseadofracciones y evaporar el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 0,85 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (2,6 mmol, 81% de rendimiento). Almacenar el compuesto producido a temperatura ambiente para su uso posterior. </li></ol></li><li> Hexilamina especies modificadas <ol><li> Disolver 1,0 g de N, N &#39;-Di-BOC-1 H-pirazol-1-carboxamidina (3,2 mmol, 1,0 eq.), 0,9 g de Dde-6-aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.), Y 1,0 g de PPh3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) en 10 ml de THF seco en un matraz de fondo redondo de 50 ml en atmósfera inerte utilizando un septo de goma a temperatura ambiente. </li><li> Por separado, preparar una solución con 747 l de DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) En 2 ml de THF seco en un vial de vidrio pequeño. Mientras se agita, añadir la solución de DIAD en THF gota a gota a la solución de N, N &#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina, PPh3, y Dde-6-aminohexanol usando una jeringa (más de 15 min) . Deje que la agitación solución durante 2 h a TA. </li><li>Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio y tomar el producto bruto en 1 ml de DCM. Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en una solución de pentano / EtOAc (2: 1). Aplicar el producto bruto disuelto en la columna y añadir disolvente a presión (1,5 bar). </li><li> Reunir las fracciones (sistema disolvente: isocrático 2: 1 de pentano / EtOAc), identificar las fracciones deseadas con TLC, y recogerlos (R f = 0,66, 2: 1 de pentano / EtOAc, UV). Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 1,6 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (2,8 mmol, 88% de rendimiento). Almacenar el compuesto producido a temperatura ambiente para su uso posterior. </li></ol></li></ol></li><li> Especies aciladas (2 etapas de reacción) <ol><li> Disolver 1,4 g de S hemisulfato -methylisothiuronium (10 mmol, 1,0 eq.) Y 2,2 g de di (terc-butil) dicarbonato (10 mmol, 1,0 eq.) En un agitar vigorosamentesonar solución bifásica de DCM / sat. ac. De NaHCO3 y se deja agitar durante 24 h a TA. </li><li> Separar las capas en un embudo de decantación y se extrae la fase acuosa tres veces con DCM. Se combinan las fases orgánicas, se secan con Na 2 SO 4, y eliminar el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio. Tome el producto bruto en 1 ml de hexano. </li><li> Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 100 g de sílice en una solución de 4: 1 hexano / EtOAc. Cargar el producto bruto disuelto en la columna. Añadir disolvente bajo presión. Identificar las fracciones deseadas con TLC (sistema disolvente: 4: 1 hexano isocrático / EtOAc (detección UV: 254 nm), y recogerlos (R f = 0,30). </li><li> Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 1,1 g del compuesto del título como un aceite viscoso de color amarillo (5,8 mmol, 58% de rendimiento). Almacenar el reactivo, N - (terc -butoxicarbonil) - S -methylisothiourea, a TA durante su uso posterior. </li><li> Disolver 250 mg de N - (terc -butoxicarbonil) - S -methylisothiourea (1,3 mmol, 1,0 eq.) En 10 ml de N, N -dimetilformamida seca (DMF) en un matraz de fondo redondo de 50 ml en una atmósfera inerte a RT. Añadir 440! L de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) (2,6 mmol, 2 eq.) Utilizando una jeringa. Mientras se agita, añadir 245 l de Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 eq.) Gota a gota usando una jeringa y se deja agitar durante 1 h a TA. </li><li> Añadir un exceso de metanol (2 ml) a la mezcla usando una jeringa y se deja agitar durante 15 min a TA. Eliminar el disolvente bajo presión reducida usando un evaporador rotatorio. Tome el producto bruto en 1 ml de DCM. </li><li> Cargar una columna ultrarrápida (2,5 cm x 20 cm) con 60 g de sílice en una solución de 3: 1 de hexano / EtOAc 3: 1. Aplicar el producto bruto se disolvió a la columna. Añadir disolvente (3: 1 hexano / EtOAc) y la presión (1,5 bar). Identificar las fracciones deseadas con TLC (3: 1 de hexano / EtOAc, UV: 220 nm), y colLect ellos (Rf = 0,62). </li><li> Combinar las fracciones deseadas y se evapora el disolvente a presión reducida usando un evaporador rotatorio para obtener 210 mg del compuesto del título como un sólido blanco (0,9 mmol, 70% de rendimiento). Almacenar el compuesto a temperatura ambiente para su uso posterior. </li></ol></li></ol> 2. Síntesis de péptido cíclico Precursores <ol><li> Cargando y taponado de resina TCP <ol><li> Añadir 1,00 g de resina de 2-chlortriyl cloruro de (CTC) (0,9 mmol / g) y 320 mg de Fmoc-Gly-OH (1,2 eq.) En una jeringa de plástico de 20 ml con una frita. Preparar una solución de 313 l de DIPEA (2 eq.) En 5 ml de DCM seco y añadirlo a la jeringa. Deje que se gire durante 1 h a RT utilizando una unidad giratoria. </li><li> Mientras tanto, preparar una solución de 2 ml de 5: 1 de metanol / DIPEA (v / v; solución tapado). Añadir la solución de nivelación a la jeringa y se deja girar durante otros 15 minutos. Se lava la resina con DCM (5x) y DMF (3x). </li></ol></li><li> On-resina Fmoc desprotección<ol><li> Tratar el unido a la resina Fmoc-Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x). </li></ol></li><li> On-resina acoplamiento de Fmoc-Orn (Dde) -OH <ol><li> Añadir 934 mg de-l-Orn Fmoc -OH (Dde) (2 eq.), 684 mg de 1- [bis (dimetilamino) metileno] -1H-1,2,3-triazolo [4,5-b] piridinio hexafluorofosfato de 3-óxido (HATU) (2 eq.), y 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 eq.) a un vial de vidrio pequeño y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA. </li><li> Añadir esta solución a la Gly desprotegió Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h. Lavar la resina con DMF (3x). </li></ol></li><li> On-resina Fmoc desprotección <ol><li> Tratar el unido a la resina Fmoc-Orn (Dde) Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x). </li></ol></li><li> Acoplamiento sobre resina de Fmoc-Val-OH <ol><li> Añadir 610 mg de Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA. </li><li> Añadir esta solución a la Fmoc-desprotegió, se lava, y Orn unido a la resina (Dde) Gly y se deja girar durante 1 h. </li></ol></li><li> On-resina Fmoc desprotección <ol><li> Tratar el unido a la resina Fmoc-Val-Orn (Dde) Gly con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x). </li></ol></li><li> On-resina N- metilación <ol><li> Se lava la resina con DCM (3x). Disolver 887 mg de 2-nitrobencenosulfonilo (O NBS-Cl, 4 eq.) En DCM y añadir 1,2 ml de 2,4,6-colidina (10 eq.). </li><li> Añadir la solución del péptido unido a la resina y se deja incubar durante 20 min a TA. </li><li> Se lava la resina con CH 2 Cl 2 (3x) y con THF (5x). Preparar una solución con 1,18 g de PPh 3 (5 eq.) Y 365 l de metanol en THF. Añadir esta solución a lajeringuilla. </li><li> Preparar una solución con 883 l de DIAD en 2 ml de THF y añadirlo a la jeringa. Deje que se incuba durante 15 min. Se lava la resina con THF (5x) y con DMF (5x). </li></ol></li><li> o desprotección ns <ol><li> Preparar una solución con 570 l de mercaptoetanol (10,0 eq.) Y 672 l de diazabicycloundecen (DBU) en 2 ml de DMF. Añadir esta solución a la jeringa y se deja incubar durante 5 minutos. </li><li> Repetir la etapa de desprotección y después se lava la resina con DMF (5x). </li></ol></li><li> Acoplamiento On-resina de Fmoc- D-Phe-OH <ol><li> Añadir 697 mg de Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF . Añadir 814! L de DIPEA. </li><li> Añadir esta solución al péptido desprotegido Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h. </li></ol></li><li> On-resina Fmoc desprotección <ol><li> El tratamiento de la resina-bound péptido con 20% de piperidina en DMF durante 10 min y luego durante 5 min. Lavar la resina con DMF (3x). </li></ol></li><li> Acoplamiento sobre resina de Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH <ol><li> Añadir 741 mg de Fmoc Asp (Ot Bu) -OH (2 eq.), 684 mg de HATU (2 eq.), Y 245 mg de HOAt (2 eq.) A un pequeño vial de vidrio y se disuelven en 5 ml de DMF. Añadir 814! L de DIPEA. </li><li> Añadir esta solución al péptido desprotegido Fmoc-, se lavó, y unido a la resina y se deja girar durante 1 h. </li></ol></li><li> La escisión del péptido lineal de la resina <ol><li> Se lava la resina con DCM (3x) y, posteriormente, preparar 10 ml de una solución de hexafluoroisopropanol (HFIP) en DCM (1: 4; v / v). </li><li> Añadir la solución a la resina y se deja girar durante 15 min. Recoger la solución en un matraz de fondo redondo. Repita la escisión y evaporar el disolvente usando un evaporador rotatorio. </li></ol></li><li> La ciclación del péptido lineal <ol><li> dissolve 384 mg de NaHCO3 (5,0 eq.) y 582 l de difenilfosforil azida (DPPA) (3,0 eq.) en 50 ml de DMF y añadirlo al producto bruto. Deje que se agita durante una noche o hasta que no se observa ningún péptido lineal con ESI-MS (10 h) 17. </li><li> Bajo presión reducida, reducir el disolvente a un pequeño volumen usando un evaporador rotatorio. Preparar una solución acuosa saturada de NaCl (salmuera). Utilizando una pipeta Pasteur, añadir gota a gota el péptido ciclado a 40 ml de solución acuosa saturada de NaCl en un tubo de centrífuga. </li><li> Centrifugar la suspensión (5.000 xg, 5 min) y se lava el precipitado con agua de grado HPLC (2x). Liofilizar el producto. </li></ol></li></ol> 3. Guanidinylation y desprotección en la Solución <ol><li> Guanidinylation con los precursores hechos a la medida <ol><li> Disolver una pequeña cantidad (por ejemplo, 25 mg) del péptido cíclico ortogonalmente desprotegido en un pequeño volumen de DMF (por ejemplo, 2 mL). Añadir 2 eq. del precursor guanidinylation y 2 eq. de DIPEA a la solución y se deja agitar durante 2 h a TA. </li><li> Monitorear el progreso de la reacción con HPLC-MS. Después de que la reacción es completa, retire la re-disolver el péptido cíclico disolvente, guanidinylated en acetonitrilo, y llevar a cabo la purificación por HPLC semipreparativa 16. </li></ol></li><li> La eliminación de grupos de cadena lateral lábil protector de ácido <ol><li> Preparar 2 ml de una solución que contiene ácido trifluoroacético (TFA), agua, y triisopropilsilano (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Añadir esta solución al producto purificado en un pequeño vial de vidrio y se deja agitar a TA durante al menos 1 h. Observe la desprotección completa con ESI-MS 17. </li><li> Se evapora el disolvente bajo presión reducida a un pequeño volumen. Preparar éter enfriado con hielo y añadir 10 ml en un tubo de centrífuga de 50 mL. Precipitar el péptido desprotegido en éter enfriado con hielo utilizando una pipeta Pasteur añadiéndolagota a gota. Centrifugar la suspensión (5.000 xg, 5 min) para obtener un pellet. </li><li> Lavar el precipitado con éter enfriado con hielo y centrifugar ella (5000 xg, 5 min, 2x). Se disuelve el producto en 2 ml de agua de calidad de HPLC y se purifica con HPLC semipreparativa 16. </li></ol></li></ol> 4. Datos analíticos y parámetros para la purificación <ol><li> Analytical HPLC-ESI-MS <ol><li> Realizar analítico HPLC-ESI-MS con un espectrómetro de masas LCQ usando una columna C18 (tamaño de 12 nm de poro, tamaño de partícula 3-m, 125 mm x 2,1 mm) o una columna C8 (tamaño de poro de 20 nm, partículas 5-m tamaño, 250 mm x 2,1 mm), con H 2 O (0,1% v v / ácido fórmico) / acetonitrilo (0,1% v v / ácido fórmico) como eluyentes. </li></ol></li><li> HPLC semi-preparativa <ol><li> Realizar HPLC semi-preparativa usando un instrumento de HPLC preparativa con un ODS-A de columna (20 x 250 mm, 5 micras), una velocidad de flujo de 8 ml / min, y los gradientes linealesde H 2 O (0,1% v / v de TFA) y acetonitrilo (0,1% v / v de TFA). </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

El precursor para guanidinylation es un derivado de péptido cíclico ortogonalmente desprotegido, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), que se sintetiza por un protocolo Fmoc estándar de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Ornitina se utilizó como el derivado protegido ortogonalmente, (Fmoc-Orn (Dde) -OH), que puede desprotegerse con hidrazina en DMF después de la ciclación del andamio péptido. El precursor del péptido se purifica mediante la precipitación del compuesto y por la l...

Entre los grupos farmacofóricos más abundantes en ligandos naturales es el grupo de guanidina, que está implicado en interacciones múltiples 1, 2. Por ejemplo, sirve como un potencial de cuatro veces donante de hidrógeno en las interacciones de enlaces de hidrógeno y está implicado en interacciones electrostáticas, tales como puentes de sal o interacciones de cationes π. En la química medicinal, este grupo se encuentra a menudo en las drogas y fármacos candidatos 4, aunque muy a menudo como miméticos de guanidina 5, 6. La razón para el desarrollo de miméticos de guanidina es la eliminación del grupo guanidina ubicuo, cargado positivamente, así como el ajuste de la lipofilicidad del ligando. En ligandos peptídicos, el único aminoácido que contiene un grupo de guanidina es arginina, que por lo tanto se encuentra a menudo en la región bioactiva de ligandos peptídicos. Una muy prejemplo ominent para una familia ligando que contiene arginina-es la subfamilia de las integrinas RGD-unión. En general, las integrinas son una clase de receptores de adhesión celular, que tienen más de funciones importantes en todos los organismos superiores. Algunas de estas funciones implican la adhesión celular, la migración y la supervivencia celular. Por lo tanto, ellos también están involucrados en indicaciones patológicas, como el cáncer y fibrosis. Las integrinas son proteínas heterodiméricas de transmembrana que consisten en un α- y una β-subunidad que forman 24 subtipos de integrina actualmente conocidos; 8 de ellos reconocen la secuencia de tripéptido Arg-Gly-Asp (RGD =) en sus ligandos 7. La región de unión se encuentra en la interfaz entre estos dos subtipos en la parte extracelular, el llamado grupo de cabeza integrina 8. RGD es reconocido por dos interacciones comunes: la región del sitio de adhesión a metal-ion-dependiente (MIDAS), que se encuentra en la subunidad beta y que se une el ácido carboxílico en los ligandos (cha secundariosen de Asp); y el grupo guanidina en los ligandos, que se encuentra en la subunidad alfa. La mayoría de los subtipos de integrina son promiscuos y comparten al menos una parte de su matriz extracelular naturales (ECM) ligandos 9. Por lo tanto, para el desarrollo de ligandos de integrinas artificiales, el principal objetivo es, además de una alta afinidad de unión, la selectividad del subtipo. Recientemente, hemos sido capaces de dar a conocer un elemento clave para la generación de ligandos selectivos de subtipo: el grupo guanidina. A través de modificaciones distintas, ligandos biselective para el αv- y α5 que contienen subtipos de integrina se pueden convertir en compuestos selectivos por modificaciones sencillas en el grupo guanidina, que puede discriminar la diferente α-subunidades 10. En el bolsillo de alpha v, el grupo guanidina interactúa lado-a través de un puente de sal bidentado con Asp218 11, 12. Esta interacción cuna también observarse en α5β1 (aquí, con Asp227 en α5), pero, además, se observa un extremo en la interacción del grupo de guanidina con un residuo de Gln (Gln221) hay 13. Por lo tanto, hemos modificado el grupo guanidina de dos maneras opuestas: en un caso, mediante el bloqueo del lado de la interacción con la metilación de la δ N del grupo de guanidina, y en el otro caso, con la metilación de la ω guanidina N, bloqueo de la interacción de fin en. Sorprendentemente, esta pequeña modificación dio lugar a un cambio completo selectividad en los ligandos. Además de la alquilación, se introdujo un nuevo método de funcionalización en esta publicación. El método de funcionalización clásica para este tipo de ligando pentapeptidic es a través de la conjugación de la cadena lateral de un aminoácido no implicada en la unión (por ejemplo, K en c (RGDfK)) 14, 15. Aquí,se muestra que la funcionalización es también posible mediante la modificación de la guanidina - que es crucial para la unión - con un acilo o enlazador alquilado. La carga positiva que es esencial para la unión se retiene, y los modelos sugieren que los puntos de cadena larga fuera del bolsillo de unión, proporcionando así una posibilidad ideal para la fijación de otros enlazadores y equipos de etiquetado (por ejemplo, un marcador fluorescente o un quelante para molecular de formación de imágenes). En este trabajo, nos concentramos en las etapas preparativas para la modificación del grupo guanidina en ligandos que contienen arginina. Esto implica la síntesis de las especies -methylated N ω, así como guanidinas con unidades enlazadoras más largos. Las diferentes modificaciones comprenden grupos acilo y alquilo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">N,N&#8242;-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">434167&#160;ALDRICH</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triphenylphosphine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T84409&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran, &#62;99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diisopropyl azodicarboxylate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>225541&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethan, for synthesis, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica gel for flash chromtaography</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60738&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Pentane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Hexane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminohexanol, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A56353&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Methylisothiourea hemisulfate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M84445 ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Di-tert-butyl dicarbonate, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>205249&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamid, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamin, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydrid, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chlortrityl resin</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Gly-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidin, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>104094&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Orn(Dde)-OH</td>
			<td>Iris-Biotech</td>
			<td>FAA1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HATU, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HOAt, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Val-OH</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N11507&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,4,6-Collidine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27690&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mercaptoethanol, 99%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diazabicycloundecen, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>139009&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-D-Phe-OH, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>47378&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexafluoroisopropanol</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC03056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diphenylphosphoryl azide, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>178756&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TFA, 99.9%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilan, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>233781&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN44</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification and functionalization of the guanidine group by tailor-made precursors

El grupo guanidina es uno de los grupos farmacofóricos más importantes en la química medicinal. El único aminoácido que lleva un grupo de guanidina es arginina. En este artículo, se proporciona un método fácil para la modificación del grupo guanidina en ligandos peptídicos, con un ejemplo de ligandos de integrina de unión a RGD. Se ha demostrado recientemente que la modificación distinta del grupo guanidina en estos ligandos permite la modulación selectiva del subtipo (por ejemplo, entre los subtipos alpha v y α5). Por otra parte, una estrategia anteriormente desconocida para la funcionalización a través del grupo guanidina se demostró, y el enfoque sintético se revisa en este documento. Las modificaciones descritas aquí implican terminal (N ω) grupos guanidina alquiladas y acetilados. Para la síntesis, las moléculas precursoras hechos a la medida son sintetizados, que se somete luego a una reacción con una amina ortogonalmente desprotege para transferir el pregrupo guanidina -Modificado. Para la síntesis de guanidinas alquiladas, precursores basan en N, N &#39;-Di-Boc-1 H-pirazol-1-carboxamidina se utilizan para sintetizar compuestos acilados, el precursor de elección es un derivado correspondientemente acilado de N -Boc- S - metilisotiourea, que puede ser obtenido en las reacciones de uno y de dos pasos.

El precursor del péptido cíclico fue sintetizado como un péptido lineal, ciclizado, y ortogonalmente desprotege-Dde. Después de la precipitación, la pureza del compuesto se analizó con HPLC-MS (Figura 1). Para supervisar el progreso de la reacción, se realizó un análisis HPLC después del tiempo de reacción de 2 h (Figura 2). Para los residuos más grandes en el grupo de guanidina, e...

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Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Se presenta un protocolo para la síntesis de guanidinas modificados con alquilo basados ​​en el uso de los precursores correspondientes.

Modificación y funcionalización del grupo guanidina por Precursores adaptado

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

modification-functionalization-guanidine-group-tailor-made

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K vistas.  Technische Universität München.  Se presenta un protocolo para la síntesis de guanidinas modificados con alquilo basados ​​en el uso de los precursores correspondientes. 

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termoestabilización, Expresión, purificación y cristalización del transportador de serotonina humano enlazado a<em&gt; S</em&gt; citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Investigación

Bioquímica

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 detección de fosforilación por la actividad de LRRK2 mediante SDS-PAGE con una etiqueta de enlace de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

Caracterización de las glicoproteínas con el doblez de la inmunoglobulina por cristalografía de rayos x y técnicas biofísicas

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitocondrias y endoplasmática retícula imagen por microscopía electrónica de luz y volumen correlativa

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

Obtención de datos de transcriptoma de alta calidad de Cereal Seeds mediante un método modificado para la generación de perfiles de expresión génica

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

Análisis de los datos de la SEC-SAXS a través de la desconvolución y dispersión de EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

Eliminación Y Reemplazo De Ligandos Endógenos De Proteínas Ligadas A Lípidos Y Alérgenos

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...