TGK erkennt die International Graduate School for Science and Engineering (IGGSE) der Technischen Universität München für ihre finanzielle Unterstützung. HK erkennt das Center for Integrated Protein Science Munich (CIPSM) für ihre Unterstützung.

Hinweis: Alle Reagenzien und Lösungsmittel wurden von kommerziellen Lieferanten erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet. Achtung: Bitte lesen Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Bitte verwenden Sie geeignete Schutzausrüstungen , wenn chemische Synthesen durchführen (zB Dunstabzugshaube, Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen und geschlossene Schuhe). 1. Synthese des Precursors Guanidinylierung <ol><li> alkylierte Spezies <ol><li> methylierten Spezies <ol><li> Man löst 1,0 g N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1 eq.) Und 1,0 g Triphenylphosphin (PPh 3, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 10 ml trockenen Tetrahydrofuran (THF) in einer 50-ml-Rundkolben in einer inerten Atmosphäre ein Gummiseptum bei Raumtemperatur (RT) gemessen. Hinzufügen 194 &amp; mgr; l trockenem Methanol unter Verwendung einer Spritze (4,8 mmol, 1,5 eq.) Und Let es bei RT rühren. </li><li> Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 &amp; mgr; l von Diisopropylazodicarboxylat (DIAD, 3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wurde die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Methanol , um eine Spritze (über 15 min) verwendet. Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT. </li><li> Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer entfernt und das Rohprodukt in 1 ml Dichlormethan (DCM) aufzulösen. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Silica in 10% Ethylacetat (EtOAc) in einer Pentanlösung. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Sie das Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar). </li><li> Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratisch 10% EtOAc in Pentan), um die gewünschte Verbindung identifizieren Fleck durch Dünnschichtchromatographie (TLC), und es sammeln (R f = 0,4, EtOAc / Pentan 1: 9, UV). Kombinieren, um das gewünschteFraktionen und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck verdampft am Rotationsverdampfer 0,85 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,6 mmol, 81% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li><li> Hexylamin modifizierte Spezies <ol><li> Man löst 1,0 g N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin (3,2 mmol, 1,0 Äq.), 0,9 g von Dde-6-Aminohexanol (3,8 mmol, 1,2 eq.) Und 1,0 g von PPh 3 (3,8 mmol, 1,2 eq.) in 10 ml trockenen THF in einer 50-ml - Rundkolben in Inertatmosphäre ein Gummiseptum bei RT verwendet wird . </li><li> Getrennt davon wurde eine Lösung mit 747 &amp; mgr; l von DIAD (3,8 mmol, 1,2 eq.) In 2 ml trockenem THF in einem kleinen Glasfläschchen vorzubereiten. Unter Rühren wird die Lösung von DIAD in THF tropfenweise zu der Lösung von N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin, PPh 3 und Dde-6-Aminohexanol einer Spritze (über 15 min) unter Verwendung von . Lassen Sie die Lösung unter Rühren für 2 h bei RT. </li><li>Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer und nehmen die nach oben Rohprodukt in 1 ml DCM. Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von Pentan / EtOAc (2: 1). Übernehmen des gelösten Rohproduktes an der Säule und fügen Lösungsmittel unter Druck (1,5 bar). </li><li> Sammeln der Fraktionen (Lösungsmittelsystem: isokratische 2: 1 Pentan / EtOAc), um die gewünschten Fraktionen identifizieren mit TLC, und sammeln sie (R f = 0,66, 2: 1 Pentan / EtOAc, UV). Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,6 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (2,8 mmol, 88% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung ergab bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li></ol></li><li> Acylierte Spezies (2 Reaktionsschritte) <ol><li> Man löst 1,4 g S -methylisothiuronium Hemisulfat (10 mmol, 1,0 eq.) Und 2,2 g Di (tert - butyl) dicarbonat (10 mmol, 1,0 eq.) In einem kräftig rührenzweiphasige Lösung von DCM / sat läuten. aq. NaHCO 3 und lassen Sie es für 24 h bei RT rühren. </li><li> Man trennt die Schichten im Scheidetrichter und extrahiert die wässrige Phase dreimal mit DCM. Vereinige die organischen Phasen, trockne sie mit Na 2 SO 4 und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml Hexan. </li><li> Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 100 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 4: 1 Hexan / EtOAc. Legen des gelösten Rohproduktes an der Säule. In Lösungsmitteln unter Druck. Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (Lösungsmittelsystem: 4: 1 isokratischen Hexan / EtOAc (UV - Detektion: 254 nm), und sammeln sie (R f = 0,30). </li><li> Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 1,1 g der Titelverbindung als gelbes, viskoses Öl (5,8 mmol, 58% Ausbeute) zu erhalten. Speichert das Reagenz, N - (tert - Butoxycarbonyl) - S -Methylisothiourea bei RT für die weitere Verwendung. </li><li> Man löst 250 mg N - (tert - Butoxycarbonyl) - S - methylisothioharnstoff (1,3 mmol, 1,0 eq.) In 10 ml trockenen N, N - Dimethylformamid (DMF) in einer 50-ml - Rundkolben in einer inerten Atmosphäre bei RT. Hinzufügen 440 &amp; mgr; l N, N-Diisopropylethylamin (DIPEA) (2,6 mmol, 2 Äqu.) Unter Verwendung einer Spritze. Unter Rühren wurde 245 &amp; mgr; l von Ac 2 O (5,2 mmol, 4,0 Äq.) Tropfenweise mit einer Spritze und läßt sie für 1 h bei RT rühren. </li><li> Hinzufügen eines Überschusses an Methanol (2 ml) zu der Mischung unter Verwendung einer Spritze und ließ es für 15 min bei RT rühren. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer. Nehmen Sie das Rohprodukt bis in 1 ml DCM. </li><li> Laden eine Flash-Säule (2,5 cm x 20 cm) mit 60 g Siliciumdioxid in einer Lösung von 3: 1 Hexan / EtOAc 3: 1. Wenden Sie das gelöste Rohprodukt auf die Säule. Hinzufügen Lösungsmittel (3: 1 Hexan / EtOAc) und Druck (1,5 bar). Identifizieren der gewünschten Fraktionen mit DC (3: 1 Hexan / EtOAc, UV: 220 nm), und colLect sie (R f = 0,62). </li><li> Kombinieren der gewünschten Fraktionen und dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer 210 mg der Titelverbindung als weißer Feststoff (0,9 mmol, 70% Ausbeute) zu erhalten. Lagern Sie die Verbindung bei RT für die weitere Verwendung. </li></ol></li></ol> 2. Synthese von zyklischen Peptids Precursors <ol><li> Laden und TCP - Harz Capping <ol><li> 1.00 g 2-chlortriyl Chlorid (CTC) Harz (0,9 mmol / g) und 320 mg Fmoc-Gly-OH (1,2 Äq.) In eine 20 ml-Kunststoffspritze mit einer Fritte. Es wird eine Lösung von 313 &amp; mgr; l DIPEA (2 Äqu.) In 5 ml trockenem DCM und füge sie die Spritze. Lassen Sie es für 1 h bei RT drehen, um eine Dreheinheit. </li><li> Indessen bereitet eine 2-ml-Lösung von 5: 1 Methanol / DIPEA (v / v; Capping-Lösung). Fügen Sie die Capping-Lösung mit der Spritze und lassen Sie es für weitere 15 min drehen. Waschen des Harzes mit DCM (5 ×) und DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung<ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Orn (Dde) -OH <ol><li> Hinzufügen 934 mg Fmoc-L-Orn (Dde) -OH (2 eq.), 684 mg 1- [Bis (dimethylamino) methylen] -1 H -1,2,3-triazolo [4,5-b] Pyridinium-3-oxid-hexafluorphosphat (HATU) (2 Äq.) und 245 mg 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol (HOAt) (2 Äq.) in ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Fügen Sie diese Lösung auf den Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundenen Gly und lassen Sie es für 1 h drehen. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Val-OH <ol><li> Hinzufügen 610 mg Fmoc-Val-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen, und harzgebundene Orn (Dde) -Gly und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle den harzgebundene Fmoc-Val-Orn (Dde) -Gly mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz N- Methylierungs <ol><li> Waschen des Harzes mit DCM (3x). Man löst 887 mg 2-Nitrobenzolsulfonylchlorid (o -NBS-Cl, 4 eq.) In DCM und fügen Sie 1,2 ml 2,4,6-Collidin (10 eq.). </li><li> Fügen Sie die Lösung für das harzgebundene Peptid und lassen Sie es 20 Minuten lang bei RT inkubiert. </li><li> Das Harz wird mit CH 2 Cl 2 (3x) und mit THF (5 ×). Es wird eine Lösung mit 1,18 g PPh 3 (5 Äq.) Und 365 &amp; mgr; l Methanol in THF. Diese Lösung wird auf dieSpritze. </li><li> Es wird eine Lösung mit 883 &amp; mgr; l von DIAD in 2 ml THF und fügen sie die Spritze. Lassen Sie es für 15 min inkubiert. Das Harz wird mit THF (5x) und mit DMF (5 x). </li></ol></li><li> o -ns Entschützung <ol><li> Es wird eine Lösung mit 570 &amp; mgr; l Mercaptoethanol (10,0 Äq.) Und 672 &amp; mgr; l Diazabicycloundecen (DBU) in 2 ml DMF. Fügen Sie diese Lösung in die Spritze und lassen Sie es für 5 min inkubiert. </li><li> Wiederholen Sie die Entschützungsschritt und dann Waschen des Harzes mit DMF (5 x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc - D-Phe-OH <ol><li> Hinzufügen 697 mg Fmoc-D-Phe-OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 ml DMF . In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> On-Harz Fmoc - Entschützung <ol><li> Behandle das Harz-bound Peptid mit 20% Piperidin in DMF für 10 min und dann für 5 min. Waschen des Harzes mit DMF (3x). </li></ol></li><li> On-Harz Kopplung von Fmoc-Asp (Ot Bu) -OH <ol><li> Hinzufügen von 741 mg Fmoc - Asp (Ot Bu) -OH (2 eq.), 684 mg HATU (2 eq.) Und 245 mg HOAt (2 eq.) In ein kleines Glasfläschchen und löse es in 5 mL DMF. In 814 ul DIPEA. </li><li> Füge diese Lösung auf die Fmoc-Schutzgruppe entfernt, gewaschen und harzgebundene Peptid und ließ sie für 1 h rotieren. </li></ol></li><li> Die Abspaltung des linearen Peptids von dem Harz <ol><li> Waschen des Harzes mit DCM (3x) und anschließend Herstellung von 10 ml einer Lösung von Hexafluorisopropanol (HFIP) in DCM (1: 4; v / v). </li><li> Fügen Sie die Lösung zu dem Harz und lassen Sie es für 15 min drehen. Sammeln Sie die Lösung in einem Rundkolben. Wiederholen der Spalt- und verdampfe das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer. </li></ol></li><li> Cyclisierung des linearen Peptids <ol><li> dissolve 384 mg NaHCO 3 (5,0 Äq.) und 582 &amp; mgr; l von Diphenylphosphorylazid (DPPA) (3,0 eq.) in 50 ml DMF und fügen Sie das Rohprodukt. Ließ es über Nacht rühren oder bis sich kein lineares Peptid mit ESI-MS (10 h) 17 beobachtet. </li><li> Unter vermindertem Druck, reduzieren das Lösungsmittel zu einem kleinen Volumen mit einem Rotationsverdampfer. Bereiten eine gesättigte wässrige Lösung von NaCl (Salzlösung). Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette, fügen Sie das cyclisierte Peptid tropfenweise zu 40 ml einer gesättigten wässrigen NaCl-Lösung in ein Zentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) und wäscht den Niederschlag mit HPLC-Wasser (2x). Lyophilisieren das Produkt. </li></ol></li></ol> 3. Guanidinylierung und Entschützung in Lösung <ol><li> Guanidinylierung mit den maßgeschneiderten Vorläufern <ol><li> Man löst eine kleine Menge (beispielsweise 25 mg) des orthogonal entschützt zyklischen Peptid in einem kleinen Volumen DMF (zB 2 mL). In 2 eq. des Guanidinylierung Vorläufers und 2 eq. DIPEA zu der Lösung und lassen Sie es für 2 h bei RT rühren. </li><li> Überwachen Sie den Fortschritt der Reaktion mit HPLC-MS. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, entfernen das Lösungsmittel, wieder aufzulösen das guanidinylated zyklische Peptid in Acetonitril und semipräparative HPLC - Reinigung 16 durchzuführen. </li></ol></li><li> Die Entfernung der säurelabilen Seitenkettenschutzgruppen <ol><li> Bereiten 2 ml einer Lösung, die Trifluoressigsäure (TFA), Wasser und Triisopropylsilan (TIPS) (95 / 2,5 / 2,5; v / v / v). Fügen Sie diese Lösung für das gereinigte Produkt in einem kleinen Glasfläschchen und lassen Sie es für mindestens 1 h bei RT rühren. Beachten Sie die vollständige Entfernung der Schutzgruppe mit ESI-MS 17. </li><li> Dampfe das Lösungsmittel unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen. Bereiten eiskaltem Ether und gibt 10 ml in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Auszufällen, das entschützte Peptid in eiskaltem Ether mit einer Pasteurpipette durch Zugabe vontropft. Zentrifugierte die Suspension (5.000 xg, 5 min) um ein Pellet zu erhalten. </li><li> Wäscht den Niederschlag mit eiskaltem Ether und zentrifugiert es (5000 xg, 5 min, 2 x). Man löst das Produkt in 2 ml HPLC-Wasser reinigen und es mit semipräparative HPLC 16. </li></ol></li></ol> 4. Analytische Daten und Parameter für die Reinigung <ol><li> Analytische HPLC-ESI-MS <ol><li> Führen analytischen HPLC-ESI-MS mit einem LCQ-Massenspektrometers unter Verwendung einer C18-Säule (12 nm Porengröße, 3 &amp; mgr; m Teilchengrße, 125 mm × 2,1 mm), oder eine C8-Säule (20 nm Porengröße, 5 um Partikel Größe, 250 mm × 2,1 mm), mit H 2 O (0,1% v / v Ameisensäure) / Acetonitril (0,1% v / v Ameisensäure) als Eluenten. </li></ol></li><li> Semi-präparative HPLC <ol><li> Führen semipräparative HPLC ein präparativen HPLC-Instrument mit einer ODS-A-Säule (20 x 250 mm, 5 &amp; mgr; m), eine Fließgeschwindigkeit von 8 ml / min, und den linearen VerläufenH 2 O (0,1% v / v TFA) und Acetonitril (0,1% v / v TFA). </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Der Vorläufer für Guanidinylierung ist ein orthogonal entschützt zyklische Peptid - Derivat, (c (OrnD (Ot Bu) Gf (N Me) V)), die durch ein Standard - Fmoc - Protokoll von Festphasen - Peptidsynthese (SPPS) synthetisiert wird. Ornithin wurde als orthogonal geschützten Derivat (Fmoc-Orn (Dde) -OH) verwendet, die mit Hydrazin in DMF nach der Cyclisierung des Peptidgerüstes entschützt werden können. Der Peptid-Vorläufer wird durch die Fällung der Verbindung und durch die anschließende Ge...

Zu den am häufigsten vorkommenden pharmakophorer Gruppen in natürlichen Liganden ist die Guanidingruppe, die in mehreren Interaktionen beteiligt ist 1, 2. Beispielsweise dient er als ein potenzieller vierfachen Wasserstoff-Donator in Wasserstoffbrücken-Wechselwirkungen und wird in der elektrostatischen Wechselwirkungen, wie Salzbrücken oder Kationen-π-Wechselwirkungen beteiligt. In der medizinischen Chemie ist diese Gruppe oft mit Drogen und Medikamenten - Kandidaten 4, gefunden , obwohl sehr oft als Guanidin - Mimetika 5, 6. Der Grund für die Entwicklung von Guanidin-Mimetika ist die Entfernung von der allgegenwärtigen, positiv geladenen Guanidingruppe, sowie die Einstellung der Lipophilie des Liganden. In peptidische Liganden, ist der einzige Guanidingruppe haltige Aminosäure Arginin, die in der bioaktive Region peptidische Liganden gefunden wird daher häufig. Ein sehr prominent Beispiel für eine argininhaltigen Ligandenfamilie ist die Unterfamilie der RGD-bindend Integrinen. Im Allgemeinen sind die Integrine eine Klasse von Zelladhäsionsrezeptoren, die in allen höheren Organismen über wichtige Funktionen übernehmen. Einige dieser Funktionen beinhalten die Zelladhäsion, Migration und das Überleben der Zelle. So werden sie auch in pathologischen Indikationen, wie Krebs und Fibrose beteiligt. Integrine sind heterodimere Transmembran-Proteine, die aus einer α- und einer β-Untereinheit, die 24 derzeit bekannten Integrin-Subtypen bilden; 8 von ihnen die Tripeptidsequenz Arg-Gly-Asp (RGD =) in ihren Liganden 7 erkennen. Die Bindungsregion an der Grenzfläche zwischen diesen beiden Subtypen in dem extrazellulären Teil befindet, die sogenannte Integrin - Kopfgruppe 8. die metallionenabhängige Adhäsionsseite (MIDAS) Region, die in der Beta-Untereinheit befindet und bindet die Carbonsäure in den Liganden (Seiten cha: RGD wird durch zwei gemeinsame Wechselwirkungen anerkanntin der Asp); und die Guanidingruppe in den Liganden, die in der alpha-Untereinheit befindet. Die meisten der Integrin - Untertypen sind promiskuitiv und zumindest einen Teil ihrer natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) -Liganden 9 teilen. So ist für die Entwicklung von künstlichen Integrin-Liganden, der Schwerpunkt ist neben einer hohen Bindungsaffinität, die Selektivität Subtyp. Vor kurzem konnten wir ein Schlüsselelement für die Erzeugung von Subtyp selektiven Liganden enthüllen: die Guanidingruppe. Durch unterschiedliche Modifikationen können biselective Liganden für die αv- und α5-enthaltende Integrin - Subtypen in selektive Verbindungen , die durch einfache Modifikationen an der Guanidingruppe gedreht werden, der dann die verschiedene α-Untereinheiten 10 unterscheiden kann. In der Tasche der &amp; alpha; v interagiert die Guanidingruppe side-on über einen zweizähnigen Salzbrücke mit Asp218 11, 12. Diese Wechselwirkung cein auch in α5β1 beobachtet werden (hier mit Asp227 in α5), sondern zusätzlich ein End-Wechselwirkung der Guanidingruppe mit einem Gln - Rest (Gln221) wird 13 beobachtet. Somit modifizierten wir die Guanidingruppe in zwei entgegengesetzter Weise: in einem Fall durch die Seite-an blockierenden Zusammenwirken mit der Methylierung des N δ der Guanidingruppe, und im anderen Fall mit der Methylierung des Guanidin - N ω, Blockierung der End-on - Interaktion. Überraschenderweise führte diese kleine Änderung zu einer vollständigen Selektivität Verschiebung der Liganden. Neben der Alkylierung wurde eine neue Methode Funktionalisierung in dieser Publikation vorgestellt. Die klassische Funktionalisierung Verfahren für diese Art von pentapeptidic Ligand ist durch die Seitenketten - Konjugation einer Aminosäure nicht in 14 - Bindung (zB K in c (RGDfK)) beteiligt sind , 15. Hier,wir zeigen, dass die Funktionalisierung durch Modifizierung des Guanidin auch möglich ist - mit einem Acyl- oder alkylierte Linker - die für die Bindung von entscheidender Bedeutung ist. Die positive Ladung , die essentiell für die Bindung ist , beibehalten wird , und Modelle legen nahe , dass die langkettigen Punkte aus der Bindungstasche und somit eine ideale Möglichkeit für die Befestigung von weiteren Linkern Bereitstellung und Markierungseinheiten (zB einer Fluoreszenzmarkierung oder ein Chelator für molekulare imaging). In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf den Herstellungsschritten für die Modifikation der Guanidingruppe in Arginin-enthaltenden Liganden. Dies beinhaltet die Synthese von N ω -methylated Spezies sowie Guanidine mit längeren Linker - Einheiten. Die verschiedenen Modifikationen umfassen Acyl- und Alkylgruppen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">N,N&#8242;-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">434167&#160;ALDRICH</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triphenylphosphine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T84409&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran, &#62;99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diisopropyl azodicarboxylate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>225541&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethan, for synthesis, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica gel for flash chromtaography</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60738&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Pentane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Hexane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminohexanol, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A56353&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Methylisothiourea hemisulfate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M84445 ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Di-tert-butyl dicarbonate, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>205249&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamid, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamin, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydrid, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chlortrityl resin</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Gly-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidin, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>104094&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Orn(Dde)-OH</td>
			<td>Iris-Biotech</td>
			<td>FAA1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HATU, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HOAt, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Val-OH</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N11507&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,4,6-Collidine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27690&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mercaptoethanol, 99%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diazabicycloundecen, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>139009&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-D-Phe-OH, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>47378&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexafluoroisopropanol</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC03056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diphenylphosphoryl azide, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>178756&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TFA, 99.9%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilan, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>233781&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN44</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification and functionalization of the guanidine group by tailor-made precursors

Die Guanidingruppe ist eine der wichtigsten pharmakophorer Gruppen in der medizinischen Chemie. Die einzige Aminosäure, die eine Guanidingruppe tragende ist Arginin. In diesem Artikel ist eine einfache Methode zur Modifikation der Guanidingruppe in peptidische Liganden zur Verfügung gestellt, mit einem Beispiel für RGD-bindende Integrin-Liganden. Es wurde vor kurzem gezeigt , dass die unterschiedliche Modifikation der Guanidingruppe in diesen Liganden für die selektive Modulation des Subtyps ermöglicht (beispielsweise zwischen den Subtypen &amp; agr; v und α5). Darüber hinaus wurde eine bisher unbekannte Strategie für die Funktionalisierung über die Guanidingruppe demonstriert und der Syntheseansatz wird in diesem Dokument überprüft. Die Modifikationen betreffen hier beschriebenen endständig (N ω) alkyliert und Guanidin - Gruppen acetyliert. Für die Synthese, maßgeschneiderte Vorläufermoleküle synthetisieren, die dann zu einer Reaktion mit einem orthogonal ungeschützten Amin unterzogen werden, um die pre zu übertragen-modifizierte Guanidingruppe. Für die Synthese von alkylierten Guanidinen, basierten auf Vorläufer N, N &#39;-Di-Boc-1H - pyrazol-1-carboxamidin wird verwendet acylierten Verbindungen zu synthetisieren, die Vorläufer der Wahl ein entsprechend acylierten Derivates von N - Boc - S ist - methylisothioharnstoff, die in ein- und zweistufigen Reaktionen erhalten werden können.

Der cyclische Peptidvorläufer wurde als ein lineares Peptid synthetisiert, cyclisiert und orthogonal Dde-Schutzgruppe entfernt. Nach der Fällung wurde die Reinheit der Verbindung mit HPLC-MS (Figur 1) analysiert. Um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen, wurde eine HPLC - Analyse durchgeführt , nachdem die 2-h Reaktionszeit (Abbildung 2). Für größere Rückstände auf der Guanidingr...

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Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Ein Protokoll für die Synthese von alkylmodifizierte Guanidine, basierend auf der Verwendung der entsprechenden Vorstufen dargestellt.

Modifikation und Funktionalisierung der Guanidingruppe von Maßgeschneidert Precursors

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Aufrufe.  Technische Universität München.  Ein Protokoll für die Synthese von alkylmodifizierte Guanidine, basierend auf der Verwendung der entsprechenden Vorstufen dargestellt. 

Serie: Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Forschung

Biochemie

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

Bildgebung von extrazellulären Vesikeln durch Atomkraftmikroskopie

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Mitochondrien und Endoplasmatische Retikulum-Bildgebung durch korrelative Licht- und Volumenelektronenmikroskopie

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Real-Time, halbautomatisierte Fluoreszenzmessung der Luftbogenoberfläche Liquid pH der primären menschlichen Luftweg-Epithelzellen

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Hochdurchsatz totale interne Reflexionfluoreszenz und direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie mit einem Photonischen Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...