TGK maddi destekleri için Technische Universität München Fen ve Mühendislik (IGGSE) Uluslararası Enstitüye kabul eder. HK destekleri için Entegre Protein Bilim Münih için Merkezini (CIPSM) kabul eder.

Not: Bütün reaktifler ve çözücüler, ticari tedarikçilerden elde edildi ve daha fazla saflaştırılmadan kullanıldı. Dikkat: Kullanmadan önce tüm ilgili güvenlik bilgi formuna (MSDS) başvurun. Kimyasal sentezleri (örneğin, davlumbaz, güvenlik gözlüğü, eldiven, laboratuvar önlüğü, boy pantolon ve kapalı parmak ayakkabılardan) gerçekleştirirken tüm uygun güvenlik ekipmanlarını kullanın. Guanidinylation Öncülerinin 1. sentezi <ol><li> Alkile türler <ol><li> Metilli türler <ol><li> Kuru, 10 mL (PPh3, 3.8 mmol, 1.2 eşi.), N, N &#39;1.0 g eritin-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin (3.2 mmol, 1 eşd.) Ve 1.0 g trifenilfosfin oda sıcaklığında (RT), bir kauçuk septum ile bir inert atmosfer içinde bir 50-mL yuvarlak dipli bir şişede tetrahidrofuran (THF). bir şırınga (4.8 mmol, 1.5 eş.) ve l kullanılarak kuru metanol 194 mcLve bu, oda sıcaklığında karıştırın. </li><li> Ayrı olarak, küçük bir cam şişe içinde kuru THF, 2 mL diizopropil azodikarboksilat 747 uL (DIAD, 3.8 mmol, 1.2 eşi.) Içeren bir çözelti hazırlanmıştır. Karıştırılırken, bir şırınga (15 dakika boyunca) kullanılarak N, N&#39;-N&#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin, PPh3, ve metanol çözeltisine damla damla THF içinde DIAD çözeltisi ilave edilir. Oda sıcaklığında 2 saat süre ile çözelti karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın ve 1 mL diklorometan (DCM) içerisinde ham ürün çözülür. Bir pentan çözeltisi içinde% 10 etil asetat içinde 100 g silis (EtOAc) ile bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin. kolon üzerinde çözülmüş ham ürün yüklenir ve basınçta (1.5 bar) altında çözücü ekleyin. </li><li> (Çözücü sistemi: izokratik% 10 pentan içinde EtOAc) fraksiyonları toplayın, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile istenen bileşik nokta belirlemek ve (Rf = 0.4, EtOAc / pentan 1: 9, UV) toplayın. istenilen birleştirinfraksiyonlar san, yapışkan bir yağ (2.6 mmol,% 81 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 0.85 gramını elde etmek üzere bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır ve. ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında vermiştir bileşik saklayın. </li></ol></li><li> Heksilamin modifiye türler <ol><li> N 1.0 g çözülür, N&#39;-Di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin (3.2 mmol, 1.0 eşi.), DDE-6-aminoheksanol Sentezi (3.8 mmol, 1.2 eşi.), 0.9 g, ve 1.0 g atıl bir atmosfer içinde 50 mL&#39;lik yuvarlak dipli bir şişede kuru 10 mL THF içinde PPh3 (3.8 mmol, 1.2 eşd.) oda sıcaklığında bir kauçuk bölüm ile. </li><li> Ayrı olarak, küçük bir cam şişe içinde DIAD 747 uL (3.8 mmol, 1.2 eşi.), Kuru THF içinde 2 mL bir çözelti hazırlanmıştır. Karıştırılırken, N solüsyonuna damla damla THF içinde DIAD çözeltisi ekleyin, bir şırınga kullanılarak N &#39;-di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin, PPh3, ve DDE-6-aminoheksanol Sentezi (boyunca 15 dk) . Oda sıcaklığında 2 saat süre ile çözelti karışmaya bırakıldı. </li><li>Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın ve 1 mL DCM içerisinde ham ürün toplanır. pentan / EtOAc çözeltisi içinde 100 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yük (2: 1). kolon üzerinde çözülmüş ham sürün ve basınçta (1.5 bar) altında solvent ekleyin. </li><li> Fraksiyonların kazan (çözücü sistemi: izokratik 2: 1 pentan / EtOAc), TLC ile istenen fraksiyonu belirlemek ve bunları toplamak (Rf = 0.66, 2: 1 pentan / EtOAc, UV). İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve bir sarı zor akışlı bir yağ (2.8 mmol,% 88 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 1.6 gramını elde etmek üzere döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. ileride kullanılmak üzere oda sıcaklığında vermiştir bileşik saklayın. </li></ol></li></ol></li><li> Asile türleri (2 reaksiyon adımıyla) <ol><li> S -methylisothiuronium hemisülfatın 1.4 g (10 mmol, 1.0 eşi.) Ve di (tert-butil) dikarbonat 2.2 g çözülür (10 mmol, 1.0 eq.) Kuvvetli bir şekilde karışmaya içindeDCM iki fazlı çözelti halka / sat. su. NaHCO 3 ve oda sıcaklığında 24 saat süre ile karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir ayırma hunisi içinde Tabakaları ayırın ve DCM ile sulu faz üç kez ekstrakt edin. Organik fazlar birleştirilir, Na2 SO 4 ile kuru ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücüyü çıkarın. heksan 1 mL Ham ürün toplanır. </li><li> 1 heksan / EtOAc: 4 bir çözelti içinde 100 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin. kolon üzerinde çözülmüş ham ürün yüklenir. basınç altında çözücü ekleyin. (Rf = 0.30) 254 nm), ve bunları toplamak: 4: 1 izokratik heksan / EtOAc (saptama UV TLC (çözücü sistemi ile istenen fraksiyonu belirlenmesi. </li><li> İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve bir sarı zor akışlı bir yağ (5.8 mmol,% 58 verim) halinde başlıktaki bileşiğin 1.1 gramını elde etmek üzere döner bir buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. (Tert-butoksikarbonil) - - reaktifi, N Mağaza S -meDaha fazla kullanım için oda sıcaklığında thylisothiourea. </li><li> N 250 mg çözülür - bir inert atmosfer içinde bir 50-mL yuvarlak dipli bir şişeye S -methylisothiourea (1.3 mmol, 1.0 eşi.), Kuru N, N-dimetilformamid (DMF), 10 ml de - (tert-butoksikarbonil) RT. Bir şırınga kullanılarak, N, N-diizopropiletilamin (DIPEA), 440 uL (2.6 mmol, 2 eş.) ilave edilir. Karıştırılırken, Ac2O (5.2 mmol, 4.0 eşi.) 245 mcL bir şırınga kullanılarak damla damla ve oda sıcaklığında 1 saat karışmaya bırakıldı. </li><li> Bir şırınga kullanılarak karışıma metanol aşırısı (2 mL) ilave edilir ve oda sıcaklığında 15 dakika karışmaya bırakıldı. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın. 1 mL DCM içerisinde ham ürün toplanır. </li><li> 1 heksan / EtOAc 3: 3&#39;ün bir çözelti içinde 60 g silis içeren bir flaş kolonu (2.5 cm x 20 cm) yükleyin 1. kolona çözülmüş ham ürün uygulanır. Ekle çözücü (3: 1 heksan / EtOAc) ve basınçta (1.5 bar). (1: heksan / EtOAc, UV: 220 nm 3), ve sütun TLC istenen fraksiyonlar belirlenmesibunları (Rf = 0.62) Lect. </li><li> İstenen fraksiyonlar bir araya getirin ve (0.9 mmol,% 70 verim) beyaz bir katı olarak başlıkta adı geçen bileşiği 210 mg olarak elde edilmesi için bir döner buharlaştırıcı kullanılarak düşük basınç altında çözücü buharlaştırılır. Daha fazla kullanım için oda sıcaklığında bileşik saklayın. </li></ol></li></ol> Siklik Peptit Öncülerinin 2. sentezi <ol><li> Yükleme ve TCP reçine kapatma <ol><li> bir cam hamuru ile plastik bir 20 mL&#39;lik bir şırıngaya 2-chlortriyl klorür (CTC) reçinesi (0.9 mmol / g) ve Fmoc-Gly-OH (1.2 eq.) 320 mg, 1.00 g ekleyin. Kuru DCM 5 mL DIPEA 313 uL (2 eşi.) ihtiva eden bir çözelti hazırlanması ve bir şırıngaya ekleyin. Bu, döner bir ünite ile, oda sıcaklığında 1 saat boyunca dönüşümlü olsun. </li><li> (; Örtücü çözeltisi h / h) 1 metanol / DIPEA: Bu arada, 5 2 ml solüsyon hazırlanır. şırıngaya kapatma çözüm ekleyin ve 15 dakika daha çevirin edelim. DCM (5 x) ve DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde<ol><li> 5 dakika boyunca, daha sonra 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Gly tedavi ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> On-reçinesi yerine Fmoc-Orn (DDE) bağlanması -OH <ol><li> Fmoc-L-Orn (Dde) -OH 934 mg ekleyin (2 eşi.), 1- 684 mg [bis (dimetilamino) metilen] -1 H-1,2,3-triazolo [4,5-b] piridinyum 3-oksit (HATU) (2 eşi.) ve 1-hidroksi-7-azabenzotriazol (HOAt) 245 mg (2 eş.), küçük bir cam şişeye ve 5 mL DMF içinde çözülür. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı Gly Bu solüsyon ilave edin ve 1 saat boyunca dönmesine izin verin. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> 5 dakika daha sonra -Gly 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Orn (Dde) ve Treat ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc-Val-OH On-reçine bağlama <ol><li> (2 eşi.), Fmoc-Val-OH 610 mg ekleme, 6HATU 84 mg (2 eşd.), Ve 245 bir küçük cam şişeye HOAt mg (2 eq.) Ve 5 mL DMF içinde çözülür. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Bu çözüm, Fmoc koruma grubu çıkarılır yıkandı, ve reçineye bağlı Orn (Dde) -Gly ve 1 saat boyunca dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> 5 dakika daha sonra -Gly 10 dakika süre ile, DMF içinde% 20 piperidin ile Resin bağlı Fmoc-Val-Orn (Dde) ve Treat ve. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> On-reçine N-metillenmesi <ol><li> DCM (3x) ile reçine yıkayın. DCM içinde 2-nitrobenzen sulfonilklorid (O -NBS-CI, 4 eş.) 887 mg çözülür ve 2,4,6-kollidin 1.2 mL eklemek (10 eşi.). </li><li> resin bağlı peptite solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> CH2C! 2 (3x) ile ve THF (5x) ile reçine yıkanır. PPh3, 1.18 g (5 eşi.) Ve THF içinde bir metanol 365 uL bir çözelti hazırlayın. bu çözümü ekleşırınga. </li><li> 2 mL THF içindeki bir DIAD 883 uL olan bir çözelti hazırlanır ve şırıngaya ekleyin. 15 dakika boyunca kuluçkaya edelim. THF (5x) ile ve DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> O -NS koruma kaldırma <ol><li> merkaptoetanol 570 uL (10.0 eşi.) ve 2 mL DMF içerisinde diazabicycloundecen 672 uL (DBU) ile bir çözelti hazırlayın. şırıngaya bu çözümü ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe izin verin. </li><li> koruma kaldırma adımı tekrar edin ve daha sonra DMF (5x) ile reçinenin yıkanması. </li></ol></li><li> Fmoc-D-Phe-OH üzerine reçine bağlama <ol><li> Fmoc-D-Phe-OH 697 mg ekleyin (2 eşi.), HATU 684 mg (2 eşd.) Ve küçük bir cam şişeye HOAt (2 eşi.) 245 mg ve 5 mL DMF içinde çözülür . DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı peptidi bu solüsyonu ekleyin ve 1 st için dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Fmoc koruması giderildikten reçine üzerinde <ol><li> Reçine-b tedaviound DMF içinde% 20 piperidin, 10 dakika boyunca ve daha sonra 5 dakika süre ile birlikte peptit. DMF (3x) ile reçine yıkanır. </li></ol></li><li> Fmoc-Asp (Ot-Bu) -OH On-reçine bağlama <ol><li> 5 mL içinde (2 eq.) Fmoc-Asp (Ot-Bu) -OH 741 mg ekleme, HATU 684 mg (2 eşd.) Ve küçük bir cam şişeye HOAt 245 mg (2 eşd.) Ve çözülür DMF. DIPEA 814 uL ekleyin. </li><li> Fmoc-korumalı yıkandı, ve reçineye bağlı peptidi bu solüsyonu ekleyin ve 1 st için dönmesine izin verin. </li></ol></li><li> Reçineden doğrusal peptidin bölünmesi <ol><li> DCM&#39;de (HFIP) içindeki bir çözeltisi 10 ml hazırlamak, daha sonra DCM (3x) ile reçine yıkanır ve (1: 4 v / v). </li><li> reçineye çözüm ekleyin ve 15 dakika dönmesine izin verin. yuvarlak tabanlı bir şişe içinde çözelti toplayın. bölünmesini tekrar edin ve bir döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücü buharlaştırılır. </li></ol></li><li> Lineer peptid siklizasyonu <ol><li> DiNaHCO 3 (5.0 eq.) ve 50 mL DMF içerisinde difenilfosforil azit 582 uL (DPPA) (3.0 eşi.) 384 mg ssolve ve ham ürün ekleyin. Bu, gece boyunca karışmaya olsun ya da doğrusal bir peptid, ESI-MS (10 saat) 17 ile gözlenen kadar. </li><li> indirgenmiş basınç altında, bir döner buharlaştırıcı kullanılarak küçük bir hacme azaltır. NaCl (tuzlu su), doymuş bir sulu çözelti hazırlayın. Pasteur pipeti kullanılarak, bir santrifüj tüpü içinde NaCI doymuş sulu solüsyon, 40 mL siklize peptid damla damla ilave edilir. </li><li> süspansiyonu (5.000 x g, 5 dakika) santrifüj ve HPLC-grade, su (2x) ile bir çökelti yıkayın. Ürünü liyofilize edin. </li></ol></li></ol> Çözeltide 3. Guanidinylation ve korumasının bozulması <ol><li> Kişiye özel öncüleri ile Guanidinylation <ol><li> DMF, küçük bir hacim içinde (örneğin, 25 mg), dik olarak koruması siklik peptid küçük bir miktar içinde çözündürülür (örneğin, 2 mL) eklenmiştir. 2 eq ekleyin. guanidinylation ön ve 2 ek. ve çözeltiye DIPEA bu ​​oda sıcaklığında 2 saat karışmaya bırakıldı. </li><li> HPLC-MS ile reaksiyon ilerleme izleyin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, asetonitril çözücü yeniden çözülür guanidinylated siklik peptid kaldırmak ve yarı preparatif HPLC saflaştırma 16 gerçekleştirin. </li></ol></li><li> Asit labil yan zincir koruma gruplarının çıkarılması <ol><li> trifluoroasetik asit (TFA), su, ve triisopropilsilan (TIPS) ihtiva eden bir çözeltiye, 2 mL hazırlama (95 / 2.5 / 2.5 v / v / v). küçük bir cam şişe içinde saflaştırılmış ürün, bu solüsyonu ekleyin ve en az 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışmaya bırakıldı. ESI-MS 17 ile tam deproteksiyon dikkate alınmalıdır. </li><li> küçük bir hacme kadar indirgenmiş basınç altında çözücüyü buharlaştınn. buz soğukluğunda eter hazırlamak ve bir 50-ml santrifüj tüpü içinde 10 mL ekleyin. ekleyerek bir Pasteur pipeti kullanılarak, buzla soğutulmuş eter içinde deprotekte Peptidi çöktürmekilave edildi. bir pelet elde etmek üzere süspansiyonu (5.000 x g, 5 dakika) santrifüj. </li><li> (5000 xg, 5 dakika, 2 x), buz soğukluğunda eter ile çökelti yıkanır ve santrifüj. HPLC-grade 2 mL su içinde ürününü ve yarı preparatif HPLC 16 ile saflaştırılması. </li></ol></li></ol> 4. Analitik Veriler ve Arıtma için parametreler <ol><li> Analitik HPLC-ESI-MS <ol><li> Bir C 18 sütunu (12 nm gözenek büyüklüğü, 3-um parçacık büyüklüğü, 125 mm x 2.1 mm) ya da bir C8 sütunu (20 nm gözenek boyutlu ve 5 mikron partikül kullanarak bir LCQ kütle spektrometresi ile analitik HPLC-ESI-MS gerçekleştirme büyüklüğü, taşıyıcı olarak, H2O (% 0.1 v / v formik asit) / asetonitril (% 0.1 v / v formik asit) ile 250 mm 2,1 mm x). </li></ol></li><li> Yarı hazırlayıcı HPLC, <ol><li> bir ODS-A sütunu (20 x 250 mm, 5 um), 8 ml / dakikalık bir akış oranı ve lineer değişim dereceleriyle bir HPLC aleti kullanılarak yarı-preparatif HPLC gerçekleştirmeH2 (TFA hac% 0.1 v /) (% 0.1 TFA hac h /) ve asetonitril. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Saczewski, F., Balewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+guanidine+compounds.">Biological activities of guanidine compounds.</a> Exp. Opin. Ther. Patents. 19 (10), 1417-1448 (2009).</li><li>Saczewski, F., Balewski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+activities+of+guanidine+compounds,+2008-2012+update.">Biological activities of guanidine compounds, 2008-2012 update.</a> Exp. Opin. Ther. Patents. 23 (8), 965-995 (2013).</li><li>Wirth, T. H., Davidson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mercury+(II)+Comlexes+of+Guanidine+and+Ammonia,+and+a+general+discussion+of+the+Complexing+of+Mercury+(II)+by+Nitrogen+Bases.">Mercury (II) Comlexes of Guanidine and Ammonia, and a general discussion of the Complexing of Mercury (II) by Nitrogen Bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 86 (20), 4325-4329 (1964).</li><li>Berlinck, R. G., Burtoloso, A. C., Kossuga, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+and+biology+of+organic+guanidine+derivatives.">The chemistry and biology of organic guanidine derivatives.</a> Nat. Prod. Rep. 25, 919-954 (2008).</li><li>Peterlin-Ma&#353;i&#269;, L., Kikelj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+mimetics.">Arginine mimetics.</a> Tetrahedron. 57 (33), 7073-7105 (2001).</li><li>Peterlin-Ma&#353;i&#269;, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+mimetic+structures+in+biologically+active+antagonists+and+inhibitors.">Arginine mimetic structures in biologically active antagonists and inhibitors.</a> Curr. Med. Chem. 13 (30), 3627-3648 (2006).</li><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins:+bidirectional,+allosteric+signaling+machines.">Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines.</a> Cell. 110 (6), 673-687 (2002).</li><li>Liddington, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+aspects+of+integrins.">Structural aspects of integrins.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 819, 111-126 (2014).</li><li>Plow, E. F., Haas, T. A., Zhang, L., Loftusi, J., Smith, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+to+integrins.">Ligand binding to integrins.</a> J. Biol. Chem. 275 (29), 21785-21788 (2000).</li><li>Kapp, T. G., Fottner, M., Maltsev, O. V., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+cause,+great+impact+-+modification+of+guanidine+group+in+RGD+controls+subtype+selectivity.">Small cause, great impact - modification of guanidine group in RGD controls subtype selectivity.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55, 1540-1543 (2016).</li><li>Xiong, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+extracellular+segment+of+integrin+alpha+Vbeta3.">Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3.</a> Science. 294, 339-345 (2001).</li><li>Xiong, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+extracellular+segment+of+integrin+alpha+Vbeta3+in+complex+with+an+Arg-Gly-Asp+ligand.">Crystal structure of the extracellular segment of integrin alpha Vbeta3 in complex with an Arg-Gly-Asp ligand.</a> Science. 296 (5565), 151-155 (2002).</li><li>Nagae, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+&#945;5&#946;1+integrin+ectodomain:+atomic+details+of+the+fibronectin+receptor.">Crystal structure of &#945;5&#946;1 integrin ectodomain: atomic details of the fibronectin receptor.</a> J. Cell Biol. 197 (1), 131-140 (2012).</li><li>Hersel, U., Dahmen, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD+modified+polymers:+biomaterials+for+stimulated+cell+adhesion+and+beyond.">RGD modified polymers: biomaterials for stimulated cell adhesion and beyond.</a> Biomaterials. 24 (24), 4385-4415 (2003).</li><li>Auernheimer, J., Dahmen, C., Hersel, U., Bausch, A., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoswitched+Cell+Adhesion+on+Surfaces+with+RGD+Peptides.">Photoswitched Cell Adhesion on Surfaces with RGD Peptides.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (46), 16107-16110 (2005).</li><li>Corradini, D., Eksteen, E., Eksteen, R., Schoenmakers, P., Miller, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of HPLC. , (2011).</li><li>de Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Frank, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+Control+of+Integrin-Subtype+Selectivity+in+isoDGR+Peptide+Motifs:+A+Biological+Switch.">Conformational Control of Integrin-Subtype Selectivity in isoDGR Peptide Motifs: A Biological Switch.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49 (48), 9278-9281 (2010).</li><li>Rossiter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+substrate-based+inhibitors+of+mammalian+dimethylarginine+dimethylaminohydrolase.">Selective substrate-based inhibitors of mammalian dimethylarginine dimethylaminohydrolase.</a> J. Med. Chem. 48 (14), 4670-4678 (2005).</li><li>Weiss, S., Keller, M., Bernhardt, G., Buschauer, A., K&#246;nig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N(G)-Acyl-argininamides+as+NPY+Y(1)+receptor+antagonists:+Influence+of+structurally+diverse+acyl+substituents+on+stability+and+affinity.">N(G)-Acyl-argininamides as NPY Y(1) receptor antagonists: Influence of structurally diverse acyl substituents on stability and affinity.</a> Bioorg. Med. Chem. 18 (17), 6292-6304 (2010).</li><li>Hammerschmidt, F., Kvaternik, H., Schweifer, A., Mereiter, K., Aigner, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Synthesis+of+No-Carrier-Added+[*I]MIBG+and+Its+Precursor.">Improved Synthesis of No-Carrier-Added [*I]MIBG and Its Precursor.</a> Synthesis. 44 (21), 3387-3391 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Guanidinylation için ön-madde ((N-Me) V) C (OrnD (Ot-Bu) Gf), katı-faz peptid sentezi (SPPS) içindeki bir standart Fmoc protokolü tarafından sentezlenmektedir olan bir ortogonal olarak koruması siklik peptit türevidir. Ornıtın peptid iskele siklizasyonu DMF içinde hidrazin ile koruması kaldırılabilir ortogonal korumalı türevinin, (Fmoc-Orn (Dde) ve OH), olarak kullanıldı. Peptid ön-madde bileşiği çökeltme ve bunu takiben liyofilizasyon ile saflaştırılır. <p class...

Doğal ligandlar en bol pharmacophoric gruplar arasında birden fazla etkileşimleri 1, 2 katılır guanidin grubudur. Örneğin, hidrojen bağ etkileşimleri potansiyel dört kat hidrojen vericisi olarak hizmet vermekte ve tuz köprüleri veya katyon π etkileşimleri, elektrostatik etkileşimleri, yer almaktadır. Ilaç kimyası alanında, bu grup, guanidin mimetikleri 5, 6 olarak çok sık birlikte, ilaçlar ve ilaç adayları 4 bulunur. guanidin mimetiklerinin tercih edilme sebebi her yerde, pozitif yüklü guanidin grubunun çıkarılması, hem de ligand lipofilisitesinin ayarlanmasıdır. peptidik ligandlarda, sadece guanidin grubu ihtiva eden bir amino asit, bu nedenle genellikle peptid ligandlar biyolojik olarak aktif bölgesinde bulunan, hangi arginindir. Çok prBir arginin içeren ligand ailesi için ominent örneğin bir RGD bağlama integrinlerin alt familyasıdır. Genelde, integrinler bütün yüksek organizmalarda önemli işlevleri devralacak hücre yapışması reseptörlerinin, bir sınıfıdır. Bu işlevlerden bazıları hücre yapışması, göçü ve hücre yaşamını kapsar. Böylece, aynı zamanda, kanser ve fibroz gibi patolojik endikasyonlar, katılmaktadırlar. İntegrinler, 24 bilinen integrin alt türlerini oluşturmak, bir a- ve bir β-alt-birimini kapsayan transmembran heterodimerik proteinlerdir; 8 tanesi ligandları 7 tripeptid sırası Arg-Gly-Asp (= RGD) tanır. Bağlama bölgesi hücre dışı parçası, sözde integrin baş grubu 8, bu iki alt-tip arasındaki ara yüzeyde yer alır. RGD iki yaygın etkileşimleri tarafından kabul edilmektedir: beta alt bulunur ve ligandlar olarak karboksilik asit bağlandığı metal iyonu bağımlı yapışma bölgesini (MIDAS) bölge, (yan cha) Asp arasında; ve alfa alt bulunur ligandlar guanidin grubudur. Integrin alt tipleri çoğu rasgele ve onların doğal hücre-dışı matrisi (ECM) 9 ligandları en azından bir kısmını paylaşır. Böylece yapay integrin ligandları gelişimi için, temel odak noktası yüksek bağlama eğilimi, alt tip seçiciliği yanında olduğunu. guanidin grubu: Son zamanlarda, alt tip-selektif ligandların elde edilmesi için önemli bir unsur ortaya çıkarmak mümkün. Belirgin değişiklikler aracılığıyla, αv- ve için biselective ligandlar a5 içeren integrin alt tiplerinin daha sonra farklı α alt birimleri 10 ayırt edilebilir, guanidin grubu, basit modifikasyonlarla seçici bileşikler haline dönüştürülebilir. Αv bir cebinde, guanidin grubu Asp218 11, 12 ile iki dişli bir tuzu köprüsü üzerinden yan taraflarının etkileşime girer. Bu etkileşim, CBir de (a5 olarak Asp227 ile, burada) α5β1 gözlemlenebilir, ancak ek olarak, bir uç-üzerinde Gln kalıntısının (Gln221) ile guanidin grubunun etkileşim yoktur 13 görülmektedir. Guanidin, N w metilasyonu ile, guanidin grubunun N ö metilasyonu ile yan üzerinde etkileşimi bloke ederek, bir durumda, ve diğer durumda: Bu şekilde, iki zıt yönden guanidin grubu değiştirilmiş sonu ile etkileşimini bloke eder. Şaşırtıcı bir şekilde, bu küçük bir değişiklik ligandlar tam bir seçicilik kaymasına yol açtı. alkilasyonu ek olarak, yeni bir fonksiyonlandırmalar yöntem bu yayında tanıtıldı. Pentapeptidic ligand bu tür klasik fonksiyonalizasyon yöntemi bağlanmada rol oynamayan bir amino asidin yan zinciri, konjugasyon yoluyla (örneğin, c K (RGDfK)) 14, 15. İşte,bağlanma için önemli olduğu - - bir asil ya da alkile edilmiş bir bağlayıcı ile biz işlevselleştirme guanidin değiştirerek de mümkün olduğunu göstermektedir. Bağlanma için gerekli olan pozitif yük muhafaza edilir, ve model bağlama cebinden uzun zincirli noktaları, böylece daha fazla bağlayıcıların bağlanması için ideal bir imkanı sağlanması ve (birimleri etiketleme göstermektedir, örneğin, bir flüoresan etiket veya molekül için bir şelatör görüntüleme). Bu çalışmada, arginin ihtiva eden ligandlarla guanidin grubunun modifikasyonu için hazırlık aşamalarına konsantre. Bu daha uzun bir bağlayıcı birimleri ile N ω metillenmiş türlerin sentez ve aynı zamanda guanidin içerir. farklı modifikasyon asil ve alkil grupları ihtiva eder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="758">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">N,N&#8242;-Di-Boc-1H-pyrazole-1-carboxamidine, 98%&#160;</td>
			<td style="width:151px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">434167&#160;ALDRICH</td>
			<td style="width:111px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:323px;">Triphenylphosphine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T84409&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran, &#62;99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol anhydrous, 99.8%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>322415&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diisopropyl azodicarboxylate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>225541&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichlormethan, for synthesis, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silica gel for flash chromtaography</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>60738&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Pentane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Hexane, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylacetate, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7338</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aminohexanol, 95%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A56353&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">S-Methylisothiourea hemisulfate, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M84445 ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Di-tert-butyl dicarbonate, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>205249&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamid, 99.8%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Diisopropylethylamin, 99.5%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetic anhydrid, 99%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chlortrityl resin</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC11006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Gly-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Piperidin, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>104094&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Orn(Dde)-OH</td>
			<td>Iris-Biotech</td>
			<td>FAA1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HATU, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HOAt, 99%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC01004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Val-OH</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Nitrobenzenesulfonyl chloride, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N11507&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2,4,6-Collidine, 99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27690&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mercaptoethanol, 99%&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6250&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diazabicycloundecen, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>139009&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-D-Phe-OH, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>47378&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 98%</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC05008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hexafluoroisopropanol</td>
			<td>Carbolution</td>
			<td>CC03056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diphenylphosphoryl azide, 97%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>178756&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TFA, 99.9%</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triisopropylsilan, 98%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>233781&#160;ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetonitrile, HPLC grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>HN44</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification and functionalization of the guanidine group by tailor-made precursors

quanidin grubu tıbbi kimyada en önemli pharmacophoric gruplarından biridir. bir guanidin grubunu taşıyan yalnızca bir amino asit arginindir. Bu makalede, peptidik ligandlardaki guanidin grubunun modifikasyonu için kolay bir yöntem olup bir RGD bağlama integrini ligandlann bir örnek temin edilmiştir. Son zamanlarda, bu ligandların guanidin grubunun farklı modifikasyon (αv alt tipleri ve a5 arasında, örneğin) alt-tipinin seçici modülasyonuna izin verir olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, guanidin grubu vasıtasıyla işlevselleştirilmesi için eskiden bilinmeyen bir strateji ortaya konmuştur ve sentetik yaklaşım, bu belgede gözden geçirilmiştir. Burada tarif edilen modifikasyonlar (N-ω) alkile ve asetile guanidin grupları terminal içerir. sentezi için, ısmarlama haberci molekülleri daha sonra ön transfer etmek için bir ortogonal olarak koruması amin ile, bir reaksiyona tabi olan, sentezlenirmodifiye edilmiş guanidin grubudur. Alkile guanidinler sentezi için, ön-N göre, N&#39;-Di-Boc-1 H-pirazol-1-karboksamidin asillenmiş bileşikleri, seçim, N-Boc- S uygun bir asilleştirilmiş türevidir habercisi sentezlenmesi için kullanılır - Bir ve iki aşamalı reaksiyonla elde edilebilir metilizotiyoüre.

siklik peptit ön-madde, bir lineer peptid gibi sentezlenmiştir siklize ve ortogonal Dde-korumasız hale getirilmiştir. Çökelmesinden sonra, bileşiğin saflığı HPLC-MS (Şekil 1) ile analiz edilmiştir. Reaksiyonun ilerlemesini izlemek için, bir HPLC analizi 2-saatlik reaksiyon süresinden (şekil 2) sonra gerçekleştirilmiştir. guanidin grubu daha büyük artıkları için, 2 saat ...

Watch this Scientific Journal Video about Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors at JoVE.com

Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

tekabül eden ön bileşikler kullanımına dayalı alkil-modifiye edilmiş guanidinler sentezi için bir protokol verilmektedir.

Kişiye özel Prekürsorler tarafından Modifikasyon ve Guanidin Grubu işlevselleştirilmesi

The guanidine group is one of the most important pharmacophoric groups in medicinal chemistry. The only amino acid carrying a guanidine group is arginine. ...

modification-functionalization-guanidine-group-tailor-made

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.5K Görüntüleme.  Technische Universität München.  tekabül eden ön bileşikler kullanımına dayalı alkil-modifiye edilmiş guanidinler sentezi için bir protokol verilmektedir. 

Video: Modification and Functionalization of the Guanidine Group by Tailor-made Precursors

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Biyokimya

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of the kinase activity of LRRK2 has been implicated in the pathogenesis of PD, it is essential to establish a method to evaluate the physiological levels of the kinase activity of LRRK2. Recent studies revealed that LRRK2 phosphorylates members of the Rab GTPase family, including Rab10, under physiological conditions. Although the phosphorylation of endogenous Rab10 by LRRK2 in cultured cells could be detected by mass spectrometry, it has been difficult to detect it by immunoblotting due to the poor sensitivity of currently available phosphorylation-specific antibodies for Rab10. Here, we describe a simple method of detecting the endogenous levels of Rab10 phosphorylation by LRRK2 based on immunoblotting utilizing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) combined with a phosphate-binding tag (P-tag), which is N-(5-(2-aminoethylcarbamoyl)pyridin-2-ylmetyl)-N,N&#39;,N&#39;-tris(pyridin-2-yl-methyl)-1,3-diaminopropan-2-ol. The present protocol not only provides an example of the methodology utilizing the P-tag but also enables the assessment of how mutations as well as inhibitor treatment/administration or any other factors alter the downstream signaling of LRRK2 in cells and tissues.

The present study describes a simple method of detecting endogenous levels of Rab10 phosphorylation by leucine-rich repeat kinase 2.

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane proteins and other molecules, and diverse luminal content inherited from a parent cell, which includes RNAs, proteins, and DNAs. The characterization of the hydrodynamic sizes of EVs, which depends on the size of the vesicle and its coronal layer formed by surface decorations, has become routine. For exosomes, the smallest of EVs, the relative difference between the hydrodynamic and vesicles sizes is significant. The characterization of vesicles sizes by the cryogenic transmission electron microscopy (cryo-TEM) imaging, a gold standard technique, remains a challenge due to the cost of the instrument, the expertise required to perform the sample preparation, imaging and data analysis, and a small number of particles often observed in images. A widely available and accessible alternative is the atomic force microscopy (AFM), which can produce versatile data on three-dimensional geometry, size, and other biophysical properties of extracellular vesicles. The developed protocol guides the users in utilizing this analytical tool and outlines the workflow for the analysis of EVs by the AFM, which includes the sample preparation for imaging EVs in hydrated or desiccated form, the electrostatic immobilization of vesicles on a substrate, data acquisition, its analysis, and interpretation. The representative results demonstrate that the fixation of EVs on the modified mica surface is predictable, customizable, and allows the user to obtain sizing results for a large number of vesicles. The vesicle sizing based on the AFM data was found to be consistent with the cryo-TEM imaging.&#160;

A step-by-step procedure is described for label-free immobilization of exosomes and extracellular vesicles from liquid samples and their imaging by atomic force microscopy (AFM). The AFM images are used to estimate the size of the vesicles in the solution and characterize other biophysical properties.&#160;

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Mitochondria and Endoplasmic Reticulum Imaging by Correlative Light and Volume Electron Microscopy

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved structures are folded into various shapes to form a dynamic network depending on the cellular conditions. Visualization of this network between mitochondria and ER has been attempted using super-resolution fluorescence imaging and light microscopy; however, the limited resolution is insufficient to observe the membranes between the mitochondria and ER in detail. Transmission electron microscopy provides good membrane contrast and nanometer-scale resolution for the observation of cellular organelles; however, it is exceptionally time-consuming when assessing the three-dimensional (3D) structure of highly curved organelles. Therefore, we observed the morphology of mitochondria and ER via correlative light-electron microscopy (CLEM) and volume electron microscopy techniques using enhanced ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining. An en bloc staining method, ultrathin serial sectioning (array tomography), and volume electron microscopy were applied to observe the 3D structure. In this protocol, we suggest a combination of CLEM and 3D electron microscopy to perform detailed structural studies of mitochondria and ER.

We present a protocol to study the distribution of mitochondria and endoplasmic reticulum in whole cells after genetic modification using correlative light and volume electron microscopy including ascorbate peroxidase 2 and horseradish peroxidase staining, serial sectioning of cells with and without the target gene in the same section, and serial imaging via electron microscopy.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Cellular organelles, such as mitochondria and endoplasmic reticulum (ER), create a network to perform a variety of functions. These highly curved ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) hydration, mucus viscosity and activity of antimicrobial peptides, key parameters involved in innate defense of the lungs. This is of primary relevance in the field of chronic respiratory diseases such as cystic fibrosis (CF) where these parameters are dysregulated. While different groups have studied ASL pH both in vivo and in vitro, their methods report a relatively wide range of ASL pH values and even contradictory findings regarding any pH differences between non-CF and CF cells. Furthermore, their protocols do not always provide enough details in order to ensure reproducibility, most are low throughput and require expensive equipment or specialized knowledge to implement, making them difficult to establish in most labs. Here we describe a semi-automated fluorescent plate reader assay that enables the real-time measurement of ASL pH under thin film conditions that more closely resemble the in vivo situation. This technique allows for stable measurements for many hours from multiple airway cultures simultaneously and, importantly, dynamic changes in ASL pH in response to agonists and inhibitors can be monitored. To achieve this, the ASL of fully differentiated primary human airway epithelial cells (hAECs) are stained overnight with a pH-sensitive dye in order to allow for the reabsorption of the excess fluid to ensure thin film conditions. After fluorescence is monitored in the presence or absence of agonists, pH calibration is performed in situ to correct for volume and dye concentration. The method described provides the required controls to make stable and reproducible ASL pH measurements, which ultimately could be used as a drug discovery platform for personalized medicine, as well as adapted to other epithelial tissues and experimental conditions, such as inflammatory and/or host-pathogen models.

We present a protocol to make dynamic measurements of the airway surface liquid pH under thin film conditions using a plate-reader.

Primer ınsan hava yolu epitel hücrelerinin hava yolu yüzeyi sıvı pH 'Sı gerçek zamanlı, yarı otomatik floresan ölçümü

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality RNA is often hindered by high starch and sugar content. These compounds can reduce both the yield and the quality of the extracted total RNA. The deterioration in quantity and quality of total RNA can subsequently have a significant impact on the downstream transcriptomic analyses, which may not accurately reflect the spatial and/or temporal variation in the gene expression profile of the samples being tested. In this protocol, we describe an optimized method for extraction of total RNA with sufficient quantity and quality to be used for whole transcriptome analysis of cereal grains. The described method is suitable for several downstream applications used for transcriptomic profiling of developing, germinating, and mature cereal seeds. The method of transcriptome profiling using a microarray platform is shown. This method is specifically designed for gene expression profiling of cereals with described genome sequences. The detailed procedure from microarray handling to final quality control is described. This includes cDNA synthesis, cRNA labelling, microarray hybridization, slide scanning, feature extraction, and data quality validation. The data generated by this method can be used to characterize the transcriptome of cereals during germination, in various stages of grain development, or at different biotic or abiotic stress conditions. The results presented here exemplify high-quality transcriptome data amenable for downstream bioinformatics analyses, such as the determination of differentially expressed genes (DEGs), characterisation of gene regulatory networks, and conducting transcriptome-wide association study (TWAS).

A method for transcriptome profiling of cereals is presented. The microarray-based gene expression profiling starts with the isolation of high-quality total RNA from cereal grains and continues with the generation of cDNA. After cRNA labelling and microarray hybridization, recommendations are given for signal detection and quality control.

Gen Ekspresyonu Profilleme için Modifiye Yöntemi ile Tahıl Tohumlarından Yüksek Kaliteli Transkripsiyon Verilerinin Elde Edilmesi

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ratio and conformational changes of macromolecules and macromolecular complexes. A high quality SAXS dataset for structural modeling must be from monodisperse, homogeneous samples and this is often only reached by a combination of inline chromatography and immediate SAXS measurement. Most commonly, size-exclusion chromatography is used to separate samples and exclude contaminants and aggregations from the particle of interest allowing SAXS measurements to be made from a well-resolved chromatographic peak of a single protein species. Still, in some cases, even inline purification is not a guarantee of monodisperse samples, either because multiple components are too close to each other in size or changes in shape induced through binding alter perceived elution time. In these cases, it may be possible to deconvolute the SAXS data of a mixture to obtain the idealized SAXS curves of individual components. Here, we show how this is achieved and the practical analysis of SEC-SAXS data is performed on ideal and difficult samples. Specifically, we show the SEC-SAXS analysis of the vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

SEC-BioSAXS measurements of biological macromolecules are a standard approach for determining solution structure of macromolecules and their complexes. Here, we analyze SEC-BioSAXS data from two types of commonly encountered SEC traces&#8212;chromatograms with fully resolved and partially resolved peaks. We demonstrate the analysis and deconvolution using scatter and BioXTAS RAW.

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and have the potential to influence the sensitization process either through directly stimulating the immune system or altering the biophysical properties of the allergenic protein. In order to control for these variables, techniques are required for the removal of endogenously bound ligands and, if necessary, replacement with lipids of known composition. The cockroach allergen Bla g 1 encloses a large hydrophobic cavity which binds a heterogeneous mixture of endogenous lipids when purified using traditional techniques. Here, we describe a method through which these lipids are removed using reverse-phase HPLC followed by thermal annealing to yield Bla g 1 in either its Apo-form or reloaded with a user-defined mixture of fatty acid or phospholipid cargoes. Coupling this protocol with biochemical assays reveal that fatty acid cargoes significantly alter the thermostability and proteolytic resistance of Bla g 1, with downstream implications for the rate of T-cell epitope generation and allergenicity. These results highlight the importance of lipid removal/reloading protocols such as the one described herein when studying allergens from both recombinant and natural sources. The protocol is generalizable to other allergen families including lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) and Uteroglobin (Fel d 1), providing a valuable tool to study the role of lipids in the allergic response.

This protocol describes the removal of endogenous lipids from allergens, and their replacement with user-specified ligands through reverse-phase HPLC coupled with thermal annealing. 31P-NMR and circular dichroism allow for the rapid confirmation of ligand removal/loading, and the recovery of native allergen structure.

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...