We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparación de las larvas <ol><li> Una semana antes de grabar el comportamiento, configure una cruz (mínimo de 25 vírgenes y 5 machos). Mantener todos los cruces y la progenie a 25 ° C. NOTA: La temperatura de las condiciones de cultivo puede ser alterado, pero tendría que ser ajustado para tener en cuenta los cambios en la velocidad del desarrollo de la línea de tiempo se describe a continuación. </li><li> 5 días antes de la grabación, a primera hora de la mañana, colocar la cruz en una jaula de recogida con una cápsula de agar / jugo y un lenguado (0,5-1 ml) de pasta de levadura en el centro de la tapa de agar / jugo. <ol><li> Para hacer una jaula de recogida, hacer agujeros en un 6 oz. polietileno cuadrada botella de Drosophila. </li><li> Para hacer que las tapas agar / jugo, mezclar 18 g de agar con 600 ml de agua en un matraz cónico. En un matraz de mezcla 20 g de sacarosa por separado con jugo de manzana 200 ml. Microondas hasta que los sólidos se disuelven. Combinar y agitar, permitiendo mezcla se enfríe a 60 ° C. Añadir 20 ml de 10% de metil-p-hidroxibenzoato de etanol al 95% y se agita. Añadir 7 ~ml a la media parte inferior de una placa de Petri redonda 35 x 10 mm. Permitir agar / jugo se solidifique durante 1 hora a RT. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Para hacer la pasta de levadura, añadir partes iguales por volumen de levadura seca y el agua. Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Comprobar el estado de las colecciones de larvas. <ol><li> Por la mañana, 4 y 3 días antes de la grabación, retire la tapa y coloque una tapa fresca en la jaula. Cambiar las tapas al mismo tiempo cada día para conseguir una colección de 24 horas de los huevos y larvas recién eclosionadas. </li><li> Después se retira cada tapa, examinarlo para ver cuántos huevos la cruz está sentando. Esperar entre 500-2.000 huevos. Ajustar el número de adultos, si es necesario. NOTA: Algunas huevos deberían haber eclosionado en larvas, y las larvas recién nacida se encuentran lejos de la pasta de levadura. </li><li> Envejecer cada tapa durante 24 horas. Volver a examinar la tapa para determinar si las larvas son saludables. NOTA: La mayoría de los huevos deben han eclosionado en larvas, y las larvas deberían haber metido en la ospasta de AST. Los signos de mala salud incluyen un gran número de huevos sin eclosionar, los cuerpos de larvas muertas de distancia de la pasta de levadura, y las larvas con importantes manchas oscuras en el abdomen, lo que indica una reacción inmune. Si las larvas no son saludables, cambiar la jaula, hacer tapas frescas / pasta de levadura, y comprobar el genotipo. </li><li> Desechar las viejas tapas. </li></ol></li><li> Recoger las larvas para las grabaciones de comportamiento. <ol><li> En ambos 2 y 1 día antes de la grabación, retire la tapa y reemplazar con una tapa fresca. </li><li> Etiqueta de cada tapa retirada y mantener a 25 ° C. Esto producirá una serie de etapas de larvas para las grabaciones de comportamiento. Las larvas recién nacidas de (0-4 hr después de la eclosión) a través de segundo instar (24-48 hr después de la eclosión) se puede utilizar en los canales. Guarde los casquillos para las grabaciones en días consecutivos. </li><li> Deseche todos los tapones después de 48 horas. </li><li> Si es necesario, repita los pasos 1.4.1-1.4.3 para un máximo de 5 d adicional. Después de que menos producen huevos fertilizados. </li></ol></li></ol><ol><li> Preparar el PDMS canal lineal (polidimetilsiloxano, un elastómero de silicona) molde de fundición (Figura 1A). PDMS moldes de fundición están disponibles en el laboratorio de Heckscher bajo petición. <ol><li> Limpiar el molde de fundición con alcohol isopropílico. Deje secar al aire, séquelo con toallitas de laboratorio, o usar aire comprimido. </li><li> Colocar el molde de colada en un Petri tapa 10 cm plato u otro recipiente. </li></ol></li><li> Preparar y verter solución de agarosa. <ol><li> Hacer una solución 3% de agarosa en agua (3 g en 100 ml) en el microondas hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Enfriar a 55 ° C, lo que permite burbujas suban a la superficie. </li><li> Verter la mezcla de agarosa en la placa de Petri que contiene el molde de colada de manera que el molde quede cubierto. Deje conjunto de agarosa hasta que se solidifique. </li></ol></li><li> Quitar los canales de agarosa a partir del molde de fundición. Recortar los bordes del disco de agarosa con una hoja de afeitar. <ol><li> Ponga el canals en un plato de 10 cm Petri sumergido en agua. Se pueden conservar a 4 ° C durante 7 días. </li></ol></li></ol> 3. Carga de una larva en un canal de Comportamiento Registro NOTA: Si la memorización de canales a 4 ° C, permiten que los canales que alcanzara la temperatura ambiente antes de usar para la grabación del comportamiento. <ol><li> Utilice una hoja de afeitar limpia para cortar un único canal de los preparado en la Etapa 2 (Figura 2A). </li><li> Use un par de pinzas para colocar el canal ranurado de lado sobre un cubreobjetos de vidrio (Figura 2B). El tamaño y el grosor del cubreobjetos depende del alcance específico utilizado para la imagen. </li><li> Utilice unas pinzas finas para seleccionar una larva de la tapa de agar / jugo preparado en el Paso 1 y el lugar en el canal de corte (Figura 2C). <ol><li> No apriete la larva. Recogerlo suavemente con la punta del diente fórceps. También es posible manipular larva con un pincel con una punta fina. NOTA: Esto es importante ya que las larvas son muy sensitive al tacto. Si no se manejan con cuidado, las respuestas nociceptivas pueden dominar su comportamiento durante los primeros segundos del experimento. </li><li> Lavar las larvas sumergiendo brevemente en agua. </li><li> Después de colocar la larva en el canal de corte, utilice la punta del diente fórceps para burlarse suavemente la larva en el bosque de canal. NOTA: Para la mayoría de las aplicaciones de la anchura de la larva y la anchura del canal deben coincidir. La anchura media de larvas en diferentes etapas de desarrollo de la siguiente manera: 0 horas después de la eclosión - 140 micras, 24 horas después de la eclosión - 180 micras, 48 horas después de la eclosión - 320 micras, 72 horas después de la eclosión - 500 micras, 96 horas después de la eclosión - 750 micras 8. Los canales vienen en los siguientes anchos: 100, 150, 200, 250, y 300 micras, y todos los canales son 150 micras de profundidad. </li><li> Use la punta de un diente con fórceps o un pincel para ajustar la posición de la larva dentro del canal. Se puede orientarse en cualquier dirección: ventralarriba, abajo ventral, ventral a un lado, dependiendo de lo que es la estructura a explorar. </li></ol></li><li> Con unas pinzas, mueva suavemente sobre el canal de tal manera que la larva se encuentra ahora en la cubierta de vidrio. Coloque una o dos gotas de agua en los extremos del canal para que se llena de agua (Figura 2D). <ol><li> levantar suavemente los lados del canal para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Ajustar la orientación de la larva. Para ello, empujar suavemente el canal pero no el vidrio de cubierta para rodar la larva. Si esto no cambia la orientación, retire la cubierta de vidrio y ajustar la posición de las larvas. La larva está listo para ser fotografiado. </li><li> Image el canal / cubreobjetos en un microscopio invertido. Si las imágenes en un microscopio vertical, sólo tiene que invertir el canal / cubreobjetos. </li></ol></li></ol> 4. Medir característica de interés en la grabación del Comportamiento <ol><li> Para una estructura de interés (por ejemplo, cola, CNS), mida una característica de interés (por ejemplo,, La intensidad de fluorescencia, la ubicación) con el tiempo. NOTA: Estructuras tales como la cabeza y la cola se pueden anotar manualmente. Por ejemplo, la cabeza puede ser identificado como que contiene ganchos de la boca en forma de H oscuros, y la cola puede ser identificado como que contiene spiricles traqueal posterior. Este documento se centra en el cordón nervioso. Utilice la línea de GAL4 neuronal elav-GAL4 para conducir un transgén UAS-MYR-GFP (elav&gt; GFP) 9,10 para etiquetar de manera fluorescente del sistema nervioso central (SNC). El SNC contiene dos lóbulos del cerebro anterior conectado al cable de nervio, que se extiende a la parte posterior (Figura 3). </li><li> Medir la intensidad de los píxeles de la cordón nervioso (f (NC)) en cada punto de tiempo (t). A continuación se describe un método manual de anotación, pero este paso podría ser automatizado. <ol><li> En Fiji (o software similar) en el menú &quot;Analizar&quot; utilizar el &quot;conjunto Mediciones ...&quot; cuadro de diálogo para informar el valor de gris medio y SLICposición e. </li><li> Extraer manualmente una caja en el centro del cordón nervioso en el primer fotograma de la película (Figura 3). Este paso también podría automatizarse con segmentación de imágenes y algoritmos de registro. </li><li> Utilice el comando &quot;medida&quot; en el menú &quot;Analizar&quot; para informar de la intensidad media de píxeles en la región en caja de interés. Esto genera una ventana &quot;Resultados&quot;. </li><li> En el siguiente cuadro, vuelva a colocar manualmente el cuadro sin cambiar el tamaño mediante el uso de las teclas de flecha. Utilice el comando &quot;medida&quot; de nuevo. Los resultados actualizados se muestran en la &quot;Resultados&quot; de la ventana. Repita este paso para cada trama de intereses. </li><li> Guarde los &quot;Resultados&quot; utilizando la opción &#39;Guardar como ...&#39; comando desde el menú Archivo. Los resultados se pueden exportar como un archivo .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analizar las mediciones <ol><li> Normalizar cada f (NC) valor a un valor entre 0 y 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> En la hoja de cálculo (u otro programa), abra el archivo Results.xls. Este archivo tendrá dos columnas que representan número de cuadro y la intensidad media de fluorescencia. </li><li> Hacer una nueva columna y utilice la fórmula z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) para generar un valor de fluorescencia normalizada correspondiente a cada punto de tiempo. </li></ol></li><li> Determinar el período de paso para cada paso en la grabación. NOTA: Un ciclo de zancada es la unidad de movimiento repetitivo de todo el cuerpo para adelante (y revertir) el rastreo. Por convención se inicia un delantero del paso grande (y termina) con el movimiento de avance de la cola, la cabeza, y otros órganos internos tales como el intestino o el sistema nervioso central 1. <ol><li> Inspeccionar manualmente la grabación del comportamiento y registrar los tiempos de iniciación (i) de cada paso (i (Stride Ciclo [n])). NOTA: En el siguiente ejemplo, el movimiento hacia adelantedel sistema nervioso central como se utilizó el inicio de un ciclo de paso (Figura 3). </li><li> Por cada paso que calcular el periodo: Δ t (ciclo de zancada) = i (Stride Ciclo [n + 1]) -i (Stride Ciclo [n]). </li></ol></li><li> Calcular el porcentaje de ciclo de zancada transcurrido para cada punto de la grabación del tiempo. <ol><li> Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el tiempo transcurrido desde el inicio de un ciclo de paso (c). Tiempo establecido desde el inicio paso a cero al inicio de cada paso (c (Stride Ciclo [n]) = 0). Ajuste veces después de la iniciación en consecuencia. </li><li> Hacer una columna adicional en el archivo de hoja de cálculo que representa el ciclo ciento zancada transcurrido (ciclo de zancada%) Dividir tiempos ajustados por el período de zancada y se multiplica por 100 para convertir a porcentaje de ciclo de zancada transcurrido:. Ciclo% zancada = (c (Stride Ciclo [n] )) / (Δ t (Ciclo de zancada) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Generar coordenadas polares Parcelas para representar dinámica de las estructuras de interés durante el ciclo de rastreo <ol><li> En MATLAB, utilice el diálogo &quot;Importar datos&quot; en la pestaña Inicio para importar el Results.xls actualizada. </li><li> Hacer una nueva matriz &quot;Theta&quot; valores del ciclo de zancada que contiene ciento (% ciclo de zancada). ( &quot;Theta = Var1&quot; donde Var1 representa ciclo de zancada%). </li><li> Hacer una nueva matriz &quot;Rho&quot; contiene los valores de fluorescencia normalizados (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; donde Var2 representa z (t)). </li><li> Utilice el comando &#39;PolarPlot&#39; para hacer de coordenadas polares parcelas con el ciclo ciento zancada como el ángulo, y la fluorescencia como el radio ( &quot;PolarPlot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

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	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un dispositivo de microfluidos se construyó para hacer canales de agarosa lineales que pueden alojar las larvas de Drosophila (Figura 1). Cuando las larvas de Drosophila se colocan en estos canales de agarosa lineales su repertorio de comportamiento se limita a rastreo, que permite la observación detallada de la dinámica de estructuras de larvas durante el ciclo de rastreo. Una grabación exitosa ocurre cuando una larva de realizar una ...

El objetivo general de este método es el estudio de Drosophila rastreo de larvas en detalle. Los experimentos sobre la locomoción han jugado un papel importante en el desarrollo y prueba las teorías sobre el control del motor 2. Tradicionalmente se ha estudiado la locomoción de los animales acuáticos (por ejemplo, sanguijuela, lamprea, renacuajo) 3. La naturaleza repetitiva de la locomoción en estos animales ha permitido el estudio de rhythmogenesis, para el análisis de los eventos biofísicos locomoción de conducción, y para el seguimiento de los patrones de activación neural que acompañan a la locomoción. El uso de las larvas de Drosophila para los estudios de locomoción presenta una combinación única de ventajas sobre otros sistemas de modelos: genética Facile, desarrollo bien caracterizado, un cuerpo que es ópticamente claro en estadios primero y segundo, y una reconstrucción microscópico electrónico de transmisión en curso de la entera 4-6 sistema nervioso. Sin embargo, Drosophila larval locoel movimiento en superficies planas abiertas es algo complejo que incluye pausas, giros y meandros arrastra 7. Esta publicación presenta un método para utilizar canales de agarosa lineales para guiar el comportamiento locomotor Drosophila larvas de tal manera que las larvas Realizar sostenida, el comportamiento de rastreo rítmica recta. El estudio de comportamiento de las larvas de Drosophila en los canales de agarosa, en lugar de comportamiento en superficies planas abiertas, tiene varias ventajas. En primer lugar, permite a los investigadores para seleccionar específicamente el comportamiento de rastreo de los muchos movimientos que forman parte del repertorio del comportamiento de las larvas. En segundo lugar, mediante el ajuste de la anchura del canal en comparación con el tamaño del cuerpo de las larvas, la velocidad de rastreo se puede ajustar. En tercer lugar, los canales permiten la larva a ser vista desde dorsal, ventral, o en el lado lateral en función de cómo se carga el larva y orientada dentro del canal. Esta versatilidad en la orientación de las larvas permite que cualquier estructura de interés que estar continuamente visibles durante el rastreo. Cuarto,canales son susceptibles para su uso con una amplia variedad de microscopios y objetivos. Por ejemplo, los canales lineales pueden ser utilizados para formación de imágenes de baja resolución en estereoscopios de campo brillante y / o de imágenes de alta resolución en la hilatura de discos microscopios confocales 1. En quinto lugar, este método se puede utilizar en combinación con manipulaciones neuronales optogenética / thermogenetic en cualquier fondo genético. Por último, debido a que tanto el cuerpo de las larvas (en estadios primera y segunda) y los canales de agarosa son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar en el estudio de los movimientos dinámicos, o cambios en la intensidad de fluorescencia de las estructuras de larvas etiquetados por sondas fluorescentes codificadas genéticamente. El método descrito es apropiado para estudios detallados de cinemáticas primera y segunda instar Drosophila comportamiento de las larvas. Esta publicación analiza los cambios dinámicos en la intensidad fluorescente de la CNS durante el rastreo larval hacia adelante para demostrar el uso de los canales y como un precursor de neuRonal imágenes de calcio.

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila rastreo de las larvas se está convirtiendo en un poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta sensoriomotriz. Sin embargo, el comportamiento de rastreo de larvas en las superficies planas abiertas es complejo, incluyendo: hacer una pausa, girando, y meandros. Esta complejidad en el repertorio de movimiento dificulta el análisis detallado de los acontecimientos que ocurren durante un solo ciclo de rastreo zancada. Para superar este obstáculo, se hicieron canales de agarosa lineales que limitan el comportamiento de las larvas al sostenida, arrastre de la recta, rítmica. En principio, porque los canales de agarosa y el cuerpo de la larva de Drosophila son tanto ópticamente transparente, el movimiento de las estructuras de larvas marcadas por las sondas fluorescentes codificadas genéticamente se puede controlar en, las larvas se mueven libremente intacta. En el pasado, las larvas se colocaron en canales lineales y arrastrándose a nivel de todo el organismo, segmento, y el músculo se analizaron 1. En el futuro, las larvas que se arrastra en los canales se puede utilizar para imágenes de calcio para controlar neurola actividad final. Además, estos métodos se pueden utilizar con larvas de cualquier genotipo y con cualquier canal investigador-diseñado. Así, el protocolo se presenta a continuación es ampliamente aplicable para los estudios que utilizan la larva de Drosophila como un modelo para comprender el control motor.

Este artículo describe un método para guiar el comportamiento de las larvas de Drosophila utilizando canales de agarosa y para medir la dinámica de estructuras de larvas en un ciclo de rastreo. Las larvas en los canales lineales realizar combates sostenidos de rastreo rítmica (Figura 3). Debido a que tanto las larvas y los canales son ópticamente claro, los canales se pueden utilizar con larvas expresar sondas fluorescentes expresados ​​en cualquier est...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo.

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamiento de las larvas de arrastre

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K vistas.  University of Chicago.  La larva de Drosophila es un sistema poderoso modelo para estudiar el control neural de la conducta. Esta publicación describe el uso de canales lineales de agarosa para provocar combates sostenidos de rastreo y métodos lineales para cuantificar la dinámica de las estructuras de larvas durante el rastreo comportamiento repetitivo. 

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Investigación

Biología

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioingeniería

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurociencias

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamiento

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Una técnica simple para evaluar la actividad locomotora en Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Las larvas

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www.jove.com/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

Seguimiento de moscas que caminan libremente: un método para evaluar la locomoción en Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

Uso de los canales lineales de agarosa para estudiar

Resumen

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Capítulos en este video

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Análisis funcional del circuito de alimentación de las larvas en Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Una técnica simple para evaluar la actividad locomotora en Drosophila

Forrajeo Protocolo Ruta de longitud de

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

Seguimiento de moscas que caminan libremente: un método para evaluar la locomoción en Drosophila