Usando el ensayo de punto de luz, el comportamiento de las larvas se puede rastrear antes, durante y después de entrar en el área de luz permitiendo analizar el detalle del movimiento larval. Este ensayo es simple y fácil de realizar. La respuesta de la luz se prueba una sola vez, de modo que cualquier posible efecto de adaptación de la luz puede ser excluido.
Para preparar las placas de agar, cubra lenta y uniformemente la parte inferior de una placa petri de 15 centímetros con una capa de aproximadamente cuatro milímetros de espesor de 1% de agar caliente. Deje que la placa se enfríe a temperatura ambiente hasta que el agar se haya solidificado. Para configurar el sistema de estimulación visual, sujete una fuente de luz LED preparada en un marco de hierro, teniendo cuidado de que la luz se proyecta hacia el escritorio.
Incline ligeramente el cilindro hasta que el ángulo entre el plano del cilindro y el plano vertical sea de unos 10 grados. Conecte la luz LED azul de 470 nanómetros al LED un enchufe del controlador LED de alta potencia y encienda el controlador. Gire la perilla en la esquina superior derecha del controlador para seleccionar el canal 470 nanómetros y haga clic en LED.
Cuando la pantalla muestra una comprobación, aparecerá un punto de luz azul en el escritorio. Haga clic en Aceptar y gire la perilla para ajustar la intensidad de la luz. Mueva la posición de la fuente de luz hacia arriba y hacia abajo para ajustar el diámetro del punto de luz a dos centímetros.
Gire el mando para seleccionar la intensidad de la luz de acuerdo con los requisitos experimentales. Utilice una consola de medidor de potencia compacta con un sensor de potencia de diodo fotográfico estándar para medir la potencia máxima y mínima de la luz en el lugar. La potencia lumída necesita medirse en la oscuridad en el experimento real.
A continuación, registre la potencia de la luz, mida tres veces y utilice el valor promedio. Para configurar el sistema de imaginación, sujete una cámara web de alta resolución con un clip de hierro unos 10 centímetros por encima del punto de luz en el escritorio y ajuste la orientación de la lente de la cámara hacia el escritorio. Conecte la cámara a un ordenador con Windows 7 a través de una interfaz USB y coloque la placa de agar en el escritorio justo debajo de la cámara.
Abra el software AMCap 9.22, el punto de luz se mostrará automáticamente en la ventana AMCap. Mueva la cámara ligeramente a la izquierda o a la derecha para asegurarse de que el punto de luz está cerca del centro de la ventana. Utilice un clip para fijar un filtro de paso de banda de 850 más o menos tres nanómetros a cinco a siete milímetros inmediatamente debajo de la cámara.
Coloque tres LED de generación de luz infrarroja con una longitud de onda central de 850 nanómetros uniformemente alrededor de la placa de agar a unos cinco centímetros del borde de la placa y con lentes LED en un ángulo de 70 grados orientado hacia la placa. A continuación, conecte los LED a una fuente de alimentación a través de sus convertidores de CA a CC. En el menú del software AMCap, seleccione las opciones, el dispositivo de vídeo y el formato de captura y establezca el tamaño de píxel del vídeo capturado en 800 por 600 y la velocidad de fotogramas en 60 fotogramas por segundo.
Retire el filtro y coloque una regla debajo de la cámara. Ajuste el enfoque de la cámara hasta que la línea de escala esté clara y paralela al ancho del campo de visión de vídeo y haga clic en captura, configuración y captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado. A continuación, haga clic en Iniciar grabación para grabar la distancia real correspondiente a 600 píxeles y calcular la relación de cada píxel con la distancia real.
Antes de introducir la larva en la configuración de imágenes, adquiera un video corto de la posición de la luz y nombre el área de luz de vídeo de fondo de control sin filtrar uno. Coloque el filtro de nuevo en la lente de la cámara y encienda una luz lejos del dispositivo experimental a un ajuste lo más bajo posible mientras permite observar claramente las larvas. Use una cuchara para eliminar algunas larvas del medio de cultivo y seleccione suavemente una larva de tercera estrella.
Lave la larva en agua destilada y coloque la larva en el centro de la placa de agar. Retire suavemente el exceso de agua de la larva y apague la luz de la habitación. Deje que la larva se aclimate durante dos minutos en el ambiente oscuro antes de encender la luz LED infrarroja.
El siguiente experimento de comportamiento de evitación de la luz debe llevarse a cabo en la oscuridad. Para la comodidad de la demostración filmamos con la luz brillante. Cepille suavemente la larva hasta el centro de la placa.
Cuando la larva comience a gatear recta, gire la placa para hacer que la larva se dirija hacia el punto de luz. Haga clic en captura, configuración y captura de vídeo para seleccionar la ruta de guardado y haga clic en Iniciar grabación para grabar. Permita que la larva se arrastre hacia, entre y salga del punto de luz hasta que esté casi fuera del campo de visión y haga clic en Detener grabación.
Aleje el filtro de la cámara y adquiera un vídeo corto de la posición del punto de luz. A continuación, asigne al campo el nombre el área de luz de vídeo sin filtrar del ensayo y compare este vídeo con el área de luz de un vídeo para asegurarse de que no se cambia la posición del punto de luz. Aquí, se pueden observar curvas de tiempo de la velocidad de la cola, ángulo de flexión del cuerpo y velocidad angular de la flexión del cuerpo de una larva representativa.
El tamaño de la cabeza larvaria fundida y, por lo tanto, el ángulo máximo de flexión del cuerpo se reduce significativamente en larvas de tercera estrella con neuronas octopaminerérgicas inhibidas por la expresión tóxica del tétanos en comparación con los controles parentales que indican que las neuronas Tdc2-Gal4 son necesarias para una respuesta normal a la luz larval. Para un procesamiento de imagen correcto, asegúrese de que la cámara no bloquee la luz y de que el punto de luz sea redondo y cerca del centro de la ventana. Después de este procedimiento, se puede realizar optogenética para observar cómo reaccionan las larvas cuando se activan neuronas específicas.
Usando este ensayo, los detalles del movimiento larval pueden ser analizados permitiendo estudiar el impacto lejano del medio ambiente y de los factores internos en el comportamiento de evitación de la luz larval.
