We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

幼虫の調製<ol><li>一週間の行動を記録する前に、クロス（25処女と5人の男性の最小値）を設定します。 25℃でのすべての十字架と子孫を維持します。 注：培養条件の温度を変更することができるが、以下に記載のタイムラインは、発生速度の変化を考慮して調整される必要があります。 </li><li> 5日午前中に、最初のものを記録する前に、寒天/ジュースキャップおよび寒天/ジュースキャップの中央に酵母ペーストのDAB（0.5〜ml）で収集ケージにクロスを配置します。 <ol><li>コレクションケージを作成するには、6オンスに穴を突きます。正方形のポリエチレンショウジョウバエボトル 。 </li><li>寒天/ジュースキャップを作るために、三角フラスコに600ミリリットルの水で寒天の18グラムを混ぜます。 200ミリリットルのリンゴジュースを持つ別のフラスコミックス20グラムのスクロース中。固形物が溶解するまで電子レンジ。混合物を60℃に冷却し、合わせ、撹拌します。 95％エタノール20ml中の10％メチル-p-ヒドロキシ安息香を追加し、攪拌します。追加〜735×10ミリメートルラウンドペトリ皿の下半分にミリリットル。寒天/ジュースはRTで1時間固化することができます。 4℃で保存。 </li><li>酵母ペーストを作るために、ボリューム乾燥酵母と水によって等しい部分を追加します。 4℃で保存。 </li></ol></li><li> 幼虫コレクションの正常性を確認してください。 <ol><li>午前中、4日および3日記録する前に、キャップを取り外し、ケージの新鮮なキャップを配置します。 24時間の卵の収集と孵化幼虫を得るために、毎日同じ時刻にキャップを変更します。 </li><li>各キャップを除去した後、クロスが敷設されているどのように多くの卵を参照することを確認します。 500〜2,000の卵の間で期待しています。必要に応じて、大人の数を調整します。 注：いくつかの卵が幼虫に孵化している必要があり、新たに孵化した幼虫は、離れた酵母ペーストから発見されます。 </li><li> 24時間ごとのキャップを熟成。幼虫が健康であるかどうかを判断するためのキャップを再検討します。 注：ほとんどの卵が幼虫に孵化しているはず、と幼虫はあなたがたの中にクロールしている必要がありますASTペースト。体調不良の兆候は、免疫反応を示し、未孵化卵、離れた酵母ペーストから死んだ幼虫の体、および腹部の大幅な暗いパッチを適用した幼虫が多数含まれています。幼虫はケージを変更し、不健康な場合は、新鮮なキャップ/酵母ペーストを行い、遺伝子型を確認してください。 </li><li>古いキャップを廃棄します。 </li></ol></li><li> 行動の記録のための幼虫を収集します。 <ol><li>記録前の2と1日の両方で、キャップを除去し、新鮮なキャップと交換します。 </li><li>各削除キャップにラベルを付け、25℃で維持します。これは、行動の記録のための幼虫の段階的なシリーズを生成します。孵化したばかりの（0-4時間の孵化後）からの第二齢（24〜48時間の孵化後）から幼虫がチャネルで使用することができます。連日記録のためのキャップを保存します。 </li><li> 48時間後にすべてのキャップを捨てます。 </li><li>必要に応じて、最大5追加日間1.4.1-1.4.3手順を繰り返します。その少数の受精卵後に生成されます。 </li></ol></li></ol><ol><li>リニアチャネルPDMS（ポリジメチルシロキサン、シリコーンエラストマー）鋳型（ 図1A）を準備します。金型を鋳造PDMSは、要求に応じてヘクシャーラボから入手可能です。 <ol><li>イソプロピルアルコールで鋳型をきれいにしてください。空気乾燥、DAB実験用ワイプで乾燥、または缶詰空気を使用しています。 </li><li> 10センチメートルシャーレのふたまたは他の容器に鋳型を配置します。 </li></ol></li><li> 準備し、アガロース溶液を注ぎます。 <ol><li>完全に溶解するまで電子レンジ加熱することにより、水中の3％アガロース溶液（100ミリリットルで3グラム）を作成します。 </li><li>気泡が表面に上昇させ、55℃に冷却します。 </li><li>金型がちょうど覆われるように、鋳型を含むペトリ皿にアガロースの混合物を注ぎます。固化するまで、アガロースセットをしてみましょう。 </li></ol></li><li>鋳型からアガロースチャンネルを削除します。かみそりの刃でアガロースディスクの縁をトリミングします。 <ol><li>チャネルを入れて水に浸漬し10センチメートルペトリ皿中の。これらは、7日間、4℃で保持することができます。 </li></ol></li></ol>レコード行動にチャンネルに幼虫のロード3 注：4°Cでのチャンネルを保存する場合は、チャンネルは行動記録のために使用する前に室温に来ることができます。 <ol><li>ステップ2（ 図2A）で製造されたものから単一のチャネルを切断するためにきれいなカミソリの刃を使用してください。 </li><li>カバーガラス（ 図2B）のチャンネル溝の側を上向きにして配置するためにピンセットを使用してください。カバーガラスの大きさや厚さは、イメージングのために使用される特定の範囲に依存します。 </li><li>ステップ1で調製した寒天/ジュースキャップから幼虫を選択して、切断されたチャネル（ 図2C）に配置するために微細な鉗子を使用してください。 <ol><li>幼虫を圧迫しないでください。鉗子の歯の先端で穏やかにそれを拾います。細かい点で絵筆で幼虫を操作することも可能です。 注：幼虫は非常に銭であるため、これは重要です触れてsitive。彼らは注意して取り扱われていない場合、侵害受容応答は、実験の最初の数秒の間に彼らの行動を支配する可能性があります。 </li><li>簡単に水に沈めることによって幼虫を洗ってください。 </li><li>カットチャネルに幼虫を配置した後、軽くチャネルの木立の中に幼虫をいじめるために鉗子タインの先端を使用します。 注：ほとんどのアプリケーションでは幼虫の幅とチャネルの幅が一致している必要があります。開発のさまざまな段階での幼生の平均幅は次のとおりです。0時間の孵化後- 140μmで、24時間の孵化後- 180μmで、48時間の孵化後- 320μmで、72時間の孵化後- 500ミクロン、96時間孵化後- 750μmの8。以下の幅で来るチャンネル：100、150、200、250、および300μmであり、すべてのチャネルが150μmの深さ。 </li><li>チャネル内の幼虫の位置を調整するために鉗子タインや絵筆の先端を使用してください。これは、任意の方向に配向させることができる。腹画像化されるべきもの構造に応じて、一方の側に、腹、腹上下。 </li></ol></li><li>鉗子を使用して、そっと幼虫はカバーガラス上に今あるようなの上にチャネルを反転させます。それは水（ 図2D）で満たすようにチャネルの両端に水の1または2滴を置きます。 <ol><li>静かに気泡を除去するために、チャネルの側面を持ち上げます。 </li><li>幼虫の向きを調整します。これを行うには、そっと幼虫をロールバックするチャネルではなく、カバーガラスを微調整。これは向きを変更しない場合は、カバーガラスを削除し、幼虫の位置を調整します。幼虫は、画像化する準備ができました。 </li><li>画像倒立顕微鏡上のチャネル/カバースリップ。正立顕微鏡でのイメージング場合は、単にチャンネル/カバースリップを反転。 </li></ol></li></ol>行動記録への関心の4測定機能<ol><li>関心のある構造（ 例えば 、尾、CNS）の場合は、 例えば （関心のある特徴を測定します経時的な蛍光強度、場所）。 注：このような頭と尾のような構造を手動で注釈を付けることができます。例えば、ヘッドは濃いH状口フックを含むものとして識別することができ、そして尾部は後部気管spiriclesを含むものとして同定することができます。本稿では神経索に焦点を当てています。蛍光中枢神経系（CNS）をラベルするためにUAS-MYR-GFP導入遺伝子（ELAV&gt; GFP）9,10を駆動するために神経GAL4ラインELAV-GAL4を使用してください。 CNSは、後方（ 図3）にまで及ぶ神経索に取り付けられた2つの前方脳ローブが含まれています。 </li><li>各時点（T）での神経索（F（NC））の画素の強度を測定します。以下の手動注釈のアプローチを説明していますが、この手順を自動化することができました。 <ol><li>フィジー（または類似のソフトウェア）の「分析」メニュー内の平均グレー値とSLICを報告するために、「測定の設定...」ダイアログボックスを使用します電子位置。 </li><li>手動映画（ 図3）の最初のフレームにおける神経索の中央にボックスを描画します。このステップは、画像セグメンテーションと登録アルゴリズムで自動化することができました。 </li><li>関心の箱入りの領域における平均画素強度を報告するために「分析」メニューの「測定」コマンドを使用します。これは、「結果」ウィンドウを生成します。 </li><li>次のフレームでは、手動で矢印キーを使用してサイズ変更することなく、ボックスを再配置します。再び「メジャー」コマンドを使用します。更新された結果は、「結果」ウィンドウに表示されます。関心の各フレームに対して、この手順を繰り返します。 </li><li>ファイルメニューから「結果」は、「名前を付けて保存...」を使用してコマンドを保存します。結果は、.xlsファイルとしてエクスポートされます。 </li></ol></li></ol> 5.測定値を分析<ol><li> 0及び1（Z（t）の間の値にそれぞれFを（NC）の値を正規化&lt;/ em&gt;の）。 <ol><li>スプレッドシート（​​または他のプログラム）では、Results.xlsファイルを開きます。このファイルには、フレーム番号および平均蛍光強度を表す2つの列があります。 </li><li>新しい列を作成し、式Z（t）は正規化された蛍光値を生成する（[NC] F）は、f（NC [トン]）-min（F [NC]）/最大（F [NC]）-min =を使用各時点に対応します。 </li></ol></li><li> 記録の各ストライドのためのストライド期間を決定します。 注：ストライドサイクルは前進のための反復的な全身運動の単位です（リバース）クロール。慣例により、このような腸やCNS 1と尾、頭、および他の内臓の前方への移動と前方ストライド開始（および終了）。 <ol><li>手動で各ストライドの開始時間（i）を行動記録を検査し、記録する（I（ストライドサイクル[N]））。 注：以下の例では、前方への移動CNSの歩幅サイクルの開始（ 図3）を用いました。 </li><li>各ストライドのための期間を計算する：Δはトン（ストライドサイクル）= I（ストライドサイクル[N + 1]）-i（ ストライドサイクル[N]）。 </li></ol></li><li> 記録の各時点での経過ストライドサイクルの割合を計算します。 <ol><li>ストライドサイクル（C）の開始からの経過時間を表すスプレッドシートファイルに追加の列を作ります。設定した時間、各ストライドの開始時にゼロにストライド開始以来（C（ストライドサイクル[N]）= 0）。それに応じて開始後の時間を調整します。 </li><li>経過経過％のストライド・サイクル（％ストライドサイクル）を表すスプレッドシートファイルに追加の列を作るストライド期間によって調整された時間を分割し、ストライドサイクルのパーセンテージに変換するために100を掛け：％ストライドサイクル =（C（ストライドサイクル[n]を））/（Δtの（ストライドサイクル）* 100）。 </li></ol></li></ol> 6.ポーラーを生成クロールサイクルにわたって利息の構造のダイナミクスを表現するためにプロット座標<ol><li> MATLABでは、更新Results.xlsをインポートするには、[ホーム]タブの[データのインポート」ダイアログを使用します。 </li><li>パーセントストライドサイクル値（％ストライドサイクル）を含む新しい配列「シータ」を作ります。 （var1が％ストライドサイクルを表す「シータ= VAR1 &quot;）。 </li><li>新しいアレイ「ロー」を作る正規化された蛍光値（Z（t）を ）が含まれています。 （VAR2は、z（t）を表し、「ロー= VAR2」）。 </li><li>角度パーセントストライドサイクル、および半径（「polarplot（シータ、ロー）」）としての蛍光と極座標プロットを作るために「polarplot &#39;コマンドを使用します。 </li></ol>

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	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

マイクロ流体デバイスは、 ショウジョウバエの幼虫（ 図1）を収容することができるリニアアガロースチャンネルを作るために建てられました。 ショウジョウバエの幼虫は、これらの線形アガロースのチャネル内に配置されている場合、それらの行動レパートリーは、クロールサイクルにわたる幼虫構造のダイナミクスの詳細な観察を可能にする、クロールに限定?...

この方法の全体的な目標は、具体的にショウジョウバエの幼虫のクロールを研究することです。運動の実験は、モータ制御2上の理論を開発およびテストに重要な役割を果たしてきました。伝統的に運動は、水生動物（ 例えば 、リーチ、ヤツメウナギ、オタマジャクシ）3で検討されています。これらの動物における歩行運動の反復性は、歩行運動を駆動する生物物理学的事象の分析のための、および移動を伴う神経発火パターンを監視するため、rhythmogenesisの研究を可能にしました。 容易な遺伝学、よく特徴付け開発、第一および第二齢で光学的に透明で本体と、全体の継続的な透過型電子顕微鏡再建：運動の研究のためのショウジョウバエの幼虫の使用は、他のモデル系に勝る利点のユニークな組み合わせを提示します神経系4-6。しかし、 ショウジョウバエの幼虫のロコフラットオープン表面上の動きが、ポーズを含めやや複雑ですなり、蛇行は7をクロールします。このマニュアルでは、幼虫が持続的な、ストレート、リズミカルなクロールの動作を実行するように、ショウジョウバエ幼虫の運動行動を導くために、線形アガロースチャネルを使用する方法を提示します。 アガロースチャネルにおけるショウジョウバエ幼虫の行動を学ぶのではなく、平らな開口面での動作、いくつかの利点を有しています。まず、研究者は、具体的に幼虫の行動レパートリーの一部である多くの動きからクロールの動作を選択することができます。第二に、幼虫の体の大きさに対してチャネルの幅を調整することにより、クローリングの速度を調整することができます。第三に、チャネルは、幼虫は幼虫がロードされ、チャネル内に配向されている方法に応じて背側、腹側、または側面から見ることが可能になります。幼虫の向きでこの汎用性は、クロール時に継続的に見えるようにする目的の任意の構造を可能にします。第4、チャネルは、顕微鏡や目的の広範囲で使用するために適しています。例えば、直線状のチャンネルが明視野ステレオスコープに及び/又はスピニングディスク共焦点顕微鏡1の高解像度画像化のために低解像度イメージングのために使用することができます。第五に、この方法は、任意の遺伝的バックグラウンドに光遺伝学/熱を生じるニューロンの操作と組み合わせて使用​​することができます。最後に、理由幼虫（第1、第2齢で）体とアガロースチャネルの両方は、ダイナミックな動き、または遺伝的にコードされた蛍光プローブにより標識幼虫構造の蛍光強度の変化を研究する際のチャネルを使用することができ、光学的に透明です。 記載の方法は、第1および第2齢ショウジョウバエ幼虫の動作の詳細な運動学的研究に適しています。この刊行物は、チャネルの使用を実証するために、前方幼虫のクロール時にCNSの蛍光強度の動的変化を分析し、前駆体としてNEUしますRONALカルシウムイメージング。

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

ショウジョウバエの幼虫のクロールは、感覚運動行動の神経制御を研究するための強力なモデルとして浮上しています。 、一時停止回し、および蛇行：しかし、平らな開口面上の幼虫のクロールの動作には、複雑です。動きのレパートリーで、この複雑さは、単一のクロールストライドサイクル中に発生したイベントの詳細な分析を妨げます。この障害を克服するために、リニアアガロースチャンネルはストレート、持続的な、リズミカルなクロールに幼虫の行動を制約すること行われました。アガロースチャネルおよびショウジョウバエ幼虫の体は両方の光学的に透明であるため、原理的には、遺伝的にコードされた蛍光プローブにより標識幼虫構造体の動きはそのまま、自由に移動幼虫でモニターすることができます。過去には、幼虫は、線形チャネルに入れ、生物全体のレベルでクロール、セグメント、および筋肉を1分析しました。将来的には、チャネルにクロール幼虫神経を監視するために、カルシウムイメージングのために使用することができますNALの活動。また、これらの方法は、任意の遺伝子型の幼虫を、任意の研究設計のチャネルに使用することができます。したがって、以下に示すプロトコルは、モータ制御を理解するためのモデルとしてショウジョウバエの幼虫を用いた研究のために広く適用可能です。

この記事では、アガロースチャネルを使用してショウジョウバエ幼虫の行動を案内するとクロールサイクルにわたって幼虫構造のダイナミクスを測定する方法を説明します。リニアチャンネルにおける幼虫は、リズミカルなクロール（ 図3）の持続的な発作を行います。幼虫とチャネルの両方が光学的に透明であるので、チャネルは、関心のある任...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

ショウジョウバエの幼虫は、行動の神経制御を研究するための強力なモデル系です。この刊行物は、反復的なクロールの動作中に幼虫構造のダイナミクスを定量化するために、線形クロールとメソッドの持続的な発作を誘発するリニアアガロースチャネルの使用を記載しています。

勉強するリニアアガロースチャネルを使用します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫クロールの動作

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K ビュー.  University of Chicago.  ショウジョウバエの幼虫は、行動の神経制御を研究するための強力なモデル系です。この刊行物は、反復的なクロールの動作中に幼虫構造のダイナミクスを定量化するために、線形クロールとメソッドの持続的な発作を誘発するリニアアガロースチャネルの使用を記載しています。 

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

生物学

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

生物工学

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

神経科学

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

行動学

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

パスの長さのプロトコルを採餌<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;幼虫

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www.jove.com/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

自由に歩くハエの追跡:ショウジョウバエの移動を評価する方法

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

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ショウジョウバエの幼虫の匂い駆動型の動作の高分解能測定

における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用

アッセイのメソッドショウジョウバエ行動

幼虫給電回路の機能解析ショウジョウバエ

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

パスの長さのプロトコルを採餌

嗅覚ニューロンの光刺激に対する応答のショウジョウバエ幼虫の行動を追跡

ショウジョウバエの幼虫フォトタキスの分析のための光スポットベースアッセイ

自由に歩くハエの追跡:ショウジョウバエの移動を評価する方法