We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Preparazione di larve <ol><li> Una settimana prima di registrare il comportamento, impostare una croce (minimo di 25 vergini e 5 maschi). Mantenere tutte le croci e progenie a 25 ° C. NOTA: La temperatura di condizioni di coltura può essere modificata, ma la linea di tempo indicato di seguito dovrebbe essere aggiustato per tenere conto di cambiamenti di velocità di sviluppo. </li><li> 5 giorni prima della registrazione, prima cosa al mattino, mettere la croce in una gabbia di raccolta con un tappo di agar / succo di frutta e una piccola quantità (0,5-1 ml) di pasta di lievito, nel centro del tappo agar / succo di frutta. <ol><li> Per fare una gabbia di raccolta, colpire i fori in un 6 once polietilene piazza bottiglia Drosophila. </li><li> Per rendere tappi agar / succo, mescolare 18 g di agar con acqua 600 ml in pallone conico. In un separato mix pallone 20 g di saccarosio con 200 ml di succo di mela. Forno a microonde fino a quando i solidi si sciolgono. Unire e mescolare, permettendo miscela raffreddare a 60 ° C. Aggiungere 20 ml di 10% di metil-p-idrossibenzoato in 95% di etanolo, e mescolare. Aggiungere ~ 7ml alla metà inferiore di un 35 x 10 mm rotondo Petri. Lasciare agar / succo solidificare per 1 ora a RT. Conservare a 4 ° C. </li><li> Per fare pasta di lievito, aggiungere parti uguali da lievito secco volume e acqua. Conservare a 4 ° C. </li></ol></li><li> Controllare la salute delle collezioni larvali. <ol><li> Al mattino, 4 e 3 giorni prima della registrazione, rimuovere il tappo e inserire un tappo fresco sulla gabbia. Cambiare i tappi, allo stesso tempo ogni giorno per ottenere una raccolta 24 ore di uova e larve appena schiusi. </li><li> Dopo ogni tappo viene rimosso, esaminarlo per vedere quante uova la croce sta ponendo. Aspettatevi tra 500-2000 uova. Regolare il numero di adulti, se necessario. NOTA: un paio di uova si sono schiuse dovrebbero in larve, e le larve appena schiusi saranno trovato lontano dalla pasta di lievito. </li><li> Età ogni tappo per 24 ore. Riesaminare il tappo per determinare se le larve sono sani. NOTA: La maggior parte delle uova dovrebbero sono nati in larve, e le larve avrebbero dovuto strisciato in voipasta ast. I segni di cattiva salute includono un gran numero di uova non schiuse, corpi larvali morti lontano dalla pasta di lievito, e le larve con notevoli macchie scure in addome, che indica una reazione immunitaria. Se larve sono malsano, cambiare la gabbia, fare tappi freschi / pasta di lievito, e verificare il genotipo. </li><li> Eliminare i vecchi tappi. </li></ol></li><li> Raccogliere le larve per le registrazioni del comportamento. <ol><li> Sia a 2 e 1 giorno prima della registrazione, togliere il tappo e sostituire con un tappo fresca. </li><li> Etichettare ogni tappo rimosso e mantenere a 25 ° C. Ciò produrrà una serie messa in scena di larve per le registrazioni del comportamento. Larve da appena tratteggiata (0-4 hr posthatch) attraverso la seconda instar (24-48 posthatch) può essere utilizzato nei canali. Salva tappi per le registrazioni in giorni consecutivi. </li><li> Eliminare tutte le protezioni dopo 48 ore. </li><li> Se necessario, ripetere i passaggi 1.4.1-1.4.3 per un massimo di 5 ulteriore d. Dopo che meno uova fecondate vengono prodotte. </li></ol></li></ol><ol><li> Preparare il PDMS canali lineari (Polidimetilsilossano, un elastomero siliconico) colata stampo (Figura 1A). PDMS colata stampi sono disponibili presso il laboratorio di Heckscher su richiesta. <ol><li> Pulire lo stampo fusione con alcool isopropilico. aria secca, DAB secco con salviette di laboratorio, o utilizzare aria compressa. </li><li> Mettere lo stampo fusione in un 10 centimetri Petri coperchio o altro contenitore. </li></ol></li><li> Preparare e versare la soluzione di agarosio. <ol><li> Effettuare una soluzione al 3% di agarosio in acqua (3 g in 100 ml) per microonde fino a completo scioglimento. </li><li> Raffreddare a 55 ° C, permettendo bolle di salire alla superficie. </li><li> Versare il composto agarosio nella capsula di Petri contenente lo stampo di colata in modo tale che lo stampo sia appena coperto. Lasciate set agarosio fino solidificato. </li></ol></li><li> Rimuovere i canali agarosio dallo stampo di fusione. Tagliare i bordi del disco agarosio con una lama di rasoio. <ol><li> Mettere il canales in una capsula di Petri 10 centimetri immerso in acqua. Essi possono essere conservati a 4 ° C per 7 giorni. </li></ol></li></ol> 3. Caricamento di una larva in un canale da registrare il comportamento NOTA: Se la memorizzazione dei canali a 4 ° C, permettono canali di venire a RT prima di utilizzare per la registrazione del comportamento. <ol><li> Utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare un singolo canale da quelli preparata nella fase 2 (Figura 2A). </li><li> Utilizzare un paio di pinze per posizionare il canale scanalato-side-up su un vetrino di vetro (Figura 2B). La dimensione e lo spessore del vetrino dipende dalla portata specifica utilizzata per l&#39;imaging. </li><li> Utilizzare una pinza sottile per selezionare una larva dal tappo agar / succo preparata nella fase 1 e posizionare nel canale di taglio (Figura 2C). <ol><li> Non spremere la larva. Raccoglierlo delicatamente con la punta della pinza denti. È anche possibile manipolare larva con un pennello con una punta fine. NOTA: Questo è importante in quanto le larve sono molto sensitive al tatto. Se non sono maneggiati con cura, le risposte nocicettive potrebbero dominare il loro comportamento durante i primi secondi di questo esperimento. </li><li> Lavare le larve da loro immergendo brevemente in acqua. </li><li> Dopo aver posizionato la larva sul canale di taglio, utilizzare la punta della pinza denti a stuzzicare delicatamente la larva nel boschetto canale. NOTA: Per la maggior parte delle applicazioni la larghezza della larva e la larghezza del canale devono corrispondere. La larghezza media di larve a diversi stadi di sviluppo segue: 0 HR posthatch - 140 micron, 24 ore posthatch - 180 micron, 48 hr posthatch - 320 micron, 72 hr posthatch - 500 micron, 96 hr posthatch - 750 micron 8. I canali sono disponibili nelle seguenti larghezze: 100, 150, 200, 250 e 300 micron, e tutti i canali sono 150 micron di profondità. </li><li> Utilizzare la punta di un dente pinze o pennello per regolare la posizione della larva all&#39;interno del canale. Esso può essere orientato in qualsiasi direzione: ventraleup, ventrale giù, ventrale da un lato, a seconda di quale struttura è da acquisire. </li></ol></li><li> Utilizzando pinze, capovolgere delicatamente il canale sopra in modo che la larva è ora sul vetro di copertura. Inserire una o due gocce d&#39;acqua alle estremità del canale in modo da riempire con acqua (Figura 2D). <ol><li> Sollevare delicatamente ai lati del canale per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria. </li><li> Regolare l&#39;orientamento della larva. Per farlo, spingere delicatamente il canale, ma non il vetro di copertura a rotolare la larva. Se questo non cambia l&#39;orientamento, rimuovere il vetro di copertura e regolare la posizione larvale. La larva è pronta per essere ripreso. </li><li> Immagine del canale / vetrino su un microscopio invertito. Se l&#39;imaging su un microscopio in posizione verticale, è sufficiente invertire il canale / vetrino. </li></ol></li></ol> 4. Caratteristica Misura di interesse in registrazione Behavioral <ol><li> Per una struttura di interesse (ad esempio, la coda, CNS), misurare una caratteristica di interesse (ad esempio,, Intensità di fluorescenza, posizione) nel tempo. NOTA: Strutture come la testa e la coda possono essere annotate a mano. Ad esempio, la testa può essere identificato come contenente bocca ganci a forma di H scuri e la coda può essere identificato come contenente spiricles tracheali posteriori. Questo documento si concentra sul cordone nervoso. Utilizzare la linea neuronale GAL4 ELAV-GAL4 di guidare un transgene UAS-MYR-GFP (ELAV&gt; GFP) 9,10 per etichettare fluorescente del sistema nervoso centrale (SNC). La CNS contiene due lobi cerebrali anteriori collegati al cordone nervoso, che si estende al posteriore (figura 3). </li><li> Misurare l&#39;intensità dei pixel del cordone nervoso (f (NC)) in ciascun punto di tempo (t). Qui di seguito descrive un approccio di annotazione manuale, ma questo passo potrebbe essere automatizzato. <ol><li> Nelle Figi (o software simile) nel menu &#39;Analizza&#39; utilizzare i &quot;Set Misure ...&quot; finestra di dialogo per segnalare il valore di grigio medio e SLICe la posizione. </li><li> Disegnare manualmente una scatola nel centro del cordone nervoso nel primo fotogramma del filmato (Figura 3). Questo passo potrebbe anche essere automatizzato con algoritmi immagine segmentazione e registrazione. </li><li> Utilizzare il comando &quot;Misura&quot; nel menu &#39;Analizza&#39; a riferire l&#39;intensità media dei pixel nella regione scatola di interesse. Ciò genera una finestra &quot;Risultati&quot;. </li><li> Nel fotogramma successivo, riposizionare manualmente la scatola senza ridimensionamento utilizzando i tasti freccia. Utilizzare nuovamente il comando &quot;Misura&quot;. I risultati aggiornati verranno visualizzati nella finestra &quot;Risultati&quot;. Ripetere questo passaggio per ogni fotogramma di interesse. </li><li> Salvare i &quot;Risultati&quot; che utilizzano il &#39;Salva con nome ...&#39; comando dal menu File. I risultati saranno esportati come file .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analizzare i Misure <ol><li> Normalizza ogni f (NC) valore a un valore compreso tra 0 e 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> Nel foglio di calcolo (o un altro programma), aprire il file Results.xls. Questo file avrà due colonne che rappresentano il numero di fotogramma e l&#39;intensità media di fluorescenza. </li><li> Fare una nuova colonna e utilizzare la formula z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) per generare un valore di fluorescenza normalizzato corrispondente a ciascun punto di tempo. </li></ol></li><li> Determinare il periodo di passo per ogni passo nella registrazione. NOTA: Un ciclo passo è l&#39;unità di ripetitivo movimento di tutto il corpo per la marcia avanti (e indietro) scansione. Per convenzione un passo in avanti inizia (e finisce) con il movimento in avanti della coda, la testa, e di altri organi interni come l&#39;intestino o il sistema nervoso centrale 1. <ol><li> Controllare manualmente la registrazione comportamentale e registrare i tempi di iniziazione (i) di ogni passo (i (STRIDE ciclo [n])). NOTA: Nell&#39;esempio riportato di seguito, il movimento in avantidel SNC come l&#39;avvio di un ciclo passo è stato usato (figura 3). </li><li> Per ogni passo calcolare il periodo: Δ t (ciclo del passo) = I (Stride ciclo [n + 1]) -i (Stride ciclo [n]). </li></ol></li><li> Calcolare la percentuale del ciclo di passo trascorso per ogni punto di tempo della registrazione. <ol><li> Effettuare una colonna aggiuntiva nel foglio di calcolo rappresenta il tempo trascorso dall&#39;inizio di un ciclo passo (c). Impostare il tempo dal momento che l&#39;inizio del passo a zero l&#39;avvio di ogni passo (c (Stride ciclo [n]) = 0). Regolare volte dopo l&#39;inizio di conseguenza. </li><li> Fare una colonna aggiuntiva nel file di foglio di calcolo che rappresenta ciclo per cento del passo trascorso (ciclo del passo%) Dividere volte modificate entro periodo falcata e moltiplicare per 100 per convertire in percentuale del ciclo del passo trascorso:. Ciclo% stride = (c (Stride ciclo [n] )) / (Δ t (Ciclo Stride) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Generare coordinate polari piazzole rappresentare le dinamiche di strutture di interesse nel corso del ciclo di scansione <ol><li> In MATLAB, usare il dialogo il &#39;Importa dati&#39; nella scheda Home per importare il Results.xls aggiornato. </li><li> Fare un nuovo array &quot;Theta&quot; valori del ciclo passo contenente percentuale (% del ciclo del passo). ( &quot;Theta = Var1&quot; dove Var1 rappresenta% del ciclo del passo). </li><li> Fare un nuovo array &quot;Rho&quot; contiene valori di fluorescenza normalizzati (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; dove Var2 rappresenta z (t)). </li><li> Utilizzare il comando &#39;polarplot&#39; per fare in coordinate polari trame con il ciclo per cento del passo come l&#39;angolo, e la fluorescenza come il raggio ( &quot;polarplot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

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	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un dispositivo di microfluidica è stato costruito per rendere i canali di agarosio lineari che possono ospitare larve di Drosophila (Figura 1). Quando Drosophila larve sono collocati in questi canali agarosio lineari loro repertorio comportamentale è limitato a scansione, che consente l&#39;osservazione dettagliata della dinamica di strutture larvali durante il ciclo di scansione. Una registrazione riuscita si verifica quando una larva eseguire una serie ...

L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Drosophila scansione larvale in dettaglio. Esperimenti su locomozione hanno giocato un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie sul controllo motore 2. Tradizionalmente locomozione è stata studiata in animali acquatici (ad esempio, sanguisuga, lampreda, girino) 3. La natura ripetitiva di locomozione in questi animali ha consentito per lo studio di rhythmogenesis, per l&#39;analisi degli eventi biofisici locomozione di guida, e per monitorare i modelli di cottura neurali che accompagnano locomozione. L&#39;uso di Drosophila larve per studi di locomozione presenta una combinazione unica di vantaggi rispetto ad altri sistemi modello: genetica facili, sviluppo ben caratterizzato, un corpo che è otticamente chiaro primi e secondi stadi, e un elettrone trasmissione permanente ricostruzione microscopica dell&#39;intero sistema nervoso 4-6. Tuttavia, Drosophila larvale locomovimento su superfici piane aperte è un po &#39;complesso che include le pause, si gira, e serpeggiante striscia 7. Questa pubblicazione presenta un metodo per utilizzare i canali di agarosio lineari per guidare Drosophila comportamento motorio larvale in modo tale che le larve perform sostenuto, dritto, il comportamento scansione ritmica. Studiando Drosophila comportamento larvale nei canali di agarosio, invece di comportamento su superfici piane aperte, ha diversi vantaggi. In primo luogo, permette ai ricercatori di selezionare specificamente strisciando comportamento dai molti movimenti che sono parte del repertorio comportamentale larvale. In secondo luogo, regolando la larghezza del canale rispetto alla dimensione del corpo larvale, velocità scansione può essere regolata. Terzo, canali consentono la larva per essere visto da dorsale, ventrale o laterale a seconda di come la larva viene caricato e orientato all&#39;interno del canale. Questa versatilità in orientamento larvale permette a qualsiasi struttura di interesse per essere costantemente visibile durante la scansione. Il quarto,canali sono suscettibili per l&#39;uso con un&#39;ampia varietà di microscopi e obiettivi. Ad esempio, canali lineari possono essere utilizzati per l&#39;imaging bassa risoluzione sulla stereoscopes campo chiaro e / o per l&#39;imaging ad alta risoluzione sulla filatura-disco microscopio confocale 1. Quinto, questo metodo può essere usato in combinazione con optogenetic / thermogenetic manipolazioni neuronali in qualsiasi sfondo genetico. Infine, perché sia ​​il corpo larvale (in prima e seconda stadi) e canali di agarosio sono otticamente trasparente, canali possono essere utilizzati quando si studiano i movimenti dinamici, o cambiamenti di intensità fluorescente delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati. Il metodo descritto è adatto per gli studi cinematici dettagliati di primo e secondo instar Drosophila comportamento larvale. Questa pubblicazione analizza i cambiamenti dinamici di intensità fluorescente del sistema nervoso centrale durante la scansione larvale in avanti per dimostrare l&#39;utilizzo di canali e come un precursore di NeuCalcio Imaging Ronal.

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila scansione larvale sta emergendo come un potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento sensomotorio. Tuttavia, il comportamento scansione larvale su superfici piane aperte è complessa, tra cui: pausa, tornitura, e meandri. Questa complessità nel repertorio di movimento ostacola un&#39;analisi dettagliata degli eventi che si verificano nel corso di un singolo ciclo di scansione passo. Per superare questo ostacolo, i canali di agarosio lineari sono stati fatti che vincolano il comportamento larvale a diritto, sostenuta, scansione ritmica. In linea di principio, perché i canali di agarosio e il corpo larvale Drosophila sono sia otticamente trasparente, il movimento delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati può essere monitorato in intatto, larve liberamente muoversi. In passato, le larve sono stati inseriti in scanalature lineari e strisciando a livello di tutto l&#39;organismo, segmento e muscoli sono stati analizzati 1. In futuro, larve strisciando nei canali può essere utilizzato per l&#39;imaging del calcio per il monitoraggio neurol&#39;attività finale. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati con larve di ogni genotipo e con qualsiasi canale ricercatore progettato. Così il protocollo presentato sotto è ampiamente applicabile per gli studi che utilizzano la larva di Drosophila come modello per capire il controllo del motore.

Questo articolo descrive un metodo per guidare comportamento larvale Drosophila utilizzando canali agarosio e per misurare la dinamica delle strutture larvali in un ciclo di scansione. Le larve di canali lineari eseguire attacchi sostenuti di scansione ritmica (Figura 3). Poiché sia ​​le larve e canali sono otticamente trasparenti, i canali possono essere utilizzati con esprimendo larve sonde fluorescenti espressi in qualsiasi struttura di interesse. Abbiam...

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Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l&#39;utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo.

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportamento larvale Crawling

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K Views.  University of Chicago.  La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l'utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo. 

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High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

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Ricerca

Biologia

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

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Bioingegneria

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Metodi per test Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neuroscienze

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Le larve

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www.jove.com/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

Tracciare le mosche che camminano liberamente: un metodo per valutare la locomozione in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

Utilizzando canali lineari Agarose per studiare

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Utilizzando Chips microfluidica per l'imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in

Metodi per test Drosophila Comportamento

Analisi funzionale del circuito di alimentazione larvale in Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Una semplice tecnica per analizzare l'attività locomotoria nella Drosophila

Foraggiamento protocollo percorso di lunghezza per

Il comportamento larvale della drosofila in risposta alla stimolazione optogenetica dei neuroni olfattivi di rilevamento

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

Tracciare le mosche che camminano liberamente: un metodo per valutare la locomozione in Drosophila