We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.

1. Préparation de Larves <ol><li> Une semaine avant le comportement d&#39;enregistrement, mettre en place une croix (minimum de 25 vierges et 5 mâles). Maintenir tous les croisements et la descendance à 25 ° C. NOTE: La température des conditions de culture peut être modifiée, mais la ligne de temps décrite ci-dessous devrait être ajusté pour tenir compte des variations de la vitesse de développement. </li><li> 5 jours avant l&#39;enregistrement, la première chose le matin, placez la croix dans une collection cage avec un bouchon de gélose / jus et un dab (0,5-1 ml) de pâte de levure dans le centre de la calotte agar / jus. <ol><li> Pour faire une collection cage, percer des trous dans un 6 oz polyéthylène carré Drosophila de la bouteille. </li><li> Pour bouchons agar / jus, mélanger 18 g d&#39;agar-agar avec 600 de l&#39;eau dans un flacon conique. Dans un ballon mélange 20 g de saccharose séparée avec 200 ml de jus de pomme. Micro-ondes jusqu&#39;à ce que les solides soient dissous. Mélanger et remuer, permettant le mélange refroidir à 60 ° C. Ajouter 20 ml 10% de méthyl-p-hydroxybenzoate dans 95% d&#39;éthanol, et remuer. Ajouter ~ 7ml à la moitié inférieure d&#39;une boîte de Pétri ronde 35 x 10 mm. Laisser agar / jus de se solidifier pendant 1 heure à température ambiante. Conserver à 4 ° C. </li><li> Pour faire de la pâte de levure, ajouter des parties égales en volume de levure sèche et de l&#39;eau. Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Vérifiez la santé des collections larvaires. <ol><li> Dans la matinée, 4 et 3 jours avant l&#39;enregistrement, retirez le bouchon et placer un nouveau cap sur la cage. Changez les bouchons à la même heure chaque jour pour obtenir une collection de 24 heures d&#39;oeufs et de larves nouvellement écloses. </li><li> Après chaque bouchon est enlevé, l&#39;examiner pour voir combien d&#39;oeufs la croix est la pose. Attendez-vous entre 500-2000 oeufs. Réglez le nombre d&#39;adultes, si nécessaire. NOTE: Quelques oeufs devraient éclore en larves ont, et les larves nouvellement écloses seront trouvés loin de la pâte de levure. </li><li> Âge chaque chapeau pendant 24 heures. Réexaminer le bouchon afin de déterminer si les larves sont en bonne santé. REMARQUE: La plupart des œufs devraient éclore en larves ont, et les larves auraient rampé dans le yepâte de ast. Les signes de mauvaise santé comprennent un grand nombre d&#39;oeufs non éclos, morts organismes larvaires loin de la pâte de levure, et les larves avec des taches sombres significatives dans l&#39;abdomen, ce qui indique une réaction immunitaire. Si les larves sont insalubres, changer la cage, assurez capsules fraîches / pâte de levure, et vérifier le génotype. </li><li> Jeter les vieux chapeaux. </li></ol></li><li> Recueillir les larves pour les enregistrements de comportement. <ol><li> À la fois 2 et 1 jour avant l&#39;enregistrement, retirez le bouchon et le remplacer par un bouchon frais. </li><li> Etiqueter chaque capuchon retiré et maintenir à 25 ° C. Ceci va produire une série progressive de larves pour les enregistrements de comportement. Larves de nouvellement éclos (0-4 h après l&#39;éclosion) par deuxième stade larvaire (24-48 h après l&#39;éclosion) peut être utilisé dans les canaux. Enregistrer bouchons pour les enregistrements sur deux jours consécutifs. </li><li> Jeter tous les bouchons après 48 heures. </li><li> Si nécessaire, répétez les étapes 1.4.1-1.4.3 jusqu&#39;à 5 d supplémentaire. Après que moins d&#39;œufs fécondés sont produits. </li></ol></li></ol><ol><li> Préparer PDMS linéaires de canal (Polydiméthylsiloxane, un élastomère de silicone) de moule de coulée (figure 1A). PDMS casting moules sont disponibles auprès du laboratoire Heckscher sur demande. <ol><li> Nettoyer le moule de coulée avec de l&#39;alcool isopropylique. Sécher à l&#39;air, séchez avec des lingettes de laboratoire, ou utiliser de l&#39;air en conserve. </li><li> Placez le moule de coulée dans une boîte de Pétri couvercle 10 cm ou un autre récipient. </li></ol></li><li> Préparer et verser la solution d&#39; agarose. <ol><li> Faire une solution à 3% d&#39;agarose dans de l&#39;eau (3 g dans 100 ml) par micro-ondes jusqu&#39;à dissolution complète. </li><li> Laisser refroidir à 55 ° C, ce qui permet aux bulles de monter à la surface. </li><li> Verser le mélange d&#39;agarose dans la boîte de Pétri contenant le moule de coulée de sorte que le moule soit juste recouverte. Laissez ensemble agarose jusqu&#39;à solidifié. </li></ol></li><li> Retirez les canaux d&#39;agarose du moule de coulée. Rogner les bords du disque d&#39;agarose avec une lame de rasoir. <ol><li> Mettez le canals dans un plat de 10 cm Petri immergé dans l&#39;eau. Ils peuvent être conservés à 4 ° C pendant 7 jours. </li></ol></li></ol> 3. Charger un Larve dans un canal à enregistrer Comportement NOTE: Si le stockage des canaux à 4 ° C, permettent de venir à canaux RT avant d&#39;utiliser pour l&#39;enregistrement du comportement. <ol><li> Utilisez une lame de rasoir propre pour couper un seul canal de ceux préparés à l&#39; étape 2 (figure 2A). </li><li> Utiliser une paire de pinces pour placer le canal latéral rainuré sur une lamelle de verre (figure 2B). La taille et l&#39;épaisseur de la lamelle dépend de la portée spécifique utilisée pour l&#39;imagerie. </li><li> Utilisez une pince fine pour sélectionner une larve du bouchon agar / jus préparé à l&#39; étape 1 et le placer dans le canal de coupe (figure 2C). <ol><li> Ne pas presser la larve. Prenez-le délicatement avec la pointe de la pince tine. Il est également possible de manipuler la larve avec un pinceau à pointe fine. NOTE: Ceci est important car les larves sont très senSitive au toucher. Si elles ne sont pas manipulés avec soin, les réponses nociceptives pourraient dominer leur comportement pendant les premières secondes de l&#39;expérience. </li><li> Laver les larves par brièvement immergeant dans l&#39;eau. </li><li> Après avoir placé la larve sur le canal de coupe, utilisez la pointe de la pince tine pour taquiner doucement la larve dans le bosquet de canal. REMARQUE: Pour la plupart des applications de la largeur de la larve et la largeur du canal doivent correspondre. La largeur moyenne des larves à différents stades de développement suit: 0 h après l&#39; éclosion - 140 um, 24 h après l&#39; éclosion - 180 um, 48 h après l&#39; éclosion - 320 um, 72 heures après l&#39; éclosion - 500 um, 96 h après l&#39; éclosion - 750 um 8. Canaux viennent dans les largeurs suivantes: 100, 150, 200, 250, et 300 um, et tous les canaux sont de 150 um de profondeur. </li><li> Utilisez la pointe d&#39;une dent ou d&#39;un pinceau pince pour ajuster la position de la larve dans le canal. Il peut être orienté dans toutes les directions: ventralejusqu&#39;à ventral vers le bas, d&#39;un côté ventral, en fonction de la structure doit être imagée. </li></ol></li><li> En utilisant des pinces, retournez doucement le canal sur de telle sorte que la larve est maintenant sur le verre de protection. Placez une ou deux gouttes d&#39;eau aux extrémités du canal de sorte qu&#39;il se remplit d&#39;eau (figure 2D). <ol><li> Soulevez doucement les côtés du canal pour éliminer les bulles d&#39;air. </li><li> Ajuster l&#39;orientation de la larve. Pour ce faire, pousser doucement le canal, mais pas le verre de couverture pour rouler la larve. Si cela ne change pas l&#39;orientation, retirez le couvercle en verre et d&#39;ajuster la position larvaire. La larve est prête à être imagé. </li><li> Image du canal / lamelle sur un microscope inversé. Si l&#39;imagerie sur un microscope droit, inverser simplement le canal / lamelle. </li></ol></li></ol> 4. Mesurer entité d&#39;intérêt dans l&#39;enregistrement du comportement <ol><li> Pour une structure d&#39;intérêt (par exemple, la queue, CNS), mesurer une caractéristique d&#39;intérêt (par exemple ,, L&#39;intensité de fluorescence, l&#39;emplacement) au fil du temps. NOTE: Des structures telles que la tête et la queue peuvent être annotées manuellement. Par exemple, la tête peut être identifié comme contenant buccaux sombres crochets en forme de H, la queue peut être identifié comme contenant spiricles trachéales postérieures. Ce document met l&#39;accent sur le cordon nerveux. Utilisez la ligne de GAL4 elav-GAL4 neuronal pour conduire un transgène UAS-myr-GFP (elav&gt; GFP) 9,10 pour marquer par fluorescence du système nerveux central (SNC). Le CNS contient deux lobes du cerveau antérieur attachés à la moelle épinière, qui se prolonge à la partie postérieure (Figure 3). </li><li> Mesurer l&#39;intensité de pixel du nerf cordon (f (NC)) à chaque point de temps (t). Ci-dessous décrit une approche manuelle d&#39;annotation, mais cette étape peut être automatisée. <ol><li> Aux Fidji (ou un logiciel similaire) dans le menu &#39;Analyser&#39; utiliser les &quot;Mesures Set ...&quot; boîte de dialogue pour indiquer la valeur de gris moyen et slice position. </li><li> Dessiner manuellement une boîte dans le centre de la moelle épinière dans la première image du film (Figure 3). Cette étape pourrait également être automatisé avec des algorithmes de segmentation d&#39;image et d&#39;enregistrement. </li><li> Utilisez la commande &quot;Mesure&quot; dans le menu &quot;Analyser&quot; pour signaler l&#39;intensité moyenne de pixels dans la région encadrée d&#39;intérêt. Cela génère une fenêtre &quot;Résultats&quot;. </li><li> Dans l&#39;image suivante, repositionner manuellement la boîte sans redimensionnement à l&#39;aide des touches fléchées. Utilisez à nouveau la commande &quot;Mesure&quot;. Les résultats mis à jour seront affichés dans la fenêtre &quot;Résultats&quot;. Répétez cette étape pour chaque trame d&#39;intérêt. </li><li> Enregistrer la commande &quot;Résultats&quot; en utilisant &quot;Enregistrer sous ...&quot; dans le menu Fichier. Les résultats seront exportés sous forme de fichier .xls. </li></ol></li></ol> 5. Analyser les mesures <ol><li> Normaliser chaque f (NF) de la valeur à une valeur comprise entre 0 et 1 (z (t) &lt;/ Em&gt;). <ol><li> Dans une feuille de calcul (ou un autre programme), ouvrez le fichier Results.xls. Ce fichier aura deux colonnes représentant le numéro d&#39;image et de l&#39;intensité de fluorescence moyenne. </li><li> Faire une nouvelle colonne et utiliser la formule z (t) = f (NC [t]) -min (f [NC]) / max (f [NC]) -min (f [NC]) pour générer une valeur de fluorescence normalisée correspondant à chaque point temporel. </li></ol></li><li> Déterminer la période foulée pour chaque foulée dans l&#39;enregistrement. NOTE: Un cycle de foulée est l&#39;unité de mouvement du corps entier répétitif pour l&#39;avant (et arrière) ramper. Par convention un terme commence foulée (et extrémités) avec le mouvement vers l&#39; avant de la queue, la tête, et d&#39; autres organes internes tels que l&#39;intestin ou CNS 1. <ol><li> Inspecter manuellement l&#39;enregistrement du comportement et enregistrer les temps d&#39;initiation (i) de chaque foulée (i (Stride Cycle [n])). NOTE: Dans l&#39;exemple ci-dessous, le mouvement vers l&#39;avantdu système nerveux central comme l&#39;ouverture d&#39;un cycle de foulée a été utilisé (Figure 3). </li><li> Pour chaque foulée calculer la période: Δ t (cycle Stride) = i (Stride Cycle [n + 1]) -i (Stride Cycle [n]). </li></ol></li><li> Calculer le pourcentage du cycle de foulée écoulé pour chaque point de l&#39;enregistrement du temps. <ol><li> Faire une colonne supplémentaire dans le fichier de feuille de calcul représentant le temps écoulé depuis le début d&#39;un cycle de foulée (c). Régler l&#39; heure depuis le début de foulée à zéro au début de chaque foulée (c (Stride Cycle [n]) = 0). Régler les temps après l&#39;initiation en conséquence. </li><li> Faire une colonne supplémentaire dans le fichier de feuille de calcul représentant le cycle pour cent de foulée écoulé (cycle de foulée%) Divisez fois ajustés par période foulée et multiplier par 100 pour convertir en pourcentage du cycle de foulée écoulée:.% Cycle de foulée = (c (Stride Cycle [n] )) / (Δ t (Cycle Stride) * 100). </li></ol></li></ol> 6. Générer coordonnées polaires Parcelles pour représenter la dynamique des structures d&#39;intérêt au cours du cycle de Crawl <ol><li> Dans MATLAB, utilisez dialogue &#39;importation de données »dans l&#39;onglet Accueil pour importer le Results.xls mis à jour. </li><li> Faire un nouveau tableau &quot;Theta&quot; Valeurs de cycle de foulée contenant pour cent (cycle de foulée%). ( &quot;Theta = Var1&quot; où Var1 représente le cycle de foulée%). </li><li> Faire un nouveau tableau &quot;Rho&quot; contiennent des valeurs de fluorescence normalisés (z (t)). ( &quot;Rho = Var2&quot; où Var2 représente z (t)). </li><li> Utilisez la commande &#39;polarplot&#39; pour faire de coordonnées polaires parcelles avec le cycle pour cent de la foulée que l&#39;angle, et la fluorescence que le rayon ( &quot;polarplot (Theta, Rho)&quot;). </li></ol>

<ol>
	<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism,+segment,+and+somatic+body+wall+musculature.">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li><li>Marder, E., Calabrese, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+rhythmic+motor+pattern+generation.">Principles of rhythmic motor pattern generation.</a> Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).</li><li>Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+control+of+swimming+behavior:+Comparison+of+vertebrate+and+invertebrate+model+systems.">Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems.</a> Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).</li><li>Ohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multilevel+multimodal+circuit+enhances+action+selection+in+Drosophila.">A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila.</a> Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).</li><li>Landgraf, M., Thor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Drosophila+motoneurons:+specification+and+morphology.">Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology.</a> Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).</li><li>Heckscher, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-Skipped(+)+Interneurons+Are+Core+Components+of+a+Sensorimotor+Circuit+that+Maintains+Left-Right+Symmetric+Muscle+Contraction+Amplitude.">Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude.</a> Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).</li><li>Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+patterns+of+inter-and+intraspecific+variation+in+the+behaviour+of+Drosophila+larvae.">Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae.</a> Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).</li><li>Graf, S. A., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rover/Sitter+Drosophila+melanogaster+Larval+Foraging+Polymorphism+as+a+Function+of+Larval+Development,+Food-Patch+Quality,+and+Starvation.">Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation.</a> J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Rebay, I., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yan+Functions+as+a+General+Inhibitor+of+Differentiation+and+Is+Negatively+Regulated+by+Activation+of+the+Rasl+/+MAPK+Pathway.">Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway.</a> Cell. 81 (6), 857-866 (1995).</li><li>Chen, T. -. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Tufte, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The visual display of quantitative information. , (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Un dispositif microfluidique a été construit pour faire des canaux d&#39;agarose linéaires qui peuvent accueillir des larves de drosophile (Figure 1). Lorsque les larves de drosophile sont placés dans ces canaux d&#39; agarose linéaires leur répertoire comportemental est limité à l&#39; exploration, ce qui permet une observation détaillée de la dynamique des structures larvaires au cours du cycle d&#39;exploration. Un enregistrement réussi se pro...

L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;étudier la drosophile crawling larvaire en détail. Des expériences sur la locomotion ont joué un rôle important dans le développement et tester des théories sur le contrôle moteur 2. Traditionnellement locomotion a été étudiée chez les animaux aquatiques (par exemple, sangsue, lamproie, têtard) 3. La nature répétitive de la locomotion chez ces animaux a permis l&#39;étude de rythmogenèse, pour l&#39;analyse des événements biophysiques locomotion de conduite, et pour la surveillance des modes de tir de neurones qui accompagnent la locomotion. L&#39;utilisation de larves de drosophile pour les études de locomotion présente une combinaison unique d&#39;avantages par rapport à d&#39; autres systèmes modèles: génétique faciles, le développement bien caractérisé, un corps qui est optiquement clair au premier et deuxième stades, et un électron de transmission en cours de reconstruction microscopique de l&#39;ensemble système nerveux 4-6. Cependant, la drosophile larvaire locomouvement sur des surfaces ouvertes à plat est un peu complexe , y compris les pauses, tourne, et sinueuse rampe 7. Cette publication présente une méthode pour utiliser des canaux d&#39;agarose linéaires pour guider Drosophila comportement locomoteur des larves de telle sorte que les larves effectuer soutenue, le comportement de rampement droite, rythmique. Étudier le comportement des larves de Drosophila dans les canaux d&#39; agarose, au lieu de comportement sur des surfaces plates ouvertes, présente plusieurs avantages. Premièrement, elle permet aux chercheurs de choisir spécifiquement ramper le comportement des nombreux mouvements qui font partie du répertoire comportemental larvaire. D&#39;autre part, en réglant la largeur du canal par rapport à la taille du corps de la larve, la vitesse peut être ajustée en rampant. En troisième lieu, les canaux permettent la larve d&#39;être vu à partir dorsale, ventrale ou latéral en fonction de la chenille est chargé et orienté à l&#39;intérieur du canal. Cette polyvalence d&#39;orientation larvaire permet pour chaque structure d&#39;intérêt pour être continuellement visible pendant l&#39;exploration. Quatrième,les canaux sont aptes à être utilisé avec une grande variété de microscopes et d&#39;objectifs. Par exemple, les chaînes linéaires peuvent être utilisés pour l&#39; imagerie à basse résolution sur stéréoscopes champ clair et / ou pour imagerie à haute résolution sur le filage-disque microscopes confocaux 1. Cinquièmement, cette méthode peut être utilisée en combinaison avec des manipulations neuronales optogénétiques / thermogénique dans tout contexte génétique. Enfin, parce que le corps de la larve (au premier et deuxième stades) et les canaux d&#39;agarose sont optiquement clair, les canaux peuvent être utilisés lors de l&#39;étude des mouvements dynamiques, ou des changements dans l&#39;intensité de fluorescence des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés. La méthode décrite est appropriée pour des études cinématiques détaillées de première et de deuxième stade Drosophila comportement des larves. Cette publication analyse les changements dynamiques dans l&#39;intensité de fluorescence du système nerveux central au cours des larves rampant vers l&#39;avant pour démontrer l&#39;utilisation de canaux et comme un précurseur de neuimagerie calcique ronal.

<table><tbody><tr><td>6 oz square Drosophila bottle</td><td>Scimart</td><td>DR-103</td><td></td></tr><tr><td>agar</td><td>sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>apple juice</td><td></td><td></td><td>not from concentrate</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Fisher</td><td>T2300</td><td>methyl-p-hydroxybenzoate</td></tr><tr><td>35 x 10 mm round petri dish</td><td>Fisher</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>baker&#039;s yeast</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS casting mold</td><td>FlowJem</td><td></td><td>can be requested from authors</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher</td><td>A417-1</td><td></td></tr><tr><td>laboratory wipes</td><td>Fisher</td><td>06-666-11</td><td></td></tr><tr><td>canned air</td><td>Fisher</td><td>18-431</td><td></td></tr><tr><td>10 cm petri dish</td><td>BioPioneer</td><td>GS82-1473-001</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>Fisher</td><td>50-444-176</td><td></td></tr><tr><td>razor blade</td><td>Fisher</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>forceps</td><td>FST</td><td>11241-40</td><td></td></tr><tr><td>22 x 40 cover glass, #1.5</td><td>Fisher</td><td>50-365-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiji (version 1.51d)</td><td>NIH</td><td></td><td>fiji.sc</td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td>www.microsoftstore.com</td></tr><tr><td>MATLAB R2016</td><td>Mathworks</td><td></td><td>www.mathworks.com</td></tr></tbody></table>

using linear agarose channels to study drosophila larval crawling behavior

Drosophila crawling larvaire est en train de devenir un modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement sensorimotrice. Cependant, le comportement de rampement larvaire sur des surfaces ouvertes à plat est complexe, y compris: une pause, se tournant et serpentant. Cette complexité dans le répertoire de mouvement empêche une analyse détaillée des événements qui se produisent pendant un cycle crawl enjambée unique. Pour surmonter cet obstacle, les canaux d&#39;agarose linéaires ont été faites qui limitent le comportement des larves à droite, soutenue, crawling rythmique. En principe, parce que les canaux d&#39; agarose et le corps des larves de drosophile sont tous deux optiquement clair, le mouvement des structures larvaires marquées par des sondes fluorescentes génétiquement encodés peut être contrôlée intacte, les larves librement en mouvement. Dans le passé, les larves ont été placées dans des canaux linéaires et rampants au niveau de l&#39; organisme entier, un segment, et les muscles ont été analysés 1. Dans le futur, les larves rampant dans les canaux peut être utilisé pour l&#39;imagerie du calcium pour surveiller la neurol&#39;activité finale. De plus, ces méthodes peuvent être utilisées avec des larves d&#39;un génotype et avec un canal de chercheur conçu. Ainsi , le protocole présenté ci - dessous est largement applicable pour les études utilisant la larve de drosophile comme modèle pour comprendre le contrôle moteur.

Cet article décrit une méthode pour guider le comportement des larves de drosophile en utilisant des canaux d&#39; agarose et pour mesurer la dynamique des structures larvaires sur un cycle d&#39;analyse. Larves dans les canaux linéaires effectuer des épisodes soutenus de crawling rythmique (Figure 3). Parce que les larves et les canaux sont optiquement clair, les canaux peuvent être utilisés avec des larves exprimant des sondes fluorescentes exprimées da...

Watch this Scientific Journal Video about Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior at JoVE.com

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

La larve de drosophile est un système modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement. Cette publication décrit l&#39;utilisation de canaux d&#39;agarose linéaires pour obtenir des combats soutenus de rampants et méthodes linéaires pour quantifier la dynamique des structures larvaires pendant un comportement répétitif ramper.

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire Ramper Comportement

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

using-linear-agarose-channels-to-study-drosophila-larval-crawling

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

7.3K vues.  University of Chicago.  La larve de drosophile est un système modèle puissant pour étudier le contrôle neuronal du comportement. Cette publication décrit l'utilisation de canaux d'agarose linéaires pour obtenir des combats soutenus de rampants et méthodes linéaires pour quantifier la dynamique des structures larvaires pendant un comportement répétitif ramper. 

Vidéo: Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Recherche

Biologie

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

L&#39;utilisation de puces microfluidiques pour l&#39;imagerie en direct et l&#39;étude des réponses blessures en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larves

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bio-ingénierie

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Neurosciences

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Sciences du comportement

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and diverse behavioral features. Identifying behavioral deficiency in animal models is a crucial measure of disease severity, for example, in neurodegenerative diseases where patients often experience impairments in motor function. However, with the availability of various systems to track and assess motor deficits in fly models, such as drug-treated or transgenic individuals, an economical and user-friendly system for precise evaluation from multiple angles is still lacking. A method based on the AnimalTracker application programming interface (API) is developed here, which is compatible with the Fiji image processing program, to systematically evaluate the movement activities of both adult and larval individuals from recorded video, thus allowing for the analysis of their tracking behavior. This method requires only a high-definition camera and a computer peripheral hardware integration to record and analyze behavior, making it an affordable and effective approach for screening fly models with transgenic or environmental behavioral deficiencies. Examples of behavioral tests using pharmacologically treated flies are given to show how the techniques can detect behavioral changes in both adult flies and larvae in a highly repeatable manner.

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

The present protocol assesses the locomotor activity of Drosophila by tracking and analyzing the movement of flies in a hand-made arena using open-source software Fiji, compatible with plugins to segment pixels of each frame based on high-definition video recording to calculate parameters of speed, distance, etc.

Une technique simple pour doser l’activité locomotrice chez la drosophile

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

Foraging Protocole Chemin de longueur pour<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; larves

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a considerable amount of information has been generated regarding ORN responses to odorants, the role of specific ORNs in driving behavioral responses remains poorly understood. Complications in behavior analyses arise due to different volatilities of odorants that activate individual ORNs, multiple ORNs activated by single odorants, and the difficulty in replicating naturally observed temporal variations in olfactory stimuli using conventional odor-delivery methods in the laboratory. Here, we describe a protocol that analyzes Drosophila larval behavior in response to simultaneous optogenetic stimulation of its ORNs. The optogenetic technology used here allows for specificity of ORN activation and precise control of temporal patterns of ORN activation. Corresponding larval movement is tracked, digitally recorded, and analyzed using custom written software. By replacing odor stimuli with light stimuli, this method allows for a more precise control of individual ORN activation in order to study its impact on larval behavior. Our method could be further extended to study the impact of second-order projection neurons (PNs) as well as local neurons (LNs) on larval behavior. This method will thus enable a comprehensive dissection of olfactory circuit function and complement studies on how olfactory neuron activities translate in to behavior responses.

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

This protocol analyzes navigational behavior of Drosophila larva in response to simultaneous optogenetic stimulation of its olfactory neurons. Light of 630 nm wavelength is used to activate individual olfactory neurons expressing a red-shifted channel rhodopsin. Larval movement is simultaneously tracked, digitally recorded, and analyzed using custom-written software.

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model to study animal avoidance behavior. This protocol introduces a light-spot assay to investigate larval phototactic behavior. The experimental set-up includes two main parts: a visual stimulation system that generates the light spot, and an infrared light-based imaging system that records the process of larval light avoidance. This assay allows tracking of the behavior of larva before entering, during encountering, and after leaving the light spot. Details of larval movement including deceleration, pause, head casting, and turning can be captured and analyzed using this method.

Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis

This protocol introduces a light-spot assay to investigate Drosophila larval phototactic behavior. In this assay, a light spot is generated as light stimulation, and the process of larval light avoidance is recorded by an infrared light-based imaging system.

Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

The larvae of Drosophila melanogaster show obvious light-avoiding behavior during the foraging stage. Drosophila larval phototaxis can be used as a model ...

Tracking Freely Walking Flies: A Method to Assess Locomotion in Drosophila

Source: Sun, M. and Chen, L. L. <a href="https://www.jove.com/video/55602/" target="_blank">A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila</a>. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to track freely walking flies to assess their general locomotion ability. The featured protocol demonstrates the assay&#39;s setup and data analysis using video tracking software.

Traquer les mouches qui marchent librement : une méthode pour évaluer la locomotion chez la drosophile

Source: Sun, M. and Chen, L. L. A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila. J. Vis. Exp. (2017).
This video describes how to ...

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier

Résumé

Explorer plus de vidéos

Chapitres dans cette vidéo

Haute résolution de mesure du comportement Odor-Driven dans les larves de drosophile

L'utilisation de puces microfluidiques pour l'imagerie en direct et l'étude des réponses blessures en

Méthodes de dosage à Drosophila Comportement

Analyse fonctionnelle du circuit d'alimentation des larves dans Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Une technique simple pour doser l’activité locomotrice chez la drosophile

Foraging Protocole Chemin de longueur pour

Analyser le comportement larves de drosophile en réponse à une Stimulation des neurones olfactifs Optogenetic

Essai sur place légère pour l'analyse de Drosophila Larval Phototaxis

Traquer les mouches qui marchent librement : une méthode pour évaluer la locomotion chez la drosophile