This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Preparación del sobrenadante someterse a ensayo de Actividad <ol><li> Preparar una solución madre de 0,5 mg / ml de mitomicina C por disolución de la cantidad apropiada en estéril M MgSO 4 tampón 0.1 (por ejemplo, / 2 ml de tampón de 1 mg de mitomicina C). Stock de almacén a 4 ° C en un recipiente protegido de la luz (mitomicina C es sensible a la luz). </li><li> Inocular una sola colonia de P. syringae en 3 ml de medio B de King (KB) de caldo de 14. Incubar durante la noche con agitación (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> A la mañana siguiente, diluir el caldo de cultivo 1/100 en 3 ml de caldo de KB fresco. Incubar durante 3-4 horas con agitación a temperatura ambiente. Añadir mitomicina C (0,5 g / ml, concentración final). Incubar el cultivo durante la noche con agitación a temperatura ambiente. NOTA: La mitomicina C causa roturas de ADN de cadena doble, estimulando así la respuesta SOS de la célula, dando lugar a la producción tanto de bacteriófago y bacteriocinas. </li><li> Pellet 1-2 ml de mitomicina C inducida cultivos por centrifugación a 20.000 xg durante 5 min en una microcentrífuga de mesa de trabajo. </li><li> Retirar y esterilizar los sobrenadantes de cultivo, ya sea haciendo pasar el sobrenadante a través de un filtro de tamaño de poro 0,22 micras o por tratamiento del sobrenadante con cloroformo (100 cloroformo l por 1 ml de sobrenadante). <ol><li> Si se utiliza cloroformo y agitar la mezcla durante 15 segundos y dejar incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. NOTA: cloroformo mata eficazmente células mediante la solubilización de sus membranas. El beneficio del uso de cloroformo durante la esterilización del filtro es que es más barato y más fácil de aumentar la escala de si el procesamiento de muchos (&gt; 20) muestras a la vez. Puede haber una posibilidad de que una actividad de eliminación dada se pierde después del tratamiento cloroformo como resultado de la partición en la fase orgánica. </li><li> Retire la fase acuosa superior utilizando una pipeta de 1 ml a un nuevo máximo, estériles 1,5 ó 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenga cuidado de no transferir cualquiera de la capa inferior de cloroformo (es mejor para eliminar menos de la fase acuosa para evitar arrastre). </li><li> Incubar el sobrenadante se transfirió destapado en una campana de ventilación para permitir que el cloroformo residual se evapore (varias horas). sobrenadantes se almacenan a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Separación y concentración de alto peso molecular compuestos bactericidas por Polietilenglicol Precipitación (PEG) <ol><li> Al sobrenadante estéril, añadir NaCl y PEG 8000 hasta 1 M y 10% concentraciones finales, respectivamente. Repetidamente invertir la muestra hasta que tanto el NaCl y PEG se haya disuelto por completo. Incubar las muestras en un baño de hielo durante 1 hora o durante la noche a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las muestras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. Un pellet debe formar en la parte inferior del tubo de centrífuga. Decantar el sobrenadante y resuspender el sedimento en el volumen deseado (por ejemplo, un décimo o un centésimo del sobrenadante original, volume) de tampón (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) mediante pipeteo repetido. </li><li> Eliminar PEG residual por dos extracciones secuenciales con un volumen igual de cloroformo. <ol><li> Combinar con cloroformo precipitado resuspendido y agitar durante 10 segundos y 15 segundos, a continuación, se centrifuga la mezcla a 20.000 xg durante 5 min. Pasar la fase acuosa superior a un tubo de microcentrífuga. Repetir esta extracción hasta que no interfase blanca entre la fase acuosa y orgánica es visible (por lo general 2 extracciones en total). Permitir cloroformo residual se evapore a partir de sobrenadantes extraídos en una campana de humos. </li></ol></li></ol> 3. Preparación de superposición y sobrenadantes para la Actividad <ol><li> Se inocula una sola colonia de una cepa de P. syringae a ensayar para la sensibilidad en 3 ml de KB, se incuba durante la noche con agitación a temperatura ambiente. </li><li> A la mañana siguiente, volver a diluir la cultura 1/100 en KB fresco. Incubar 3-4 horas con agitación a temperatu de la habitaciónre. </li><li> Preparar agar agua esterilizada en autoclave una suspensión 0,35-0,7% de agar en agua ultrapura (v / w). NOTA: Un balance de agar agua blanda se puede fundir en el microondas y reutilizarse varias veces, superposición fresca no tiene que estar preparado para cada experimento. Si se vuelve a utilizar agar agua, es fundamental para asegurar que se derrita por completo tras el microondas. Si no, el recubrimiento tendrá una textura granulada en solidificación que hará difícil interpretación. Si esto ocurre, fundir el agar durante varios minutos más largos en el microondas de hecho previamente. </li><li> Mantener el agar blando fundido en un baño de agua C 60 ° antes de su uso. Con una pipeta serológica estéril, la transferencia de 3 ml de agar blando a un tubo de cultivo estéril. Vuelva a colocar el tubo de cultivo de baño de agua para mantener en un estado fundido. </li><li> Para verter la superposición, deje que el agar fundido se enfríe (que debe sentirse tibia, no caliente al tacto), pero no permita que se solidifique. </li><li> En una campana estéril, inocular 100 l dela cultura cepa de ensayo en el agar suave y agitar para mezclar. Girar la cultura con la mano durante 10-15 segundos, luego se vierte en una parte inferior de agar (agar KB). Inclinar la placa en todas las direcciones para asegurar el agar blando cubre uniformemente el agar inferior. NOTA: Este medio puede ser cualquier parte inferior (1,5% de agar) medio solidificado en la que la cepa de ensayo crece vigorosamente. Para un diámetro del plato estándar de Petri de 100 mm, use ~ 20 ml fundieron medio. El agar parte inferior se puede preparar varias semanas antes de tiempo (si se mantiene a 4 ° C sin secado) o pueden ser preparados el mismo día. Si se prepara el mismo día de la realización de la superposición, lo mejor es hacerlo antes de la etapa 3.4. </li><li> Cubrir la placa y dejar que se solidifique 20-30 min. Tenga cuidado de no molestar a la placa, mientras que la solidificación. </li><li> Una vez solidificado, Colocar 2,5 l de sobrenadante (generada en las secciones 1 y 2, más arriba) sobre la superposición. Permitir a las placas para incuban durante la noche a temperatura ambiente. Observar y registrar los resultados de la mañana siguiente. NOTA:puede ser útil para realizar y detectar a partir de una dilución en serie del sobrenadante. Esto permitirá a los investigadores distinguir entre el bacteriófago y la actividad de compensación bacteriocina. En este caso, se recomienda llevar a cabo 1: 5 o diluciones 1:10. </li></ol>

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	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La técnica de superposición de agar blando se describe aquí se ha aplicado ampliamente para muchas décadas por los investigadores interesados ​​en bacteriófagos o bacteriocinas. Los principales beneficios de este enfoque son que es simple, barato y relativamente fácil de interpretar. Mediante la combinación de la superposición en agar blando con precipitación con PEG y de dilución en serie, los agentes antimicrobianos se pueden separar en altas frente a agentes de bajo peso molecular, y replicativas vs. no replicativo agentes (es decir, bacteriófago vs. tailocin, respectivamente). Finalmente, la incorporación de manipulación dirigida genética (supresión y complementación) de bacteriocina putativo o loci profago puede establecer firmemente la identidad de un compuesto antagonista dado. Recientemente, hemos utilizado este método para describir un nuevo derivado del bacteriófago bacteriocina frecuente entre las cepas de Pseudomonas syringae 9. Los medios de cultivo y condiciones indicados en el presente trabajo protocolo bien para Pseudomonas SYringae y probablemente sería suficiente para otras bacterias Gram-negativas que crecen vigorosamente bajo estas condiciones. Sin embargo, los investigadores que usan este método se desea optimizar el tiempo, medio de cultivo, el método de inducción, y la temperatura de incubación para su sistema. Los parámetros críticos incluyen la inducción de la producción de cultivo, mientras que en la fase de crecimiento logarítmica, así como la siembra de la superposición en agar blando con suficiente cultivo en fase logarítmica para asegurar una distribución uniforme de bacterias, pero no excesiva cultura, que oscurecer posibles zonas de compensación. Hay muchos bacteriocinas que no son inducidas como parte de la respuesta SOS, sino que son inducidos a través de sistemas de detección de quórum basados en péptidos (en particular, las bacteriocinas Gram-positivas 15), por lo tanto, un investigador puede querer evaluar a varios métodos de inducción diferentes (por ejemplo, modificar el contenido de nutrientes del medio inductor, o permitir que para la incubación ampliada de la cepa productora). Cuando usasesta técnica, la superposición en agar blando debe ser fundido a fondo y se mantiene a 55-60 ° C antes de la adición de la cepa de la siembra. Hemos tenido varios experimentos en los que el agar blando no se funde completamente (aunque visualmente que parecía ser) y dio lugar a una superposición con un aspecto granulado. Los resultados de una superposición de granulado pueden todavía ser generalmente interpretable, sin embargo, esto depende de la fuerza de la inhibición (inhibición más débil será más difícil de observar). A, variable de confusión final a considerar cuando se utiliza esta técnica es que se permite que la temperatura del agar fundido suficiente tiempo para enfriarse antes de la inoculación con la cepa de la siembra, con el fin de evitar la muerte de la cepa de la siembra. Para evitar este problema, nos aseguramos el agar blando es cálido, pero no caliente, para tocar. En esta línea, también hemos observado que si nos damos un tiempo inadecuado para un cultivo de siembra para aclimatarse a la agar fundido, antes de verter la superposición, que se recuperan generalmente pobre g bacterianarecimiento, que hace que la interpretación de la inhibición específica difícil o imposible de interpretar. Esto es por qué permitimos 10-15 segundos adicionales de incubación entre la vórtex y vertiendo la superposición. El equilibrio entre el mantenimiento de la agar en un estado completamente fundido (más caliente es mejor) pero no letal para la cepa de siembra (más caliente no es mejor) es uno que probablemente tendrá que ser determinado por un investigador a través de ensayo y error. Si se utiliza una etapa de precipitación con PEG, sería beneficioso incluir un control negativo donde un medio de caldo estéril se procesa de forma idéntica al sobrenadante del cultivo. Esto asegurará que la muerte de actividad no es el resultado de PEG residual o cloroformo en el sobrenadante de la muestra. Como ambos bacteriófagos y bacteriocinas tienden a ser altamente específico, no es raro encontrar ninguna actividad de eliminación aparente con una combinación dada de cepas. Esto puede resultar de una variedad de re-cepa específicasistance mecanismos, uno de ellos que la cepa de ensayo o bien carece o tiene una versión no reconocida de los receptores necesarios para la orientación de una bacteriocina o bacteriófago dado. Un método alternativo, el método de detección de bacteriocina ha sido descrito por Kawai et al. , Pero adolece de inconvenientes y no ha sido ampliamente adoptado 16. Específicamente, esta técnica requiere la observación de muestras de caldo a intervalos de tiempo que pueden ser una carga, y no permite que para la discriminación entre las actividades de matanza-bacteriófagos derivados y derivados de bacteriocina. Las principales limitaciones de esta técnica es que no es muy adecuado para los organismos que no crecen robustamente (y por lo tanto se verá privada de zonas de compensación fácilmente discernibles) o que prophages puerto o bacteriocinas que no se producen robusta en condiciones de laboratorio. La adaptación de esta técnica para detectar las bacteriocinas producidas en muestras ambientales que tanto ampliar la utilidadde esta técnica y facilitar una mayor comprensión de la función de las bacteriocinas dentro de un ambiente natural.

Recientemente, ha habido un interés significativo en la profundización de nuestra comprensión de la ecología microbiana (en particular las microbiomas de varios ambientes), así como nuevos compuestos antibacterianos para utilizar en la lucha contra los patógenos resistentes a los antibióticos 1,2. Un tema de la interconexión entre estos intereses es la comprensión de las interacciones antagónicas entre las cepas bacterianas en su ambiente natural. Existen numerosas formas en que las bacterias antagonizan competidores 3. Las bacteriocinas, un grupo diverso de compuestos proteicos, antibacterianos, durante mucho tiempo han sido estudiados por su papel en la mediación de antagonismo interbacterial, con dos de las especies más estudiadas son Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli 4,5 6, importantes patógenos humanos. Además de bacteriocinas, prophages inducidos también pueden actuar como agentes anticompetitor, lo que permite una cepa de invadir en un nicho que ya está colonizada 7. Pseudomonas syringae es un patógeno de la planta conocida para producir una gran variedad de agentes antimicrobianos, incluyendo bacteriocinas sola proteína 8, bacteriocinas de la cola de bacteriófagos derivados de 9 (denominados tailocins), así como metabolitos secundarios no proteínicos 10. Recientemente ha habido interés en la comprensión de cómo estos antimicrobianos influyen en la ecología de este organismo, así como la forma en que se pueden aprovechar para el control de enfermedades de las plantas 11. Un método ampliamente utilizado para el estudio de ambas bacteriocinas y bacteriófago es la técnica de superposición en agar blando. Este método fue descrito por primera vez por Gratia en 1936 para ayudar en la enumeración de bacteriófago 12,13. Aquí se describe la aplicación del método de superposición en agar blando, en combinación con la manipulación genética dirigida y precipitación con polietilenglicol (PEG), para distinguir entre los tres agentes antimicrobianos diferentes (un bacteriófago, un bact de alto peso moleculareriocin, y una bacteriocina de bajo peso molecular) producida por una única cepa bacteriana. El beneficio de este enfoque es que es relativamente simple y barato, por lo que, a pesar de ser decididamente &#39;baja tecnología&#39;, todavía se utiliza ampliamente.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

La técnica de superposición de agar blando se desarrolló originalmente hace más de 70 años y ha sido ampliamente utilizado en varios campos de investigación microbiológica, incluyendo el trabajo con los bacteriófagos y bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicos. Este enfoque es relativamente barato, con requisitos mínimos de recursos. Esta técnica consiste en la detección de sobrenadante de una cepa donante (potencialmente albergar un compuesto (s) tóxico) sobre una capa de agar blando solidificada que se siembra con una cepa de prueba bacteriana (potencialmente sensible al compuesto tóxico (s)). Hemos utilizado esta técnica para seleccionar una biblioteca de cepas de Pseudomonas syringae para matar intraespecífica. Mediante la combinación de este método con una etapa de precipitación y deleciones de genes específicos, múltiples compuestos tóxicos producidos por la misma cepa se pueden diferenciar. Los dos agentes antagónicos comúnmente recuperados usando esta técnica son bacteriófagos y bacteriocinas. Estos dos agentes se pueden distinguir empleandodos pruebas adicionales simples. Realización de una dilución en serie en un sobrenadante que contenía bacteriófago se traducirá en placas individuales haciéndose menos en número con mayor dilución, mientras que la dilución en serie de un sobrenadante que contiene bacteriocina resultará una zona de compensación que se hace uniforme más turbia con mayor dilución. Además, un bacteriófago producirá una zona de compensación cuando manchado sobre una capa de agar blando fresco sembrado con la misma cepa, mientras que una bacteriocina no producirá una zona de compensación cuando se transfiere a un césped de agar blando fresco, debido a la dilución de la bacteriocina.

La combinación de la capa de agar blando y precipitación con PEG se puede utilizar para identificar y caracterizar los diferentes agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La figura 1 muestra dos cepas de P. syringae (A y B) que se inhibe por tercera cepa de la misma especie. Las dos cepas, sin embargo, son inhibidas por diferentes bacteriocinas. La zona de intercambio de información sobre la cepa A presenta un borde afilado, mientras que la zona de intercambio de información sobre la cepa B es más grande, y presenta un borde no cortante. Las manipulaciones genéticas dentro de la cepa que produce que inactivan específicamente ya sea la tailocin (tailocin deficiente) o de bajo peso molecular bacteriocina de confirmación (bacteriocina deficiente) que las cepas A y B son sensibles a bacteriocinas distintos. La Figura 2 muestra que la matanza bacteriófago mediada se puede distinguir de otros antimicrobianos no replicativos mediante la comparación de una serie de dilución. Debido a que ambas bacteriocinas yprofago puede ser inducida por el tratamiento con mitomicina C, las actividades de estos dos agentes pueden se parecen mucho unos a otros (en particular si el fago activado es abundante). En el caso de la compensación bacteriófago mediada, la dilución del sobrenadante resolverá en placas individuales (zonas de compensación), mientras que de facilitación bacteriocina mediada no resolverá en tales placas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: distinción fenotípica de múltiples agentes antimicrobianos producidos por la misma cepa. La cepa A es sensible a una bacteriocina de alto peso molecular (tailocin), pero no un peso molecular bajo alternativa bacteriocina, como se evidencia por la falta de limpieza de la cepa deficiente en tailocin, pero no la cepa deficiente de bacteriocina. Por el contrario, la cepa B es insensible a la tailocin, pero es sensible a la bacteriocina de bajo peso molecular. El tailocin es efficiently recuperada tras la precipitación con PEG, mientras que las bacteriocinas de bajo peso molecular no lo son. WT = tipo salvaje. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: Distinguir entre los antimicrobianos y bacteriófagos no replicativa. (A) La dilución de un título elevado de bacteriófagos resultados en placas individuales que se convierten en menos numerosos (parte superior de alto título, bajo el título de abajo). (B) La dilución de los resultados de bacteriocinas en menos uniformemente claro que no se resuelve en placas individuales. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.3K vistas.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Uso de la superposición de ensayo para medir cualitativamente la producción bacteriana y sensibilidad hacia neumocócica bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Investigación

Inmunología e Infección

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologías para el estudio<em&gt; B. subtilis</em&gt; Las biopelículas como modelo para la caracterización de Pequeño Biofilm inhibidores de moléculas

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Técnicas de laboratorio asépticas: Métodos de Revestimiento

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biología

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Detección de alto rendimiento de compuestos químicos para dilucidar sus efectos sobre la persistencia bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Crecimiento diferida Ensayo de inhibición para cuantificar el efecto de antimicrobianos de bacterias derivadas de la Competencia

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Un método para evaluar los efectos de bacteriocinas en la microbiota intestinal de ratones

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

Ensayo de formación de colonias de agar blando: un método para probar los efectos de nuevos compuestos en la proliferación de células cancerosas

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Investigación sobre el cáncer

Cáncer de mama

Estudios in vitro

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

Un ensayo de biopelícula de placa de clavija para el cribado de agentes antibacterianos

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

El uso de la técnica de superposición Soft-agar para la detección de compuestos inhibidores en bacterias producidas

Resumen

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