This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Preparação de sobrenadante a ser testados à actividade <ol><li> Prepara-se uma solução de estoque de 0,5 mg / ml de mitomicina C por dissolução da quantidade apropriada em M estéril MgSO4 tampão de 0,1 (por exemplo, 1 mg de mitomicina C / 2 ml de tampão). estoque Armazenar a 4 ° C num recipiente protegido da luz (mitomicina C é sensível à luz). </li><li> Inocular uma única colónia de P. syringae em 3 ml de meio B de King (KB) de caldo 14. Incubar durante a noite com agitação (200 rpm) à temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> Na manhã seguinte, dilui-se a cultura de caldo de 1/100 em 3 ml de caldo fresco KB. Incubar durante 3-4 horas com agitação à temperatura ambiente. Adicionar mitomicina C (0,5 ug / ml, concentração final). Incubar a cultura durante a noite com agitação à temperatura ambiente. NOTA: A mitomicina C provoca quebras de ADN de cadeia dupla, estimulando assim a resposta SOS da célula, levando à produção de ambos bacteriófago e bacteriocinas. </li><li> Pellet 1-2 ml de mitomicina C culturas induzidas por centrifugação a 20000 xg durante 5 minutos numa microcentrífuga de bancada. </li><li> Remover e esterilizar os sobrenadantes da cultura, quer por passagem do sobrenadante através de um filtro de tamanho de poro de 0,22 um, ou por tratamento do sobrenadante com clorofórmio (100 ul de clorofórmio por cada 1 ml de sobrenadante). <ol><li> Se usando clorofórmio, vortex a mistura durante 15 segundos e deixar incubar à temperatura ambiente durante 1 h. Após a incubação, centrifugar a mistura a 20000 xg durante 5 min. NOTA: Clorofórmio eficazmente mata células por solubilização de suas membranas. O benefício da utilização de clorofórmio, durante a esterilização de filtro é que é mais barato e mais fácil de dimensionar-se se o processamento de muitos (&gt; 20) amostras de cada vez. Pode haver uma possibilidade de que uma dada actividade de morte é perdido após o tratamento com clorofórmio como resultado da partição para a fase orgânica. </li><li> Remover a fase superior, aquosa, utilizando uma pipeta de 1 ml para um fresco, esterilizado de 1,5 ou 2,0 mltubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não transferir qualquer da camada de clorofórmio inferior (que é melhor para remover menos da fase aquosa para evitar carry-over). </li><li> Incubar o sobrenadante transferido destampei em um exaustor para permitir que o clorofórmio residual para evaporar (várias horas). sobrenadantes armazenar a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Separação e Concentração de Elevado Peso Molecular Os compostos bactericidas por polietilenoglicol (PEG) Precipitação <ol><li> Para o sobrenadante estéril, adicionar NaCl e PEG 8000 a concentrações finais de 1 H e 10%, respectivamente. Repetidamente inverter a amostra até que tanto o NaCl e PEG são completamente dissolvido. Incubar as amostras num banho de gelo durante 1 hora ou durante a noite a 4 ° C. </li><li> Centrifugar as amostras a 16.000 xg durante 30 min a 4 ° C. A pelete deve formar, na parte inferior do tubo de centrifugação. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em volume desejado (por exemplo, 1/10 ou 1/100 do volume original é sobrenadanteUME) de tampão (Tris 10 mM, MgSO4 10 mM, pH 7,0) por pipetagem repetida. </li><li> Remover PEG residual por duas extracções sequenciais com um volume igual de clorofórmio. <ol><li> Combinar clorofórmio com o sedimento ressuspenso e vortex durante 10 a 15 segundos, em seguida, centrifuga-se a mistura a 20000 xg durante 5 min. Transferir a fase superior, aquosa para um tubo de microcentrífuga novo. Repetir esta extracção até branco sem interface entre a fase aquosa e orgânica é visível (normalmente 2 extracções no total). Permitir clorofórmio residual a evaporar-se a partir de sobrenadantes extraídos numa hotte. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de sobreposição e Testes sobrenadantes para Atividade <ol><li> Inocular uma colónia isolada de uma estirpe de P. syringae a ser testada para a sensibilidade em 3 mL de KB, incubar durante a noite com agitação à temperatura ambiente. </li><li> Na manhã seguinte, de volta diluir a cultura 1/100 em KB fresco. Incubar 3-4 horas com agitação a temperatu quartoré. </li><li> Prepare agar água esterilizada por autoclavagem uma suspensão 0,35-0,7% de agar em água ultrapura (v / w). NOTA: Um estoque de agar água macia pode ser derretido em um forno de microondas e reutilizado várias vezes, sobreposição fresco não precisa estar preparado para cada experimento. Se agar água é reutilizada, é fundamental para garantir que ele é completamente derretido seguinte microondas. Se não, a sobreposição terá uma textura granulada mediante solidificação que vai fazer difícil interpretação. Se isto ocorrer, derreter o agar durante vários minutos mais longos do que no microondas feito anteriormente. </li><li> Manter o agar mole fundido num banho de água a 60 ° C antes de usar. Usando uma pipeta serológica estéril, transferência de 3 ml de agar mole para um tubo de cultura estéril. Devolver o tubo de cultura com banho de água para manter num estado fundido. </li><li> Para verter a superposição, primeiro permitir que o agar derretido para se refrescar (que deve sentir-se quente, mas não quente ao toque), mas não permita solidificar. </li><li> Numa hote estéril, inocular 100 ml dea cultura da estirpe de teste em agar mole e agitar com vortex para misturar. Gire a cultura com a mão por 10-15 segundos, em seguida, despeje em um agar de fundo (KB agar). Inclinar a placa em todas as direcções para garantir o agar mole cobre uniformemente o ágar de fundo. NOTA: O ágar de fundo pode ser qualquer (1,5% de agar) meio solidificado em que a estirpe de teste cresce vigorosamente. Para um diâmetro de 100 mm numa caixa de Petri padrão, utilizar ~ 20 ml de meio derretida. O ágar de fundo pode ser preparado de várias semanas antes do tempo (se mantida a 4 ° C sem secagem) ou podem ser preparadas no mesmo dia. Se preparou o mesmo dia em que realizar a sobreposição, é melhor fazê-lo antes do passo 3.4. </li><li> Cobrir a placa e permitir que ele 20-30 minutos para solidificar. Tenha cuidado para não perturbar o prato enquanto solidificando. </li><li> Uma vez solidificado, spot 2-5 jul de sobrenadante (gerado nas secções 1 e 2, acima) sobre a sobreposição. Permitir que as placas a incubar durante a noite à temperatura ambiente. Observe e resultados recordes na manhã seguinte. Anotepode ser útil para realizar e identificar a partir de uma diluição em série do sobrenadante. Isso permitirá que os pesquisadores a distinguir entre bacteriófagos e da atividade de compensação bacteriocina. Neste caso, recomenda-se realizar a 1: 5 ou 1:10 diluições. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

A técnica de sobreposição-ágar mole descrita aqui tem sido amplamente aplicada por muitas décadas por pesquisadores interessados ​​em bacteriófagos ou bacteriocinas. Os principais benefícios desta abordagem é que ela é simples, barato e relativamente fácil de interpretar. Ao combinar a sobreposição soft-agar com precipitação com PEG e diluição em série, os agentes antimicrobianos podem ser separados em elevado vs agentes de baixo peso molecular, e replicativas versus não-replicativo agentes (isto é, contra bacteriófagos tailocin, respectivamente). Finalmente, a incorporação de manipulação genética alvo (supressão e complementação) de bacteriocina putativo ou loci profago firmemente pode determinar a identidade de um dado composto antagonista. Nós temos usado recentemente este método para descrever um novo bacteriófago derivado bacteriocina prevalente entre Pseudomonas syringae estirpes 9. Os meios de crescimento e condições indicadas neste trabalho protocolo bem para Pseudomonas syringae e provavelmente suficiente para outras bactérias gram-negativas que crescem vigorosamente sob estas condições. No entanto, os investigadores usam este método vai quer para optimizar o tempo, o meio de cultura, o método de indução, temperatura de incubação e para o seu sistema. Os parâmetros críticos incluem induzir a produção de cultura, enquanto na fase logarítmica de crescimento, bem como a sobreposição semeando soft-agar com cultura em fase logarítmica suficiente para assegurar uma distribuição uniforme bacteriana, mas não excessiva da cultura, o que irá obscurecer zonas de compensação potenciais. Existem muitas bacteriocinas que não são induzidos como parte da resposta SOS, mas sim são induzidos através de sistemas de sensor de quorum baseados em péptidos (particularmente bacteriocinas Gram-positivas 15), assim, um investigador pode querer rastrear vários métodos diferentes de indução (tais como a modificação do conteúdo de nutrientes de induzir médio, ou permitindo a incubação prolongada da estirpe produtora). quando se utilizaNesta técnica, a sobreposição soft-agar deve ser completamente derretida e mantida a 55-60 ° C antes da adição da estirpe semeadura. Tivemos várias experiências em que o agar mole não foi completamente derretido (embora visualmente parecia ser) e resultou em uma sobreposição com um aspecto granulado. Os resultados de um granulado de sobreposição pode ainda ser geralmente interpretável, no entanto, esta é dependente da força de inibição (inibição mais fraca será mais difícil de observar). Um, variável de confusão final a considerar quando se utiliza esta técnica é que a temperatura do fundido de ágar é permitido tempo suficiente para arrefecer antes da inoculação com a estirpe de sementeira, de modo a evitar a morte da estirpe de semeadura. Para evitar esse problema, podemos garantir a-agar macio é quente, mas não quente, ao toque. Ao longo destas linhas, também observamos que se dar tempo inadequado para uma cultura de semeadura para se aclimatar ao agar fundido, antes de despejar a sobreposição, recuperamos geralmente pobres g bacterianaRESCIMENTO, o que torna a interpretação de inibição específica difícil ou impossível de interpretar. É por isso que permitem 10-15 segundos adicionais de incubação entre vórtex e despejando a sobreposição. O trade-off entre a manutenção do agar em um estado completamente fundido (mais quente é melhor), mas não letal para a estirpe semeadura (mais quente não é melhor) é aquele que provavelmente terá de ser determinada por um investigador através de tentativa e erro. Se um passo de precipitação de PEG é utilizada, seria benéfico incluir um controlo negativo, onde um meio de caldo estéril é processado identicamente ao sobrenadante da cultura. Isto irá assegurar que matar actividade não é o resultado de PEG residual ou clorofórmio dentro do sobrenadante da amostra. Como ambos os bacteriófagos e bacteriocinas tendem a ser altamente específico, não é incomum encontrar nenhuma actividade de morte aparente, com uma dada combinação de estirpes. Isto pode resultar de uma variedade de re-específica estirpemecanismos sistência, sendo um deles de que a tensão testador quer faltas ou tem uma versão não reconhecida do receptor necessário para a segmentação por um determinado bacteriocina ou bacteriófago. Um método alternativo, o método de rastreio de bacteriocina foi descrito por Kawai et al. , Mas sofre de desvantagens e não foi amplamente adotado 16. Especificamente, esta técnica requer observando amostras de caldo a intervalos de tempo que pode ser pesada, e não permite a discriminação entre as actividades de matança de bacteriófagos derivada e derivada bacteriocina. As principais limitações desta técnica é que ele não é bem adequado para os organismos que não crescem de forma robusta (e, assim, faltará zonas de compensação facilmente discerníveis), ou que prophages porto ou bacteriocinas que não são robustamente produzidos sob condições de laboratório. Adaptação desta técnica para detectar bacteriocinas produzidas em amostras ambientais que tanto expandir o utilitáriodesta técnica e facilitar um maior conhecimento sobre o papel das bacteriocinas dentro de ambientes naturais.

Recentemente, tem havido um interesse significativo em aprofundar a compreensão da ecologia microbiana (particularmente os microbiomas de vários ambientes), bem como novos compostos anti-bacterianos para uso no combate a agentes patogénicos resistentes aos antibióticos 1,2. Um tema de interligação entre estes interesses é compreender as interacções antagonistas entre estirpes de bactérias em seu ambiente natural. Há inúmeras maneiras em que as bactérias antagonizam concorrentes 3. Bacteriocinas, um grupo diversificado de compostos proteicos, antibacterianos, têm sido estudados para determinar seu papel na mediação antagonismo interbacterial, com duas das espécies mais estudadas sendo Pseudomonas aeruginosa 4,5 e Escherichia coli 6, importantes patógenos humanos. Além de bacteriocinas, profagos induzidas também podem agir como agentes anticompetitor, permitindo uma estirpe para invadir um nicho que já é colonizada 7. Pseudomonas syringae é um agente patogénico de plantas conhecido por produzir uma variedade de agentes antimicrobianos, incluindo bacteriocinas única proteína 8, bacteriocinas derivado de cauda de bacterióf agos (9 tailocins denominados), bem como metabolitos secundários não proteináceos 10. Recentemente, tem havido interesse em compreender como estes antimicrobianos influenciar a ecologia deste organismo, bem como a forma como eles podem ser aproveitados para controlar doenças de plantas 11. Um método amplamente utilizado para estudar ambos bacteriocinas e bacteriófago é a técnica de sobreposição de soft-agar. Este método foi descrito pela primeira vez por Gratia em 1936 para a ajuda ao enumerar bacteriófago 12,13. Aqui descreve-se a aplicação do método da sobrecamada de ágar mole, em combinação com a manipulação genética direccionada e polietileno glicol precipitação (PEG), para distinguir entre os três agentes antimicrobianos diferentes (um bacteriófago, um elevado peso molecular Bacteriocin, e um baixo peso molecular bacteriocina) produzido por uma única estirpe bacteriana. A vantagem dessa abordagem é que é relativamente simples e barato, que é por isso que, apesar de ser decididamente &#39;low-tech&#39;, ainda é amplamente utilizado.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

A técnica de sobreposição-ágar mole foi originalmente desenvolvido mais de 70 anos atrás e tem sido amplamente utilizada em várias áreas de investigação microbiológica, incluindo o trabalho com bacteriófagos e bacteriocinas, agentes antibacterianos proteicas. Esta abordagem é relativamente barata, com o mínimo de requisitos de recursos. Esta técnica consiste em detectar sobrenadante a partir de uma estirpe dadora (potencialmente tóxico que alberga um composto (s)) sobre uma camada de agar macio solidificada que é semeado com uma estirpe bacteriana de ensaio (potencialmente sensíveis ao composto tóxico (s)). Nós utilizamos esta técnica para rastrear uma biblioteca de Pseudomonas syringae estirpes de morte intra-específica. Ao combinar esta abordagem com um passo de precipitação e deleções de genes-alvo, vários compostos tóxicos produzidos pela mesma estirpe podem ser diferenciadas. Os dois agentes antagônicos comumente recuperados usando esta técnica são bacteriófagos e bacteriocinas. Estes dois agentes podem ser diferenciadas usandodois testes adicionais simples. A realização de uma diluição em série de um sobrenadante contendo o bacteriófago resultará em placas individuais se tornando menos em número com uma maior diluição, enquanto que a diluição em série de um sobrenadante contendo bacteriocina resultará uma zona de compensação, que se torna mais uniformemente turvo com uma maior diluição. Além disso, um bacteriófago vai produzir uma zona de compensação, quando visto numa camada de agar macio fresco semeada com a mesma estirpe, ao passo que uma bacteriocina não vai produzir uma zona de compensação, quando transferidos para um relvado agar mole fresco, devido à diluição da bacteriocina.

A combinação da camada de agar macio e precipitação com PEG pode ser utilizado para identificar e caracterizar diferentes agentes antimicrobianos produzidos pela mesma estirpe. A Figura 1 mostra duas estirpes de P. syringae (A e B) que são inibidas por uma terceira estirpe da mesma espécie. As duas estirpes, no entanto, são inibidos por diferentes bacteriocinas. A zona de clareira na estirpe A exibe uma borda afiada, enquanto que a zona de clareira na estirpe B é maior, e exibe uma borda não afiada. manipulações genéticas dentro da estirpe produtora que, especificamente inactivar ou o tailocin (tailocin deficiente) ou baixo peso molecular bacteriocina confirm (bacteriocina deficiente) que estirpes A e B são sensíveis às bacteriocinas distintas. A Figura 2 mostra que a morte mediada por de bacteriófago podem ser distinguidos de outros agentes antimicrobianos não-replicativas comparando uma série de diluição. Porque ambas as bacteriocinas eprofago pode ser induzida por tratamento mitomicina C, as actividades destes dois agentes podem se assemelham uns aos outros (em particular se o fago activado é abundante). No caso de compensação mediada por bacteriófagos, a diluição do sobrenadante vai resolver em placas individuais de compensação (zonas) enquanto compensação bacteriocina mediada não resolver em tais placas. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: diferenciação fenotípica de vários agentes anti-microbianos produzidos pela mesma estirpe. A estirpe A é sensível a uma bacteriocina de elevado peso molecular (tailocin), mas não um peso molecular baixo alternativa bacteriocina, tal como evidenciado pela falta de compensação na estirpe deficiente tailocin, mas não a bacteriocina estirpe deficiente. Por outro lado, a estirpe B é insensível à tailocin, mas é sensível à bacteriocina baixo peso molecular. O tailocin é efficiently recuperado após precipitação com PEG, enquanto bacteriocinas de baixo peso molecular não são. WT = tipo selvagem. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: A distinção entre antimicrobianos não-replicativas e bacteriófagos. (A) A diluição de um alto título de bacteriófagos resultados em placas individuais que se tornam menos numerosas (topo de título elevado, baixo título inferior). (B) Diluição de bacteriocinas resultado em uniformemente menos compensação que não se resolve em placas individuais. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.1K visualizações.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Vídeo: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Usando a sobreposição de ensaio para medir qualitativamente produção bacteriana e sensibilidade para pneumocócica Bacteriocinas

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Imunologia e Infecção

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Estabelecimento de um programa de configuração de alta capacidade para a triagem de pequenas moléculas que modulam c-di-GMP Sinalização<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologias para o estudo<em&gt; B. subtilis</em&gt; Os biofilmes como um modelo para a caracterização de pequena molécula biofilme Inibidores

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Assépticas Técnicas de Laboratório: Métodos Plating

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologia

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Triagem de alto rendimento de compostos químicos para elucidar seus efeitos na persistência bacteriana

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Crescimento diferido Ensaio de Inibição para quantificar o efeito de antimicrobianos bactérias derivadas de concorrência

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Um método para avaliar os efeitos da bacteriocina na microbiota intestinal de ratos

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www.jove.com/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

Ensaio de formação de colônias de ágar mole: um método para testar os efeitos de novos compostos na proliferação de células cancerígenas

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Pesquisa do câncer

Câncer de mama

Estudos in vitro

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

Um ensaio de biofilme de placa de Peg para triagem de agentes antibacterianos

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Imunologia

Imunodiagnóstico

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

Um ensaio de inibição de crescimento diferido para avaliar o efeito de compostos antimicrobianos derivados de bactérias

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

Resumo

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