This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Herstellung von Supernatant sein, um nach Aktivität getestet <ol><li> Bereiten Sie eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Mitomycin C durch die entsprechende Menge in sterile 0,1 M MgSO 4 Puffer Auflösung (zB 1 mg Mitomycin C / 2 ml Puffer). Shop Lager bei 4 ° C in einem lichtgeschützten Behälter (Mitomycin C ist lichtempfindlich). </li><li> Impfen eine einzige Kolonie von P. syringae in 3 ml Königs Medium B (KB) Brühe 14. Inkubieren über Nacht unter Schütteln (200 rpm) bei Raumtemperatur (21-25 ° C). </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen Sie die Brühe Kultur 1/100 in 3 ml frisches KB Brühe. Inkubieren für 3-4 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur. In Mitomycin C (0,5 ug / ml, Endkonzentration). Inkubieren der Kultur über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. HINWEIS: Mitomycin C verursacht doppelsträngigen DNA-Brüche, wodurch die Reaktion SOS Zelle stimulierenden, was zur Produktion von sowohl Bakteriophagen und Bacteriocinen. </li><li> Pellet 1-2 ml Mitomycin C Kulturen durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 5 min in einer Tischmikro induziert. </li><li> Entfernen und sterilisieren Kulturüberstand entweder durch den Überstand durch einen Filter von 0,22 um Porengröße vorbei oder durch den Überstand mit Chloroform Behandlung (100 ul Chloroform pro 1 ml Überstand). <ol><li> Wenn unter Verwendung von Chloroform, Strudel der Mischung für 15 Sekunden und lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation Zentrifugation der Mischung bei 20.000 × g für 5 min. HINWEIS: Chloroform effizient tötet Zellen, die durch ihre Solubilisierung von Membranen. Der Vorteil von Chloroform über Filtersterilisation ist, daß es billiger und einfacher ist, zu einer Zeit, viele (&gt; 20) -Proben maßstabs-up, wenn die Verarbeitung. Es kann eine Möglichkeit sein, dass eine gegebene Tötungsaktivität nach Chloroformbehandlung als Folge der Unterteilung in die organische Phase verloren geht. </li><li> Entfernen Sie die obere, wässrige Phase mit einer 1-ml-Pipette in ein frisches, steriles 1,5 oder 2,0 mlMikrozentrifugenröhrchen. Seien Sie vorsichtig, nicht von der unteren Chloroformschicht zu übertragen (es ist besser, zu entfernen, weniger von der wässrigen Phase Übertrag zu vermeiden). </li><li> Inkubieren des übertragenen Überstand in einem Abzug nicht begrenzten das restliche Chloroform verdampfen zu lassen (mehrere Stunden). Store-Überstände bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Trennung und Konzentration von hochmolekularem bakteriziden Verbindungen von Polyethylenglykol (PEG) Fällung <ol><li> Zum sterilen Überstand, fügen NaCl und PEG 8000 bis 1 M und 10% Endkonzentrationen sind. bis invertieren wiederholt die Probe sowohl das NaCl und PEG vollständig gelöst sind. Inkubieren Proben in einem Eisbad für 1 h oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte am Boden des Zentrifugenröhrchens bilden. Den Überstand abgießen und das Pellet in gewünschte Volumen (wie 1/10 oder 1/100 des ursprünglichen Überstand volUME) der Puffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Entfernung des restlichen PEG durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit einem gleichen Volumen an Chloroform. <ol><li> Kombinieren Chloroform mit dem resuspendierten Pellets und Vortex für 10 bis 15 Sekunden, Zentrifuge dann die Mischung bei 20.000 xg für 5 min. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Extraktion, bis keine weißen Schnittstelle zwischen der wässrigen und der organischen Phase sichtbar ist (in der Regel zwei Extraktionen insgesamt). Lassen Rest Chloroform extrahiert aus Überstand in einem Abzug verdampfen. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Overlay und Testüberstände auf Aktivität <ol><li> Impfen eine einzelne Kolonie von einer P. syringae - Stamm für die Empfindlichkeit in 3 ml KB getestet werden, Inkubation über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen wieder die Kultur 1/100 in frischer KB. Inkubieren 3-4 h mit Schütteln bei Raum temperatuRe. </li><li> Bereiten sterilisiertem Wasser agar indem man eine Suspension von 0,35 bis 0,7% Autoklavierung (w / v) Agar in Reinstwasser. HINWEIS: Ein Vorrat an weichem Wasser Agar kann wiederholt in einer Mikrowelle und wiederverwendet werden geschmolzen, frisch Overlay muss nicht für jedes Experiment vorbereitet zu sein. Wenn Wasser Agar wieder verwendet wird, ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, wird folgende microwaving vollständig geschmolzen. Wenn nicht, wird das Overlay eine körnige Textur auf erstarrenden die Interpretation schwierig machen wird. Wenn dies geschieht, schmilzt das Agar für einige Minuten länger in der Mikrowelle als bisher durchgeführt. </li><li> Pflegen Sie das geschmolzene Weichagar in einem 60 ° C Wasserbad vor der Verwendung. Mit einer sterilen serologischen Pipette Transfer 3 ml Weichagar in ein steriles Kulturröhrchen. Liefert die Kulturröhrchen auf Wasserbad in einem geschmolzenen Zustand zu halten. </li><li> Um das Overlay gießen, zuerst das geschmolzene Agar abkühlen lassen (es sollte sich warm, aber nicht heiß zum Anfassen), aber nicht zulassen, sich zu verfestigen. </li><li> In einer sterilen Haube, impfen 100 uldie Teststammkultur in den weichen Agar und Wirbel zu mischen. Drehen Sie Kultur mit der Hand für 10 bis 15 Sekunden, dann gieße auf einem Boden-Agar (KB-Agar). Kippen Sie die Platte in alle Richtungen der Soft-Agar, um sicherzustellen, gleichmäßig den Boden Agar abdeckt. HINWEIS: Die untere Agar kann jeder verfestigt sein (1,5% Agar) Medium, auf dem die Teststamm kräftig wächst. Für einen Standard-Durchmesser von 100 mm Petrischale, verwenden Sie ~ 20 ml geschmolzene Medium. Der untere Agar kann mehrere Wochen vor der Zeit vorbereitet werden (bei 4 ° C ohne Trocknung gehalten) oder kann am gleichen Tag hergestellt werden. Wenn am gleichen Tag hergestellt, wie das Overlay durchgeführt wird, ist es am besten so vor tun 3.4 zu treten. </li><li> Decken Sie die Platte und lassen Sie es 20-30 Minuten zu verfestigen. Achten Sie darauf, die Platte nicht zu stören, während erstarrt. </li><li> Einmal verfestigt, beschmutzen 2-5 &amp; mgr; l Überstand (erzeugt in den Abschnitten 1 und 2, oben) auf das Overlay. Lassen Sie die Platten zur Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Beobachten Sie und ein Rekordergebnis am nächsten Morgen. Notiere eskann nützlich sein aus einer Reihenverdünnung des Überstands durchzuführen und beschmutzen. Auf diese Weise können die Forscher zwischen Bakteriophagen und Bacteriocin Clearing-Aktivität zu unterscheiden. In diesem Fall ist es empfehlenswert, 1 auszuführen: 5 oder 01.10 Verdünnungen. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Soft-Agar-Overlay-Technik hier beschrieben ist seit vielen Jahrzehnten von den Forschern interessiert in Bakteriophagen oder bacteriocins weit verbreitet. Die wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind, dass es ist einfach, billig und relativ einfach zu interpretieren. Durch die Kombination der Soft-Agar - Deckschicht mit PEG - Fällung und serielle Verdünnung können antimikrobielle Mittel in hohem bzw. niedrigem Molekulargewicht Mittel getrennt werden, und replikative vs. nicht replikativen Mittel (dh Bakteriophagen gegen tailocin, beziehungsweise). Schließlich kann Inkorporation von gezielte genetische Manipulation (Deletion und Komplementation) putativer Bacteriocin oder Prophagen loci fest um die Identität einer bestimmten antagonistische Verbindung herzustellen. Wir haben diese Methode vor kurzem eine neue Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin weit verbreitet unter den Pseudomonas syringae - Stämmen 9 zu beschreiben. Die Wachstumsmedien und in diesem Protokoll Arbeit angegebenen Bedingungen gut für Pseudomonas syringae und würden für andere gramnegative Bakterien wahrscheinlich ausreichen , das kräftig unter diesen Bedingungen wachsen. Jedoch Forscher dieses Verfahren verwendet werden soll das Timing, Kulturmedium, Induktionsverfahren und Inkubationstemperatur für ihr System zu optimieren. Die kritischen Parameter sind die Produktionskultur zu induzieren, während in der logarithmischen Wachstumsphase sowie Impfen der Soft-Agar-Deckschicht mit einer ausreichenden logarithmischen Phase Kultur eine einheitliche Bakterienverteilung zu gewährleisten, aber nicht übermäßige Kultur, die potentiellen Klärungszonen verdunkeln wird. Es gibt viele Bakteriocine, die nicht als Teil der SOS - Antwort induziert , sondern werden durch peptidbasierte Quorum sensing - Systeme induziert (insbesondere Gram-positive Bacteriocine 15), damit ein Forscher möchte kann mehrere verschiedene Induktionsverfahren zu screenen (wie Modifizieren Nährstoffgehalt von Medium zu induzieren, oder so dass für längere Inkubation des produzierenden Stamm). Beim BenutzenDiese Technik muss der Weichagar overlay gründlich vor der Zugabe des seeding Dehnung bei 55-60 ° C geschmolzen und gehalten werden. Wir haben mehrere Experimente hatten, wo die Soft-Agar nicht gründlich geschmolzen war (wenn auch visuell es zu sein schien) und führte zu einer Überlagerung mit einem körniges Aussehen. Die Ergebnisse einer körnig Overlay kann im Allgemeinen noch interpretierbar sein, aber dies auf die Stärke der Hemmung (schwächere Hemmung wird schwieriger zu beobachten) abhängig ist. Eine letzte, Verwechselung Variable zu berücksichtigen, wenn mit dieser Technik ist, dass die Temperatur des geschmolzenen Agar wird ausreichend Zeit gelassen, bevor sie mit dem Aussäen Stamm der Inokulation zu kühlen, um die Tötung der Seeding-Stamm zu vermeiden. Um dieses Problem zu vermeiden, stellen wir sicher, die Soft-Agar ist warm, aber nicht heiß, zu berühren. In dieser Richtung haben wir auch festgestellt, dass, wenn wir nicht ausreichend Zeit für eine seeding Kultur geben zum geschmolzenen Agar zu akklimatisieren, bevor die Überlagerungs Ausgießen gewinnen wir im allgemeinen eine schlechte bakterielle growth, die Auslegung der spezifischen Hemmung schwierig oder unmöglich zu interpretieren ist. Aus diesem Grund wir 10-15 zusätzliche Sekunden Inkubation zwischen Verwirbelung und Gießen der Overlay ermöglichen. Die Trade-off der Agar in einem vollständig geschmolzenen Zustand zwischen der Aufrechterhaltung (heißer ist besser), aber nicht tödlich für die Aussaat Stamm (heißer ist nicht besser) ist eine, die wahrscheinlich von einem Forscher durch Versuch und Irrtum bestimmt werden müssen. Wenn ein PEG-Fällungsschritt verwendet wird, wäre es vorteilhaft, eine negative Kontrolle enthalten, wo eine sterile Broth-Medium identisch zu dem Kulturüberstand verarbeitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Aktivität Töten ist nicht das Ergebnis von Rest PEG oder Chloroform innerhalb des Probenüberstand. Da beide Bakteriophagen und bacteriocins neigen hoch spezifisch zu sein, ist es nicht ungewöhnlich, mit einer bestimmten Kombination von Stämmen keinen offensichtlichen Tötungsaktivität zu begegnen. Dies kann aus einer Vielzahl von stammspezifischen re führenResistenz-Mechanismen, wobei man, dass der Stamm-Tester entweder fehlt oder hat eine unbekannte Version des von einem bestimmten Bacteriocin oder Bakteriophagen benötigt Rezeptor für das Targeting. Ein alternatives Verfahren, Bacteriocin Screeningverfahren wurde von Kawai et al beschrieben worden. , Leidet aber unter Nachteile und hat weit 16 nicht verabschiedet. Insbesondere erfordert diese Technik broth Proben in Zeitintervallen beobachtet, die lästig sein kann und nicht für die Unterscheidung zwischen Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin und abgeleitete Abtötung Aktivitäten erlaubt. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist, dass es nicht gut für Organismen geeignet ist, die wachsen nicht robust (und wird somit leicht unterscheidbare Klärungszonen fehlt), oder dass Hafen Prophagen oder Bakteriocine, die nicht robust unter Laborbedingungen hergestellt. Adaption dieser Technik bacteriocins zu erkennen, in Umweltproben erzeugt würde sowohl den Nutzen erweiterndieser Technik und einen besseren Einblick in die Rolle der bacteriocins in natürlicher Umgebung erleichtern.

Vor kurzem gab es in unser Verständnis der mikrobiellen Ökologie wesentlichem Interesse (insbesondere die microbiomes verschiedener Umgebungen), sowie neue antibakterielle Verbindungen bei der Bekämpfung von Antibiotika - resistenten Erregern 1,2 zu verwenden. Ein Verbindungs ​​Thema zwischen diesen Interessen ist das Verständnis antagonistische Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen in ihrer natürlichen Umgebung. Es gibt zahlreiche Wege , auf denen Bakterien Konkurrenten 3 antagonisieren. Bacteriocins, eine heterogene Gruppe von protein-, antibakterielle Verbindungen, wurden für ihre Rolle längst bei der Vermittlung interbakterieller Antagonismus, mit zwei der am meisten untersuchten Spezies ist von Pseudomonas aeruginosa 4,5 und Escherichia coli 6, wichtige menschliche Krankheitserreger untersucht. Neben bacteriocins können, induzierte Prophagen auch als anticompetitor Mittel wirken, so dass ein Stamm in eine Nische zu erobern , die bereits 7 besiedelt ist. Pseudomonas syringae ist eine bekannte Pflanze Pathogen eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln zu erzeugen, einschließlich einzelnes Protein bacteriocins 8, Bakteriophagenschwanz abgeleitete bacteriocins 9 (genannt tailocins) sowie Nicht-Protein - Sekundärmetaboliten 10. In letzter Zeit hat das Interesse gewesen zu verstehen , wie diese antimikrobiellen Substanzen , die Ökologie dieses Organismus beeinflussen, und wie können sie genutzt werden , um Pflanzenkrankheiten 11 steuern. Eine weit verwendete Methode sowohl bacteriocins und Bakteriophagen für die Untersuchung ist die Soft-Agar-Overlay-Technik. Diese Methode wurde zum ersten Mal in das Aufzählen Bakteriophagen 12,13 von Gratia 1936 zu Hilfe beschrieben. Hier wir die Anwendung der weich Agar-Overlay-Verfahren in Kombination mit gezielten genetischen Manipulation und Polyethylenglycol (PEG) Fällung, bei der Unterscheidung zwischen drei verschiedenen antimikrobiellen Mitteln (ein Bakteriophage beschreiben, ein hochmolekulares bacteriocin, und ein niedermolekulares Bacteriocin) durch eine einzelne Bakterienstamm produziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und billig, weshalb, obwohl es entschieden &quot;Low-Tech&quot; zu sein, wird immer noch weit verbreitet genutzt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

Die Soft-Agar-Overlay-Technik wurde ursprünglich vor mehr als 70 Jahren entwickelt und in verschiedenen Bereichen der mikrobiologischen Forschung, einschließlich der Arbeit mit Bakteriophagen und bacteriocins, proteinhaltiges antibakterielle Mittel in großem Umfang eingesetzt worden. Dieser Ansatz ist relativ kostengünstig, mit geringem Ressourcenbedarf. Diese Technik besteht Überstand von einem Spenderstamm von Spek (möglicherweise eine toxische Verbindung Beherbergung (n)) auf eine verfestigte weiche Agar-Deckschicht, die mit einem bakteriellen Teststamm (potentiell empfindlich gegenüber der toxischen Verbindung (en)) ausgesät wird. Wir nutzten diese Technik eine Bibliothek von Pseudomonas syringae zu screenen für innerartliche Tötung Stämme. Durch die Kombination dieser Ansatz mit einem Fällungsschritt und gezielte Gen-Deletionen, mehrere toxische Verbindungen, die durch den gleichen Stamm hergestellt werden, können unterschieden werden. Die beiden antagonistischen Mittel häufig diese Technik gewonnen verwenden, sind Bakteriophagen und bacteriocins. Diese beiden Mittel können differenziert werden unter Verwendung vonzwei einfache zusätzliche Tests. Durchführen einer seriellen Verdünnung auf einen Überstand Bakteriophagen enthält, wird in den einzelnen Plaques führen weniger an der Zahl mit größerer Verdünnung zu werden, während serielle Verdünnung eines Überstand Bacteriocin enthält eine Klärungszone führen, die mit einer größeren Verdünnung gleichmäßig mehr trüb wird. Darüber hinaus wird ein Bakteriophage eine Klärungszone erzeugen, wenn sie auf eine frische Soft-Agar-Overlay ausgesät mit dem gleichen Stamm entdeckt, während ein Bakteriocin wird keine Klärungszone erzeugen, wenn sie zu einem frischen Weichagar Rasen übertragen, um die Verdünnung des Bakteriocin zurückzuführen ist.

Die Kombination des weichen Agar-Deckschicht und PEG-Fällung kann verwendet werden, um verschiedene antimikrobielle Mittel durch die gleiche Stamm produziert zu identifizieren und zu charakterisieren. Figur 1 zeigt zwei Stämme von P. syringae (A und B) , die durch eine dritte Stamm der gleichen Spezies inhibiert werden. Die beiden Stämme sind jedoch durch verschiedene bacteriocins gehemmt. Die Klärungszone auf Stamm A weist eine scharfe Kante, während die Klärungszone auf Stamm B größer ist, und weist eine nicht scharfe Grenze. Genetische Manipulationen innerhalb des produzierenden Stammes, der spezifisch entweder die tailocin (tailocin mangelhaft) oder niedermolekularen Bacteriocin (bacteriocin mangelhaft) bestätigen zu inaktivieren, die A- und B-Stämme sind empfindlich auf unterschiedliche bacteriocins. 2 zeigt , dass Bakteriophagen-vermittelten Abtötung kann durch Vergleichen einer Verdünnungsreihe von anderen nicht-replikativen antimikrobiellen Mitteln unterschieden werden. Da beide bacteriocins undProphagen kann durch Mitomycin C-Behandlung, Aktivitäten dieser beiden Mittel können einander sehr ähnlich induziert werden (insbesondere, wenn die aktivierte Phagen reichlich vorhanden ist). Im Falle der Bakteriophagen-vermittelten Clearing, Verdünnung des Überstandes wird in einzelne Plaques (Clearing-Zonen) lösen, während Bacteriocin-vermittelte Clearing nicht in eine solche Plaques lösen wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die phänotypische Unterscheidung mehrerer antimikrobieller Mittel durch den gleichen Stamm produziert. Stamm A ist empfindlich gegenüber einem hochmolekularen Bacteriocin (tailocin), aber keine Alternative mit niedrigem Molekulargewicht Bacteriocin, wie durch das Fehlen von belegt in der tailocin defizienten Stamm löschen, jedoch nicht die Bacteriocin-defiziente Stamm. Umgekehrt ist der Stamm B zum tailocin insensitive, ist jedoch empfindlich gegenüber der niedermolekularen Bakteriocin. Die tailocin ist efficiently folgende PEG Fällung gewonnen, während mit niedrigerem Molekulargewicht bacteriocins nicht. WT = Wildtyp. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Unterscheidung zwischen nicht-replikativen antimikrobielle Substanzen und Bakteriophagen. (A) Verdünnung von einem hohen Titer von Bakteriophagen Ergebnisse in einzelnen Plaques , die weniger zahlreich geworden (hohe Titer oben, niedrige Titer unten). (B) Verdünnung von bacteriocins Ergebnisse in gleichmäßig weniger Lichtung , die nicht in einzelne Plaques löst. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K Aufrufe.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Serie: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

Die Verwendung von<em&gt; Galleria mellon</em&gt; Als Modellorganismus zum Studium<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infektion

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Verwendung von<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Zum Autophagie-Zytoskelett Interaktionen zu untersuchen

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is initiated by interaction of the pathogen with intestinal epithelial cells. This interaction leads to disruption of intercellular structures such as tight junctions (TJ). TJ ensure sealing of the epithelial layer to separate host tissue from gut lumen. Recent studies provide evidence that disruption of TJ by the parasitic protein EhCPADH112 is a prerequisite for E. histolytica invasion that is accompanied by epithelial barrier dysfunction. Thus, the analysis of molecular mechanisms involved in TJ disassembly during E. histolytica invasion is of paramount importance to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis. This article presents an easy model that allows the assessment of initial host-pathogen interactions and the parasite invasion potential. Parameters to be analyzed include transepithelial electrical resistance, interaction of EhCPADH112 with epithelial surface receptors, changes in expression and localization of epithelial junctional markers and localization of parasite molecules within epithelial cells.

Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection

Human infection by Entamoeba histolytica leads to amoebiasis, a major cause of diarrhea in tropical countries. Infection is initiated by pathogen interactions with intestinal epithelial cells, provoking the opening of cell-cell contacts and consequently diarrhea, sometimes followed by liver infection. This article provides a model to assess the early host-pathogen interactions to improve our understanding of amoebiasis pathogenesis.

Die Analyse der epithelialen Schäden Produziert von<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infektion

Entamoeba histolytica is the causative agent of human amoebiasis, a major cause of diarrhea and hepatic abscess in tropical countries. Infection is ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Entschlossenheit Konzentration Durch Plaque-Assays: Mit Tradition und neuen Überzugssysteme

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic approach to identify and evaluate antiviral agents that target specific steps of the viral entry. In this report, the methods of examining viral inactivation, viral attachment, and viral entry/fusion as antiviral assays for such purposes are described, using hepatitis C virus as a model. These assays should be useful for discovering novel antagonists/inhibitors to early viral entry and help expand the scope of candidate antiviral agents for further drug development.

Here, we present a protocol that examines specific steps of the viral entry to identify and evaluate novel antiviral agents.

Frühe das Eindringen des Virus-Assays für die Ermittlung und Bewertung von antiviralen Verbindungen

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

Die Verwendung von Durchflusszytometrie, um den Zustand von Chromatin in T-Zellen bewerten

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Ein neuartiges Feeder-freie System für die Massenproduktion von murinen Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected with Mycobacterium tuberculosis. Despite decades of research, many of the mechanisms behind the success of M. tuberculosis as a pathogenic organism remain to be investigated, and the development of safer, more effective antimycobacterial drugs are urgently needed to tackle the rise and spread of drug resistant tuberculosis. However, the progression of tuberculosis research is bottlenecked by traditional mammalian infection models that are expensive, time consuming, and ethically challenging. Previously we established the larvae of the insect Galleria mellonella (greater wax moth) as a novel, reproducible, low cost, high-throughput and ethically acceptable infection model for members of the M. tuberculosis complex. Here we describe the maintenance, preparation, and infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux. Using this infection model, mycobacterial dose dependent virulence can be observed, and a rapid readout of in vivo mycobacterial burden using bioluminescence measurements is easily achievable and reproducible. Although limitations exist, such as the lack of a fully annotated genome for transcriptomic analysis, ontological analysis against genetically similar insects can be carried out. As a low cost, rapid, and ethically acceptable model for tuberculosis, G. mellonella can be used as a pre-screen to determine drug efficacy and toxicity, and to determine comparative mycobacterial virulence prior to the use of conventional mammalian models. The use of the G. mellonella-mycobacteria model will lead to a reduction in the substantial number of animals currently used in tuberculosis research.

Use of the Invertebrate Galleria mellonella as an Infection Model to Study the Mycobacterium tuberculosis Complex

Galleria mellonella was recently established as a reproducible, cheap, and ethically acceptable infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Here we describe and demonstrate the steps taken to establish successful infection of G. mellonella with bioluminescent Mycobacterium bovis BCG lux.

Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberculosis is the leading global cause of infectious disease mortality and roughly a quarter of the world&#8217;s population is believed to be infected ...