This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Preparazione di surnatante in essere testati per l&#39;attività <ol><li> Preparare un 0,5 mg / ml soluzione stock di mitomicina C sciogliendo la giusta quantità in sterile 0,1 M MgSO 4 Buffer (ad esempio 1 mg mitomicina C / 2 ml buffer). Conservare magazzino a 4 ° C in una luce contenitore protetto (mitomicina C è sensibile alla luce). </li><li> Inoculare una singola colonia di P. syringae in 3 ml di terreno B King (KB) brodo 14. Incubare per tutta la notte con agitazione (200 rpm) a temperatura ambiente (21-25 ° C). </li><li> La mattina seguente, diluire il brodo di coltura 1/100 in 3 ml di brodo KB fresco. Incubare per 3-4 ore con agitazione a temperatura ambiente. Aggiungere mitomicina C (0,5 mg / ml, concentrazione finale). Incubare la cultura per tutta la notte con agitazione a temperatura ambiente. NOTA: Mitomicina C provoca doppie rotture del DNA non recuperabili, stimolando così la risposta SOS della cellula, che porta alla produzione di entrambi i batteriofagi e batteriocine. </li><li> Pellet 1-2 ml mitomicina C culture indotta mediante centrifugazione a 20.000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga da banco. </li><li> Rimuovere e sterilizzare sovranatanti di coltura sia facendo passare il surnatante attraverso un filtro con pori di 0,22 micron o trattando il surnatante con cloroformio (100 ml di cloroformio per 1 ml surnatante). <ol><li> Se si utilizza il cloroformio, agitare la miscela per 15 sec e lasciate incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo l&#39;incubazione, centrifugare la miscela a 20.000 xg per 5 min. NOTA: Cloroformio uccide le cellule in modo efficiente dai solubilizzazione loro membrane. Il vantaggio di utilizzare cloroformio sopra sterilizzazione filtro è che è più economico e più facile da scale-up qualora da molti (&gt; 20) campioni alla volta. Ci può essere una possibilità che una data attività di uccisione viene persa in seguito al trattamento cloroformio come risultato di partizionamento nella fase organica. </li><li> Rimuovere la fase superiore, acquosa utilizzando una pipetta 1 ml di una fresca, sterile 1,5 o 2,0 mlprovetta per microcentrifuga. Attenzione a non trasferire qualsiasi dello strato di cloroformio inferiore (è preferibile rimuovere meno della fase acquosa per evitare riporto). </li><li> Incubare il supernatante trasferito uncapped in una cappa aspirante per permettere cloroformio residua evapori (alcune ore). surnatanti Conservare a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. La separazione e la concentrazione di alto peso molecolare battericida composti da polietilene glicole (PEG) Precipitazioni <ol><li> Per il surnatante sterile, aggiungere NaCl e PEG 8000 a 1 m e 10% concentrazioni finali rispettivamente. Ripetutamente invertire il campione fino a quando sia il NaCl e PEG sono completamente sciolti. Incubare i campioni in un bagno di ghiaccio per 1 ora o per una notte a 4 ° C. </li><li> Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C. Un pellet dovrebbe formare sul fondo della provetta. Decantare il surnatante e risospendere il pellet in volume desiderato (ad esempio 1/10 o 1/100 del surnatante vol originaleume) di tampone (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) pipettando ripetutamente. </li><li> Rimuovere PEG residua da due estrazioni sequenziali con un uguale volume di cloroformio. <ol><li> Combinare cloroformio con il pellet risospeso e vortex per 10 a 15 secondi, quindi centrifugare la miscela a 20.000 xg per 5 min. Trasferire la fase superiore, acquosa ad una provetta per microcentrifuga fresca. Ripetere questa estrazione fino a quando non l&#39;interfaccia bianca tra la fase acquosa e organica sia visibile (di solito 2 estrazioni totali). Lasciare che il cloroformio residua di evaporare dal surnatanti estratti in una cappa aspirante. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di Overlay e Testing surnatanti per attività <ol><li> Inoculare una singola colonia di un ceppo P. syringae da testare per la sensibilità in 3 ml di KB, incubare per tutta la notte con agitazione a temperatura ambiente. </li><li> La mattina seguente, di nuovo diluire la cultura 1/100 in KB fresco. Incubare 3-4 ore con agitazione a camera temperi. </li><li> Preparare sterilizzato agar acqua autoclavando una sospensione 0,35-0,7% (w / v) di agar in acqua ultrapura. NOTA: Uno stock di morbida agar acqua può essere fuso in un forno a microonde e riutilizzato più volte, sovrapposizione fresco non ha bisogno di essere preparati per ogni esperimento. Se agar acqua viene riutilizzata, è fondamentale per assicurarsi che sia completamente sciolto dopo la cottura a microonde. In caso contrario, la sovrapposizione avrà una consistenza granulosa sulla solidificazione che renderà difficile l&#39;interpretazione. In questo caso, sciogliere l&#39;agar per alcuni minuti in più nel forno a microonde di fatto in precedenza. </li><li> Mantenere il soft agar fuso in un bagno d&#39;acqua a 60 ° C prima dell&#39;uso. Usando una pipetta sierologica sterile, trasferire 3 ml di agar morbido per una provetta di coltura sterile. Riportare la provetta a bagnomaria per mantenere in uno stato fuso. </li><li> Versare la sovrapposizione, in primo luogo consentire l&#39;agar fuso raffreddare (si dovrebbe sentire caldo ma non bollente al tatto), ma non lasciare solidificare. </li><li> In una cappa sterile, inoculare 100 ml dila cultura ceppo tester in agar morbido e vortex per miscelare. Ruotare la cultura a mano per 10-15 secondi, poi versate su un fondo agar (KB agar). Inclinare il piatto in tutte le direzioni per assicurare l&#39;agar morbido copre in modo uniforme l&#39;agar fondo. NOTA: L&#39;agar inferiore può essere qualsiasi (1,5% agar) mezzo solidificato in cui il ceppo sperimentale cresce vigorosamente. Per 100 mm di diametro Petri standard utilizzano ~ 20 ml fuso media. L&#39;agar inferiore può essere preparato diverse settimane in anticipo (se mantenuta a 4 ° C senza asciugatura) o può essere preparato il giorno stesso. Se preparate il giorno stesso di eseguire la sovrapposizione, è meglio farlo prima della fase 3.4. </li><li> Coprire la piastra e lasciare 20-30 minuti a solidificare. Fare attenzione a non disturbare il piatto mentre la solidificazione. </li><li> Una volta solidificato, individuare 2-5 ml di surnatante (generato nelle sezioni 1 e 2, sopra) sulla sovrapposizione. Lasciare le piastre di incubare durante la notte a temperatura ambiente. Osservare e registrare i risultati la mattina seguente. Annotalopuò essere utile eseguire e spot da una diluizione seriale del surnatante. Questo permetterà ai ricercatori di distinguere tra batteriofago e l&#39;attività di compensazione batteriocina. In questo caso, si raccomanda di eseguire 1: 5 o 1:10 diluizioni. </li></ol>

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(Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La tecnica di sovrapposizione di soft-agar qui descritto è stato ampiamente applicato per molti decenni dai ricercatori interessati a batteriofagi o batteriocine. I principali vantaggi di questo approccio sono che è semplice, economico e relativamente facile da interpretare. Combinando la sovrapposizione soft-agar con PEG precipitazioni e la diluizione di serie, agenti antimicrobici possono essere separati in alto contro gli agenti a basso peso molecolare, e replicative vs non-replicativa agenti (cioè batteriofago vs. tailocin, rispettivamente). Infine, l&#39;incorporazione di manipolazione genetica mirata (soppressione e complementazione) di batteriocine putativo o loci profago può fermamente stabilire l&#39;identità di un dato composto antagonista. Abbiamo recentemente usato questo metodo per descrivere una nuova batteriofago di derivazione batteriocina prevalente tra Pseudomonas syringae ceppi 9. I media di crescita e le condizioni indicate in questo lavoro protocollo bene per Pseudomonas syringae e probabilmente sufficiente per altri batteri Gram-negativi che crescono vigorosamente in queste condizioni. Tuttavia, i ricercatori utilizzano questo metodo vorranno ottimizzare i tempi, terreno di coltura, metodo di induzione, e temperatura di incubazione per il loro sistema. I parametri critici includono indurre la cultura produrre mentre nella fase di crescita logaritmica, nonché semina sovrapposizione soft-agar con sufficiente cultura fase logaritmica di garantire una distribuzione batterica uniforme, ma la cultura non eccessivo, che oscurare potenziali zone di compensazione. Ci sono molti batteriocine che non sono indotte come parte della risposta SOS, ma piuttosto sono indotti attraverso sistemi di rilevamento del quorum peptide-based (in particolare batteriocine Gram-positivi 15), in tal modo, un ricercatore può essere utile per lo screening diversi metodi di induzione diversi (come ad esempio modificando contenuto di nutrienti di indurre medio o consentendo di incubazione del ceppo produzione). Quando si usaquesta tecnica, la sovrapposizione soft-agar deve essere accuratamente fusa e mantenuta a 55-60 ° C prima dell&#39;aggiunta del ceppo semina. Abbiamo avuto diversi esperimenti in cui il soft-agar non è stato completamente fuso (anche se visivamente sembrava essere) e ha portato a una sovrapposizione con un aspetto granuloso. I risultati di una sovrapposizione granulosa possono ancora essere generalmente interpretabile, tuttavia, questo dipende dalla forza di inibizione (inibizione debole sarà più difficile osservare). Una variabile confondendo finale da considerare quando si utilizza questa tecnica è che la temperatura del agar fuso è consentito raffreddi prima dell&#39;inoculo con il ceppo semina, in modo da evitare di uccidere il ceppo semina. Per evitare questo problema, possiamo garantire il soft-agar è caldo, ma non bollente, al tatto. Su questa linea, abbiamo anche osservato che se diamo il tempo insufficiente per una cultura di semina per ambientarsi al agar fuso, prima di versare la sovrapposizione, recuperiamo generalmente scarsa g battericaRESCITA, il che rende l&#39;interpretazione di inibizione specifica difficili o impossibili da interpretare. Questo è il motivo per cui permettiamo 10-15 ulteriori secondi di incubazione tra vortex e versando la sovrapposizione. Il trade-off tra il mantenimento l&#39;agar in uno stato completamente fuso (più caldo è meglio), ma non letale per il ceppo di semina (più caldo non è migliore) è quello che sarà probabilmente bisogno di essere determinato da un ricercatore attraverso tentativi ed errori. Se viene utilizzata una fase di precipitazione PEG, sarebbe vantaggioso includere un controllo negativo in cui un mezzo di brodo sterile viene elaborato identico al supernatante della coltura. Questo farà sì che uccidere attività non è il risultato di PEG residua o cloroformio nel supernatante campione. Poiché entrambe batteriofagi e batteriocine tendono ad essere altamente specifica, non è raro incontrare alcuna attività uccisione evidente con una data combinazione di ceppi. Ciò può derivare da una varietà di specifico ceppo remeccanismi sistance, uno è che il ceppo tester o manca o ha una versione non riconosciuta del recettore necessario per il targeting da un dato batteriocina o batteriofago. Un metodo alternativo, metodo di screening batteriocine è stata descritta da Kawai et al. , Ma soffre di inconvenienti e non è stato ampiamente adottato 16. In particolare, questa tecnica richiede osservando campioni brodo a intervalli di tempo che possono essere onerose, e non consente la discriminazione tra attività di uccisione batteriofago-derivato e batteriocine-derivato. I principali limiti di questa tecnica è che non è adatto per gli organismi che non crescono robusta (e quindi mancheranno zone di compensazione facilmente distinguibili) o che profagi porto o batteriocine che non sono prodotte con fermezza in condizioni di laboratorio. Adattamento di questa tecnica per rilevare batteriocine prodotte in campioni ambientali sarebbero sia espandere l&#39;utilitàdi questa tecnica e facilitare una maggiore comprensione del ruolo di batteriocine all&#39;interno di ambienti naturali.

Recentemente, vi è stato un notevole interesse ad approfondire la nostra comprensione dell&#39;ecologia microbica (in particolare le microbiomes di vari ambienti), così come i nuovi composti antibatterici da utilizzare nella lotta contro gli agenti patogeni resistenti agli antibiotici 1,2. Un tema di interconnessione tra questi interessi è la comprensione delle interazioni antagoniste tra i ceppi batterici nel loro ambiente naturale. Ci sono molti modi in cui i batteri antagonizzano concorrenti 3. Batteriocine, un gruppo eterogeneo di composti antibatterici, proteici, sono stati a lungo studiati per il loro ruolo nel mediare l&#39;antagonismo interbatterica, con due delle specie più studiate essere Pseudomonas aeruginosa 4,5 e Escherichia coli 6, importanti agenti patogeni umani. Oltre a batteriocine, profagi indotte possono anche agire come agenti anticompetitor, consentendo un ceppo di invadere in una nicchia che è già colonizzato 7. Pseudomonas syringae è un patogeno pianta nota per produrre una serie di agenti antimicrobici, compresi singoli batteriocine proteiche 8, batteriocine coda derivato batteriofago 9 (tailocins chiamati), così come metaboliti secondari non proteici 10. Recentemente vi è stato interesse per capire come questi antimicrobici influenzano l&#39;ecologia di questo organismo, così come il modo in cui possono essere utilizzate per controllare le malattie delle piante 11. Un metodo ampiamente utilizzato per studiare sia batteriocine e batteriofago è la tecnica di sovrapposizione soft-agar. Questo metodo è stato descritto da Gratia nel 1936 agli aiuti di enumerazione batteriofago 12,13. Qui si descrive l&#39;applicazione del metodo di sovrapposizione soft-agar, in combinazione con mirata manipolazione genetica e polietilenglicole precipitazioni (PEG), nel distinguere fra tre diversi agenti antimicrobici (un batteriofago, un elevato peso molecolare bacteriocin, e un basso peso molecolare batteriocina) prodotto da un singolo ceppo batterico. Il vantaggio di questo approccio è che è relativamente semplice e poco costoso, che è il motivo per cui, nonostante sia decisamente &#39;low-tech&#39;, è ancora ampiamente utilizzato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:231px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:179px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:140px;">sc-3514</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34854</td>
			<td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Glycol (PEG)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bacteriological grade agar</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>20-274</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

La tecnica di sovrapposizione di soft-agar è stato originariamente sviluppato più di 70 anni fa ed è stato ampiamente utilizzato in diverse aree della ricerca microbiologica, compreso il lavoro con i batteriofagi e batteriocine, agenti antibatterici proteici. Questo approccio è relativamente economico, con requisiti di risorse minime. Questa tecnica consiste individuare surnatante da un ceppo donatore (potenzialmente ospitare un composto tossico (s)) in un solidificata agar morbido che viene inseminata con un ceppo batterico di prova (potenzialmente sensibile al composto tossico (s)). Abbiamo utilizzato questa tecnica per lo screening di una libreria di Pseudomonas syringae ceppi per l&#39;uccisione intraspecifica. Combinando questo approccio con una fase di precipitazione e delezioni geniche mirate, composti tossici più prodotte dallo stesso ceppo possono essere differenziati. I due agenti antagonisti comunemente recuperati utilizzando questa tecnica sono batteriofagi e batteriocine. Questi due agenti possono essere differenziati utilizzandodue semplici test aggiuntivi. Esecuzione di una diluizione seriale di un surnatante contenente batteriofago si tradurrà in singole placche diventando meno in numero con una maggiore diluizione, mentre la diluizione seriale di un surnatante contenente batteriocina comporterà una zona di compensazione che diventa uniformemente più torbida con una maggiore diluizione. Inoltre, un batteriofago produrrà una zona di compensazione quando trovato su un fresco morbido agar seminato con lo stesso ceppo, mentre una batteriocina non produrrà una zona di compensazione quando trasferito su un morbido prato fresco agar, a causa della diluizione del batteriocine.

La combinazione della sovrapposizione agar morbido e PEG precipitazione può essere usato per identificare e caratterizzare differenti agenti antimicrobici prodotte dallo stesso ceppo. La figura 1 mostra due ceppi di P. syringae (A e B) che sono inibiti da un terzo ceppo della stessa specie. I due ceppi, tuttavia, sono inibiti da diverse batteriocine. La zona di compensazione sul ceppo A presenta un bordo tagliente, mentre la zona di compensazione sul ceppo B è più grande, e presenta un bordo non tagliente. manipolazioni genetiche all&#39;interno del ceppo produzione di quel particolare inattivano sia il tailocin (tailocin carente) o basso peso molecolare batteriocina conferma (batteriocina carente) che i ceppi A e B sono sensibili alle batteriocine distinti. La figura 2 mostra che l&#39;uccisione batteriofago-mediata può essere distinto da altri antimicrobici non replicativa confrontando una serie di diluizioni. Poiché entrambe le batteriocine eprofago può essere indotta da trattamenti mitomicina C, le attività di questi due agenti possono molto simili tra loro (in particolare se il fago attivato è abbondante). Nel caso di compensazione batteriofago-mediata, diluizione del surnatante risolverà in singoli placche (zone di compensazione) mentre compensazione batteriocine-mediata non risolve in tali placche. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Figura 1: distinzione fenotipica di più agenti antimicrobici prodotte dallo stesso ceppo. Strain A è sensibile ad un alto batteriocina peso molecolare (tailocin) ma non un basso peso molecolare alternativa batteriocine, come evidenziato dalla mancanza di compensazione nel tailocin ceppo carente, ma non il batteriocina ceppo carente. Viceversa, ceppo B è insensibile alla tailocin, ma è sensibile al basso batteriocina peso molecolare. Il tailocin è efficposi- zione ergonomica, recuperati in seguito PEG precipitazioni, mentre inferiori batteriocine peso molecolare non lo sono. WT = wild type. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Figura 2: Distinguere tra antimicrobici e dei batteriofagi non replicativa. (A) La diluizione di un alto titolo di batteriofagi risultati nelle singole placche che diventano meno numerose (in alto alto titolo, basso basso titolo). (B) diluizione di batteriocine risultati in modo uniforme meno compensazione che non si risolve in singoli placche. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

L&#39;utilizzo della tecnica di sovrapposizione Soft-agar per lo screening composti inibitori bacterially Prodotto

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.0K Views.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Creazione di una configurazione high-throughput screening per piccole molecole che modulano c-di-GMP Segnalazione di<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Tecniche di laboratorio asettico: Metodi Placcatura

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologia

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Screening ad alta produttività dei composti chimici per chiarire i loro effetti sulla persistenza batterica

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Crescita differita Inibizione test per quantificare l&#39;effetto di antimicrobici batteri derivati ​​sulla concorrenza

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

Un saggio del biofilm su piastra a pioli per lo screening di agenti antibatterici

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...