La falta de espacio, hemos citado sobre todo artículos de revisión, y pedimos disculpas a nuestros colegas cuyo trabajo original no fue citado. El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por becas del NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD y BSF a V.C., y el laboratorio de SGL es apoyado por los NIH y los fondos de los departamentos de Fitopatología y biología planta-microorganismo a SGL

1. Material vegetal
<ol><li>Elección de especies vegetales</li>
	<li>Uso de la especie de planta nativa de la proteína de interés, es decir, uno que codifica esta proteína proteínas endógenas o que representa el huésped natural para el patógeno para las proteínas virales. Además, las especies seleccionadas deben ser susceptibles del elegido método de transformación genética transitoria. Nota: Los estudios emplean rutinariamente Nicotiana benthamiana, que representa un buen anfitrión para TMV y se transforma eficientemente por la técnica de transformación genética mediada por Agrobacterium, es decir, agroinfiltration (ver paso 3). Las plantas de N. benthamiana también se cultivan fácilmente y tienen hojas grandes, que son fácilmente inoculadas por Agrobacterium y fácilmente analizadas por microscopia confocal.</li>
	<li>
Crecimiento de las plantas
	<ol>
<li>Planta semillas de N. benthamiana en suelo mojado en alta densidad. Mantenerlas en una cámara de ambiente controlado en 20-25 ° c bajo 16 h de luz ~ 75 μmol de fotones m-2 s-1 y 8 h de oscuridad. Después de que el diámetro de euphyll llega a 0,5 cm, cuidadosamente transfiera las plantas de semillero a macetas más grandes y continuar el crecimiento en la misma cámara en las mismas condiciones.</li>
		<li>Mantener las plantas hasta que crecen a 4-8-hojas dentro de 4 semanas cuando las hojas más grandes son 4-6 cm de diámetro; en este momento, pueden ser utilizados para agroinfiltration (ver paso 3). Nota: Importante, no utilice las plantas si comenzaron a florecer porque, en esta etapa del desarrollo, la arquitectura de la hoja varía a menudo24,25, a veces lleva a resultados inconsistentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. construcción del Vector de expresión
<ol><li>
Elección del sistema de la expresión
	<ol>
<li>Elegir la expresión sistema, es decir, vectores y vectores método de entrega, más adecuado para la expresión de la proteína de interés en las especies de plantas estudiadas. Nota: En ocasiones, tales combinaciones específicas de proteína/especies probadas pueden requieren vectores específicos y vectores método de entrega para la expresión óptima y función de la proteína de interés. De plantas dicotiledóneas más, sin embargo, seleccionar plásmidos binarios como vectores de expresión y agroinfiltration como sistema de entrega.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteína fluorescente etiquetado
	<ol>
<li>Etiqueta fluorescente cada proteína expresada para el análisis de su distribución subcelular22, incluyendo localización de Pd. Nota: Emplear proteínas autofluorescent, como PPC y DsRed2, como etiquetas. Etiqueta de la proteína prueba con PPC y coexpresan con un DsRed2 gratis. Funciones CFP como etiqueta y como una molécula de carga no relacionadas con virus. Funciones DsRed2 para calibrar la eficiencia global de la expresión transitoria y, por ser la célula autónoma, para identificar la célula inicialmente transformada; Esta última función es importante al evaluar el movimiento célula a célula de proteínas prueba potencialmente no celular-autónomos. Para coexpression con el marcador de Pd PDCB1, que también es la célula autónoma, etiqueta de la proteína prueba con el CFP y PDCB1 con DsRed2.</li>
		<li>Como regla general, fusible de la etiqueta de autofluorescent para la terminal carboxilo de la proteína expresada. Sin embargo, si las exposiciones tagged proteína prueba larga duración dirigidos a Pd, traslado la etiqueta al término amino de la proteína.</li>
		<li>Copia las secuencias de codificación de las proteínas para ser probado en un vector de expresión conveniente de la planta. Nota: Hay muchos vectores de expresión plantas que permiten etiquetado fluorescente. Utilizamos una serie de pSAT plásmidos26 o algunos de sus derivados27,28, que son convenientes para la clonación de la secuencia de interés directamente en marco con las etiquetas autofluorescent sugerido (ver paso 2.2.1) en ambos amino- y orientaciones del carboxilo terminal.</li>
		<li>Transferir cada cassette de expresión en un vector binario de Agrobacterium. Nota: Aunque construcciones basadas en pSAT son adecuadas para la entrega de la biolística directa en los tejidos vegetales, agroinfiltration, que es el método de transformación recomendado aquí (ver paso 3), requiere que el casete de expresión que se encuentra entre el T-ADN las fronteras de un binario vector29. Nota: Todos los vectores pSAT están diseñados para permitir dicha transferencia al pPZP RCS2 multigénica expresión vector binario26,30 por un solo paso de clonación mediante nucleasas de corte raro AscI-PpoI-SceI, -CeuI, PspI PI y PI-TliI 26. investigadores que prefieren utilizar la clonación recombinatorial, p. ej., usando sitios heterólogos lox 31pueden emplear pSAT vector variantes26,27.</li>
		<li>Para coexpression, transferencia de dos casetes de expresión, por ejemplo, proteína-PPC probada y DsRed2 o probado proteína-CFP y DsRed2 PDCB1 (ver punto 2.1), el mismo vector binario RCS2 pPZP. Nota: Como alternativa, culturas de Agrobacterium albergar constructos binarios individuales se pueden mezclar juntos para infiltración en N. benthamiana (ver paso 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
Añadir 1 μg de un plásmido pPZP RCS2 basado en cultura de paso 2.2.5 a 100 μl de células competentes de cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 o GV3101 preparado descrito32, incubar en hielo por 30 min, flash-congelación en nitrógeno líquido durante 1 minuto, y incubar a 28 ° C durante 15 minutos.
	<ol>
<li>Luego, añadir 1 mL de medio LB (10 G/l triptona, extracto de levadura 5 g/L y 10 g/L de NaCl) a la mezcla de células competentes e incubar a 28 ° C por 2 h. vuelta hacia abajo de las células a 3.000 x g durante 1 min, volver a suspenderlas en 0,2 mL de LB y placas de LB agar suplementado con antibióticos apropiados (p. ej., espectinomicina 100 mg/L y 50 mg/L rifampicina pPZP RSC2 basado en vectores26,30). Crezca a 28 ° C durante 48 h, hasta colonias individuales son visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger y placa varias colonias individuales sobre una placa fresca de agar LB (ver paso 3.1), crecen en 28 ° C durante 48 h y tomar una pequeña cantidad de bacterias para el análisis por PCR de Colonia33 para confirmar la presencia de los constructos binarios específicos.</li>
	<li>
Crecer cada colonia de Agrobacterium con el constructo de interés durante la noche a 28 ° C en 5 mL de medio LB suplementado con antibióticos apropiados (ver paso 3.1.1). Centrifugar las células a 3.000 x g y vuelva a suspenderlos OD600= 0,5 en agroinfiltration buffer (10 mM de MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 μm acetosiringona). Incubar por 2 h a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Si se utiliza una mezcla de plásmidos binarios en lugar de un plásmido de expresión multigénica solo para el coexpression de proteína, mezcla las culturas de célula correspondientes en proporción de 1:1 v/v antes de la infiltración. Luego Incube las células a 28 ° C por 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cargar el inóculo en una jeringa de plástico de 1 mL y sale de la boquilla de la jeringa (sin aguja) contra la epidermis inferior (abaxial) de los completamente maduros N. benthamiana de la prensa. Sostenga la hoja con un dedo enguantado en la cara adaxial34,35.
	<ol>
<li>Introducir el Agrobacterium en medio de la infiltración por inyección lenta. Para la significación estadística, infiltrarse en varias hojas en cada planta. Nota: Tenga en cuenta que las hojas más viejas no se utilizan como no rinden niveles de expresión coherente.</li>
		<li>Inocular hojas todo in situ. Mantener la planta infiltrada hasta la observación como se describe en el paso 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. confocal microscopio
<ol><li>Use una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas 24-48 h después de la infiltración, (dependiendo de la eficacia de la expresión transitoria de la proteína específica de la prueba); el tamaño de cada rebanada de tejido debe ser tal que el segmento está totalmente cubierto por el vidrio de cubierta (22 mm x 40 m m) usado para microscopía.</li>
	<li>Deslizan las láminas de la hoja en el objeto con la superficie abaxial de la hoja hacia arriba, coloque una gota de agua en el segmento de hoja y cubrir con la cubierta de vidrio. Inmovilizar el vidrio de cubierta con pequeños trozos de cinta en cada lado.</li>
	<li>
Observar los tejidos agroinfiltrated bajo un microscopio confocal de escaneo láser y grabar las imágenes resultantes.
	<ol>
<li>En primer lugar, utilice un objetivo de 10 X para identificar las células con la señal y luego usar 63 x objetivo de observaciones más detalladas.</li>
		<li>Uso el 458 nm longitud de onda un láser de ion argón para excitar PPC y 543 nm para excitar DsRed2. Guarde todos los ajustes para la adquisición de la imagen, es decir, intensidad de laser y photomultiplier tubo (PMT) ajustes, entre experimentos. En promedio, examinar las células de 100-120 para cada condición experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. identificación de los PLS
<ol><li>Diagnosticar la localización de la proteína prueba utilizando microscopio confocal (sección 4). Comprobar si la proteína probada tiene el característico patrón punteado periférico25,36,37,38,39,40,41 y colocalizes con el marcador de Pd PDCB123. Esto indica que la proteína probada más probable es que contiene secuencias PLS.</li>
	<li>Después de confirmación de la actividad PLS de proteínas probadas, progresivamente subdividir su marco de lectura abierto (ORF) (número de genbank BAF93925.1) en fragmentos más pequeños, autofluorescently, (por ejemplo, PCP) etiqueta cada uno de ellos y analizar su localización subcelular como se describe en el paso 4. Inicialmente, se recomienda el tamaño de 100 residuos de aminoácidos para cada fragmento subdividido.</li>
	<li>Subdividir aún más los fragmentos truncados que tienen la actividad PLS y compruebe su localización subcelular como se describe en el paso 4 hasta el fragmento más pequeño que todavía se localiza a Pd, es decir, es suficiente para el transporte de la carga de etiqueta autofluorescent EP, se identifica. Este fragmento se supone para representar la secuencia PLS.</li>
	<li>Eliminar el supuesta PLS de la proteína prueba integral, es decir, la parte restante de la proteína prueba sin supuesta PLS autofluorescent etiqueta del fusible y determinar la localización subcelular de la proteína del mutante resultante como se describe en el paso 4. Si esta proteína mutante que carece del supuesta PLS no logra localizar a Pd, esto indicará que el identificado PLS no es solamente suficiente (véase paso 5.3), pero también necesario para el transporte de la Pd de la proteína prueba.</li>
	<li>Agroinfiltrate las hojas con una mezcla de culturas de Agrobacterium albergar la expresión construyen para el CFP-tagged PLS y DsRed2 libre (véase el paso 3.3). Observar el tejido infiltrado con microscopio confocal con objetivo de 10 x con la misma configuración en el paso 4.3.</li>
	<li>Puntuación de las celdas que contienen señales de PPC y DsRed2 como células inicialmente infiltradas y marcar las células adyacentes que contenía sólo la señal de la política pesquera común que ese movimiento de exposición. Nota: Este paso examina el PLS identificado por su potencial capacidad de movimiento de célula a célula; Esto es porque muchas proteínas que Pd (mayoría incluya planta de MPs virales) también se mueven a través de la Pd a las células vecinas. La concentración de Agrobacterium utilizada para la infiltración depende de la eficacia de la expresión de diferentes estructuras respectivamente. Para agroinfiltration, asegúrese de utilizar la dilución de la cultura de célula que garantiza (i) transformación de las células, dejando las células adyacentes transformaciones, (ii) alcanza una eficacia similar de la expresión. Por ejemplo, nuestros experimentos utilizan OD600 de 0.01 y 0.005 para la expresión de CFP-tagged PLS y DsRed2 libre, respectivamente.</li>
</ol>6. identificación de residuos clave PLS con alanina análisis42
<ol><li>Utilizar protocolos de PCR para amplificar el PLS codificación secuencia empleando a un par de cartillas diseñadas para contener la mutación deseada, es decir, sustitución del residuo del aminoácido blanco con alanina, alrededor de la región central de cada cartilla, como se describe 21. llevar a cabo el primer diseño y el uso del kit de mutagénesis sitio-dirigida por mutagénesis sitio-dirigida según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Purificar los productos resultantes de la polimerización en cadena usando cualquier estándar kit de purificación de DNA y digerirlos a 37 ° C con DpnI para eliminar el parental (es decir, no transformado) desnaturalizado y hemimethylated la DNA. Esto enfriar durante 5 min a temperatura ambiente (no con hielo). Luego transformar la mezcla directamente en células competentes de e. coli 43e identificar colonias con las construcciones mutantes deseadas como se describe en el paso 3.2.</li>
	<li>Introducir las construcciones mutantes en el vector binario tal como se describe en el paso 2.2.4 realizar agroinfiltration como se describe en el paso 3 y evaluar Pd dirigido a como se describe en los pasos 4 y 5.1.</li>
</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Este protocolo tiene cuatro componentes fundamentales: el concepto de identificación de una secuencia que es necesario y suficiente para apuntar a Pd, división sistemática de la proteína de interés en los fragmentos que se reducen progresivamente en longitud, la prueba de fusión fragmentos de una proteína autofluorescent que sirve como etiqueta y como carga macromolecular y análisis funcional de EP objetivo en la vida de la planta tejidos después de la expresión transitoria de las proteínas de fusión probado....

Plasmodesmos (Pd) funcionan como conductos para el transporte intercelular de los reguladores claves del desarrollo de la planta y la morfogénesis, que van desde factores de transcripción a ARNm y pequeñas moléculas de ARN. Además, esta capacidad de transporte macromolecular de la EP es utilizada por la mayoría virus de planta para su diseminación intercelular durante la infección; para desplazarse por Pd, virus de plantas han evolucionado las proteínas especializadas, como proteínas de movimiento (MPs), que se dirigen específicamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vías moleculares de transporte Pd probablemente están íntimamente interconectadas con las secuencias específicas que atacan las proteínas transportadas en estas vías. Así, la identificación de estas señales de localización de Pd (PLSs) puede ser diagnóstico de la vía de transporte Pd correspondiente. Esto es por analogía de Pd transporte8, por ejemplo, la importación nuclear diferentes caminos, que pueden ser específicos para diferentes localización nuclear (NLS) de señal secuencias9,10. Conceptualmente, la NLSs y PLSs representan no escindibles subcelulares dirigidos a secuencias necesarias y suficientes para dirigir. Sin embargo, a diferencia de la NLSs11, la información de la secuencia sobre PLSs es severamente limitada. Específicamente, solamente cuatro secuencias de la proteína involucradas en la orientación de la Pd se han divulgado, con todos ellos derivados de proteínas endógenas de la planta. La primera está representada por un dominio de homeobox de KN112 – un factor de transcripción que se desplaza de las capas internas de la célula a la epidermis de la planta hoja13 – y sus homólogos de KNOX14. El segundo también es de un factor de transcripción, Dof, que contiene una supuesta PLS calificó el tráfico intercelular (IT) tema15. Es la tercera secuencia de la proteína de membrana de PDLP1 residente en plasmodesmos tipo 1, y está representado por un dominio transmembrana16. Por último, el cuarto Pd a secuencia fue divulgado recientemente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)-proteínas ancladas y está representada por la modificación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) señal17.
Curiosamente, hasta hace poco, no PLSs se han divulgado para MPs virales. Estudios previos indicaron la presencia de supuestas secuencias PLS en planta MPs virales18,19, pero no verdadera PLS, es decir, una secuencia de aminoácidos mínimo necesaria y suficiente para Pd contra una carga sin relación () molécula e.g., PPC) ha sido identificada en un MP viral. Sin embargo una de estas proteínas, MP del virus del mosaico del tabaco (TMV), fue el primero que Pd localización y transporte han sido demostrado20.
Para hacer frente a este vacío, hemos desarrollado una estrategia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estrategia se basa en tres conceptos. (i) define PLS como una secuencia de aminoácidos mínimo que es necesario y suficiente para apuntar de la proteína a Pd21. (ii) porque la MP del TMV Pd se dirige primero y luego se transloca a través de estos canales22, apuntamos a desacoplar estos dos actividades e identificando el PLS de buena fe, que funciona sólo para apuntar Pd y no para el transporte posterior. (iii) se analizaron PLS identificado para residuos de aminoácidos importantes para su EP dirigidos a la actividad, ya sea estructural o funcional. Usando este acercamiento, delineó una secuencia 50-amino ácida del residuo en el amino terminal de la MP del TMV que actúa como auténtico PLS. Esto se hace produciendo una serie de fragmentos de la MP del TMV que satura toda la longitud de la proteína, marcado su carboxilo-termini con PPC y transitoriamente expresarlos en los tejidos vegetales. Localización de la PD de cada uno de los fragmentos prueba determinó coexpressing con una proteína del marcador de Pd, PDCB1 (proteína 1 de Unión Callosa Pd)23. El fragmento más pequeño que todavía había localizado en Pd, pero no lo hizo atravesar Pd, era considerado para representar PLS. Finalmente, lo PLS fue alanina-explorado para determinar los residuos de aminoácidos clave para su estructura o función.
Mientras que aquí ilustramos este enfoque describiendo la identificación de la MP del TMV PLS, pueden ser empleado para descubrir PLSs en cualquier otras proteínas orientada a Pd, ya sea codificado por patógenos o por las plantas Esto es porque nuestro método no aprovechar cualquier características únicas de las MPs virales con respecto a su capacidad de destino a Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Plasmodesmos (Pd) son las conexiones de la célula a célula que funcionan como puertas de enlace a través del cual se transportan las moléculas grandes y pequeñas entre las células vegetales. Considerando que el transporte de Pd de pequeñas moléculas, como iones y agua, se presume para ocurrir pasivamente, transporte célula a célula de las macromoléculas biológicas, tales proteínas, probablemente se produce mediante un mecanismo activo que involucra señales específicas de focalización en la molécula transportada. La escasez de señales de localización identificados plasmodesmos (Pd) (PLSs) ha restringido severamente la comprensión de la proteína-clasificación vías implicadas en la planta transporte macromolecular de la célula a célula y la comunicación. De una amplia variedad de plantas endógenas y virales proteínas conocidas al tráfico a través de la Pd, PLSs sólo tres han divulgado hasta la fecha, todas ellas de proteínas endógenas de la planta. Por lo tanto, es importante desarrollar una estrategia experimental confiable y sistemática para identificar una secuencia funcional de PLS, que es necesario y suficiente para apuntar Pd, directamente en la vida de las células de la planta. Aquí, describimos una estrategia de este tipo utilizando como paradigma de la proteína de movimiento célula a célula (MP) del virus del mosaico del tabaco (TMV). Estos experimentos, que identificaron y caracterizaron el primer planta PLS viral, puede ser adaptados para el descubrimiento de secuencias PLS en proteínas más orientada a Pd.

Los datos representativos, que fielmente ilustran los resultados esperados de los protocolos descritos e identifican la TMV MP PLS, se adaptan de Yuan et al. 21. figura 1A resume primero principales construcciones expresando el MP de TMV larga duración (1-268), TMV MP PLS (formada por los primeros 50 residuos de aminoácidos de la proteína, 1-50), y la alanina análisis derivados de V4A fusionado al CFP (generado como se describe en paso...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K vistas.  State University of New York. Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Investigación

Inmunología e Infección

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualización de virus del dengue a través de Alexa Fluor etiquetado

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescencia<em&gt; In situ</em&gt; Las hibridaciones (FISH) para la localización de los virus y las bacterias endosimbióticas en plantas e insectos tejidos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

El uso de proteínas fluorescentes para visualizar y cuantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuola dinámica de crecimiento en las células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Purificación de ADN Viral para la identificación de las proteínas virales y celulares asociadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Aislamiento de Salmonella typhimurium-que contienen fagosomas de los macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability to multiply inside such cells. These virulence traits render M. abscessus pathogenic, especially in vulnerable hosts with underlying structural lung disease, such as cystic fibrosis, bronchiectasis or tuberculosis. How patients become infected with M. abscessus remains unclear. Unlike many mycobacteria, M. abscessus is not found in the environment but might reside inside amoebae, environmental phagocytes that represent a potential reservoir for M. abscessus. Indeed, M. abscessus is resistant to amoebal phagocytosis and the intra-amoeba life seems to increase M. abscessus virulence in an experimental model of infection. However, little is known about M. abscessus virulence in itself. To decipher the genes conferring an advantage to M. abscessus intracellular life, a screening of a M. abscessus transposon mutant library was developed. In parallel, a method of RNA extraction from intracellular Mycobacteria after co-culture with amoebae was developed. This method was validated and allowed the sequencing of whole M. abscessus transcriptomes inside the cells; providing, for the first time, a global view on M. abscessus adaptation to intracellular life. Both approaches give us an insight into M. abscessus virulence factors that enable M. abscessus to colonize the airways in humans.

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Here, we present two protocols to study Phagocyte-Mycobacterium abscessus interactions: the screening of a transposon mutant library for bacterial intracellular deficiency and the determination of bacterial intracellular transcriptome from RNA sequencing. Both approaches provide insight into the genomic advantages and transcriptomic adaptations enhancing intracellular bacteria fitness.

Identificación de marcadores de virulencia de Mycobacterium abscessus para la replicación intracelular de fagocitos

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

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