A falta de espaço, nós citados principalmente artigos de revisão, e pedimos desculpas aos nossos colegas, cuja obra original não foi citada. O trabalho no laboratório V.C. é suportado por concessões do NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD e BSF para V.C., e o laboratório S.G.L. é suportado pelo NIH e fundos do departamentos de Fitopatologia e biologia vegetal-micróbio para S.G.L.

1. Material vegetal
<ol><li>Escolha de espécies de plantas</li>
	<li>Use as espécies de plantas nativas à proteína de interesse, ou seja, um que codifica esta proteína para proteínas endógenas ou que representa o hospedeiro natural para o patógeno para proteínas virais. Além disso, as espécies de plantas selecionadas devem ser passíveis do método de escolha de transformação genética transitória. Nota: Os estudos empregam rotineiramente Nicotiana benthamiana, que representa um bom anfitrião para TMV e é transformado de forma eficiente pela técnica de transformação genética mediada por Agrobacterium, i.e., agroinfiltration (ver passo 3). Plantas de s. benthamiana também são facilmente cultivadas e tem folhas grandes, que são facilmente inoculadas por Agrobacterium e facilmente analisadas por microscopia confocal.</li>
	<li>
Crescimento de planta
	<ol>
<li>Plante sementes de s. benthamiana em solo molhado em alta densidade. Mantê-los em uma câmara de ambiente controlado em 20-25 ˚ c Membros abaixo dos 16 h de luz em ~ 75 µmol fótons m-2 s-1 e 8 h de escuridão. Depois que o diâmetro de euphyll atinge 0,5 cm, cuidadosamente transferir as mudas para vasos maiores e continuar o crescimento da mesma Câmara nas mesmas condições.</li>
		<li>Manter as plantas até que eles cresçam para estágio 4-8-folha dentro de 4 semanas, quando as folhas maiores são 4-6 cm de diâmetro; neste momento, eles podem ser usados para agroinfiltration (ver passo 3). Nota: Importante, nunca use as plantas se começaram a flor porque, nesta fase do desenvolvimento, a arquitetura de folha varia frequentemente24,25, às vezes levando a resultados inconsistentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. construção de vetor de expressão
<ol><li>
Escolha do sistema de expressão
	<ol>
<li>Escolha a expressão sistema, i.e., vetores e vetor método de entrega, mais adequado para a expressão da proteína de interesse nas espécies de plantas estudadas. Nota: Ocasionalmente, tais combinações específicas das espécies testadas proteína/planta podem exigir vetores específicos e vetor método de entrega para a expressão ideal e função da proteína de interesse. Para plantas dicotiledónias mais, no entanto, selecione binários plasmídeos como vetores de expressão e agroinfiltration como sistema de entrega.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Marcação de proteínas fluorescentes
	<ol>
<li>Etiqueta fluorescente cada proteína expressa para análise de sua distribuição subcellular22, incluindo a localização do Pd. Nota: Empregar autofluorescent proteínas, tais como o PCP e DsRed2, como etiquetas. Tag da proteína testada com PCP e coexpress-lo com um DsRed2 livre. Funções de PCP como marca e como uma molécula de carga não relacionado a vírus. DsRed2 funções para calibrar a eficiência global da expressão transiente e, porque é célula autónomos, para identificar a célula inicialmente transformada; Esta última função é importante, ao avaliar o movimento de célula para célula de proteínas testadas potencialmente não-celular-autónomos. Para coexpression com o marcador de Pd PDCB1, que também é celular autónomos, marca a proteína testada com PCP e PDCB1 com DsRed2.</li>
		<li>Como regra geral, fundem-se a marca de autofluorescent para a carboxila-terminal da proteína expressa. No entanto, se as exposições de etiquetado proteína testado completos comprometida Pd direcionamento, transferi a tag para o amino-terminal da proteína.</li>
		<li>Clone as sequências de codificação das proteínas a ser testado em um vetor de expressão de instalações apropriadas. Nota: Existem muitos vetores de expressão de diferentes plantas que permitem a marcação fluorescente. Usamos uma série de pSAT plasmídeos26 ou alguns dos seus derivados27,28, que são apropriados para a clonagem da sequência de interesse diretamente no frame com as tags sugeridas autofluorescent (consulte a etapa 2.2.1) em ambos os amino- e orientações de carboxila-terminal.</li>
		<li>Transferi cada gaveta de expressão em um vetor binário de Agrobacterium. Nota: Embora baseado no pSAT construções são apropriadas para entrega de peroxidação direta nos tecidos vegetais, agroinfiltration, que é o método de transformação aqui recomendado (ver passo 3), exige que a gaveta de expressão a ser localizada entre o T-DNA as fronteiras de um binário vetor29. Nota: Todos os vetores de pSAT foram projetados para permitir essa transferência para o pPZP-RCS2 expressão multigene vetor binário26,30 clonando um passo a passo usando nucleases de corte raro ascos, PpoI-eu, eu-SceI, CeuI, PspI-PI e PI-TliI 26. pesquisadores que preferem utilizar a clonagem recombinatório, por exemplo, usando heteróloga salmão sites31, podem-se empregar pSAT vector variantes26,27.</li>
		<li>Para coexpression, transferir as duas fitas de expressão, por exemplo, proteína-PCP testado e DsRed2 ou proteína-PCP testado e PDCB1-DsRed2 (ver passo 2.1), para o mesmo vetor binário de pPZP-RCS2. Nota: Alternativamente, culturas de Agrobacterium abrigar construções binárias individuais podem ser misturadas juntos para infiltração de s. benthamiana (ver passo 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
Adicionar 1 µ g de um plasmídeo baseados em pPZP-RCS2 de cultura de passo 2.2.5 para 100 µ l de células competentes da estirpe de Agrobacterium tumefaciens EHA105 ou GV3101 preparado como descrito32, incubar no gelo por 30 min, congelam em nitrogênio líquido por 1 min, e incube a 28 ° C por 15 min.
	<ol>
<li>Em seguida, adicionar 1 mL de meio LB (triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L e 10 g/L de NaCl) para a mistura de células competentes e incubar a 28 ° C, durante 2 h. Spin para baixo as células a 3.000 × g por 1 min, re-suspendê-las em 0,2 mL de LB e placa-los na LB ágar suplementado com antibióticos apropriados (por exemplo, espectinomicina 100 mg/L e rifampicin de 50 mg/L para pPZP RSC2-com base em vetores26,30). Cresce a 28 ° C, durante 48 h até colônias individuais são visíveis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Escolher e várias colónias individuais em uma placa de ágar LB fresca da placa (ver passo 3.1), crescer a 28 ° C, durante 48 h e tomar uma pequena quantidade de bactérias para análise por PCR de colônia33 para confirmar a presença das construções de binárias específicas.</li>
	<li>
Cresce cada colônia de Agrobacterium com o construto de interesse durante a noite a 28 ° C em 5 mL de LB suplementado com antibióticos apropriados (ver passo 3.1.1). Centrifugar as células a 3.000 × g e re-suspendê-las a OD600= 0,5 no buffer agroinfiltration (10 mM MgCl2, 10mm MES (pH 5,6), 150 µM acetosyringone). Incube durante 2 h à temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Se usar uma mistura de plasmídeos binários em vez de um plasmídeo de expressão multigene único para coexpression de proteína, misture as culturas de célula correspondente na proporção de 1:1 v/v antes de infiltração. Então Incube as células a 28 ° C, durante 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carrega o inóculo em uma seringa de plástico de 1 mL e pressione que o bico da seringa (sem agulha) contra a epiderme inferior (abaxial) da amadurecer N. benthamiana folhas. Segure a folha com um dedo protegido por luva a face adaxial34,35.
	<ol>
<li>Introduza o Agrobacterium médio de infiltração por injeção lenta. Para a significância estatística, se infiltre em diversas folhas em cada planta. Nota: Observe que as folhas mais antigas não são utilizadas, como eles não produzem níveis de expressão consistente.</li>
		<li>Vacinar todas as folhas em situ. Manter a planta infiltrada até observação conforme descrito no passo 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Confocal da microscopia
<ol><li>Use uma lâmina para cortar cada folha em fragmentos entre as veias 24-48 h após a infiltração, (dependendo a eficiência da expressão transiente da proteína específica testada); o tamanho de cada fatia de tecido deve ser tal que a fatia é completamente coberta por vidro tampa (22 x 40 mm) usado para a microscopia.</li>
	<li>Lugar as fatias de folha no objeto deslize com a superfície abaxial da folha voltada para cima, coloque uma gota de água sobre a fatia de folha e cubra com o tampa de vidro. Imobilize o tampa de vidro com pequenos pedaços de fita em cada lado.</li>
	<li>
Observar os tecidos agroinfiltrated sob um microscópio confocal de varredura de laser e gravar as imagens resultantes.
	<ol>
<li>Primeiro, use uma lente de objetiva X 10 para identificar células com o sinal e use 63 x objectiva para observações mais detalhadas.</li>
		<li>Comprimento de onda do uso do 458 nm de um laser de íon argônio para excitar o PCP e 543 nm para excitar o DsRed2. Manter todas as configurações para aquisição de imagem, ou seja, a intensidade do laser e configurações de photomultiplier tubo (PMT), entre as experiências. Em média, examine células de 100-120 para cada condição experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. identificação dos PLS
<ol><li>Diagnosticar a localização da proteína testada usando microscópio confocal (secção 4). Verifique se a proteína testada tem o padrão característico de punctate periférica25,36,37,38,39,40,41 e colocalizes com o marcador Pd PDCB123. Isto indica que a proteína testada provavelmente contém sequências PLS.</li>
	<li>Após confirmação da atividade da proteína testada, PLS progressivamente subdividir o quadro de leitura aberta (ORF) (número de adesão genbank BAF93925.1) em fragmentos menores, autofluorescently, (por exemplo, PCP,) marca cada um deles e analisar suas Localização subcellular conforme descrito na etapa 4. Inicialmente, recomenda-se o tamanho de 100 resíduos de aminoácidos para cada fragmento subdividido.</li>
	<li>Subdividir mais truncados fragmentos que têm a atividade PLS e verificar sua localização subcellular conforme descrito na etapa 4, até o menor fragmento que localiza ainda à polícia, ou seja, é suficiente para transportar a carga de marca autofluorescent para a polícia, é identificado. Este fragmento, presume-se para representar a sequência PLS.</li>
	<li>Excluir o putativo PLS da proteína testada completo, ou seja, fundir a parte restante da proteína teste sem putativo PLS a tag autofluorescent e determinar a Localização subcellular da proteína mutante resultante, conforme descrito na etapa 4. se esta proteína mutante que carece o putativo PLS falhar localizar à polícia, isso indicará que o identificado PLS não é apenas suficiente (ver passo 5.3), mas também é necessário para o transporte de Pd da proteína testado.</li>
	<li>Agroinfiltrate as folhas com uma mistura de culturas de Agrobacterium, abrigando a expressão constroem para o PCP-tag PLS e DsRed2 livre (ver passo 3.3). Observe o tecido infiltrado usando microscópio confocal com lente objetiva de 10x usando as mesmas configurações como no passo 4.3.</li>
	<li>Marca as células que contêm sinais tanto PCP e DsRed2 como células inicialmente infiltrados e marcar as células adjacentes que continha apenas o sinal de PCP como aqueles que mostra o movimento. Nota: Este passo examina o PLS identificado por sua potencial capacidade de movimento de célula a célula; Isto é porque muitas proteínas que destino Pd (incluindo a maioria planta virais MPs) também se move Pd para as células vizinhas. A concentração de Agrobacterium usado para infiltração depende da eficiência de expressão de diferentes estruturas, respectivamente. Para agroinfiltration, certifique-se de usar a diluição de cultura de células que garante que (i) a transformação de células únicas, deixando as células adjacentes unlit, (ii) alcança eficiência semelhante de expressão. Por exemplo, nossos experimentos utilizam OD600 de 0,01 e 0,005 por expressão de PCP-tag PLS e livre DsRed2, respectivamente.</li>
</ol>6. identificação da chave PLS resíduos usando alanina digitalização42
<ol><li>Usar padrão protocolos PCR para amplificar o PLS sequência empregando um par de primers destinados a conter a mutação desejada, isto é, substituição do resíduo de aminoácido alvo com a alanina, em torno da região central de cada primer, conforme descrito de código 21. realizar o projeto da primeira demão e uso o kit mutagenesis local-dirigido para o mutagenesis local-dirigido de acordo com as instruções do fabricante.</li>
	<li>Purificar os produtos resultantes do PCR usando qualquer padrão kit de purificação de DNA e digeri-los a 37 ° C com DpnI para eliminar o parental (ou seja, não-mutante) misturado e hemimethylated o DNA. Isto esfrie por 5 min à temperatura ambiente (não gelo). Em seguida, transformar a mistura diretamente em células competentes de Escherichia coli 43e identificar colônias com as construções de mutante desejadas, conforme descrito no passo 3.2.</li>
	<li>Introduzir o mutante constrói o vetor binário, conforme descrito na etapa 2.2.4, execute agroinfiltration, conforme descrito na etapa 3 e avaliar Pd direcionamento conforme descrito nas etapas 4 e 5.1.</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo tem quatro componentes principais: o conceito de identificar uma sequência que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, divisão sistemática da proteína de interesse em fragmentos que são progressivamente reduzidos em comprimento, fundindo o testado fragmentos de uma proteína autofluorescent que serve como marca e como carga macromolecular e ensaio funcional para Pd direcionamento na vida da planta tecidos seguindo a expressão transiente das proteínas de fusão testado. Observe que a...

Dictiossomos (Pd) funcionam como condutos para transporte intercelular dos reguladores chaves do desenvolvimento da planta e morfogênese, variando de fatores de transcrição de mRNA e pequenas moléculas de RNA. Além disso, esta capacidade de transporte macromolecular da DP é utilizada pela maioria dos vírus de planta para sua propagação intercelular durante a infecção; para mover-se através de Pd, vírus de plantas evoluíram proteínas especializadas, denominadas proteínas de movimento (MPs), que visam especificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vias moleculares de transporte Pd provavelmente estão intimamente interligadas com as sequências específicas que visam as proteínas transportadas para essas vias. Assim, a identificação destes sinais de localização do Pd (PLSs) pode ser diagnóstica da via de transporte correspondente do Pd. Isto é por analogia de Pd transporte8, por exemplo, a importação nuclear diferentes vias, que podem ser específicas para diferentes localização nuclear (NLS) de sinal sequências9,10. Conceitualmente, tanto NLSs e PLSs representam não-cleavable subcellular direcionamentos sequências que são necessárias e suficientes para o direcionamento. No entanto, ao contrário de NLSs11, as informações de sequência sobre PLSs são severamente limitadas. Especificamente, somente quatro sequências de proteínas envolvidas no direcionamento de Pd têm sido relatadas, com todos eles derivados de proteínas vegetais endógenos. O primeiro deles é representado por um domínio homeobox KN112 – um factor de transcrição que se move de camadas celulares interna a epiderme da planta folha13 – e sua KNOX homologs14. O segundo também é de um fator de transcrição, Dof, que contém um putativo PLS descrito como o tráfico intercelular (IT) motivo15. A terceira sequência é da proteína de membrana PDLP1 residente dictiossomos tipo 1, e é representado por um domínio transmembrana16. Finalmente, o quarto Pd segmentação sequência foi relatado recentemente para glicosilfostidilinosiol (GPI)-proteínas ancoradas e é representado por glicosilfostidilinosiol (GPI) modificação sinal17.
Curiosamente, até muito recentemente, nenhum PLSs têm sido relatados para MPs virais. Estudos anteriores indicaram a presença de sequências de PLS putativos em planta viral MPs18,19, mas não PLS verdadeiro, ou seja, uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o Pd direcionamento de uma carga independentes molécula ( ex., PCP) foi identificada em um MP viral. Ainda uma destas proteínas, MP do vírus do mosaico do tabaco (TMV), foi o primeiro para que a polícia de localização e transporte tem sido demonstrada20.
Para resolver esta lacuna, desenvolvemos uma estratégia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estratégia foi baseada em três conceitos. (i) definimos PLS como uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o direcionamento de proteína para Pd21. (ii) porque TMV MP visa primeiro Pd e translocates então através destes canais,22, que visa desatrelar essas duas atividades e identificando o PLS bona fide, que funciona apenas para o direcionamento de Pd e não para o transporte subsequente. (iii) foram analisados o PLS identificado por resíduos de aminoácidos importantes para a sua polícia visando a atividade, seja estrutural ou funcionalmente. Usando essa abordagem, nós delineado uma sequência de 50 amino ácido resíduos no amino-terminal do TMV MP que atua como PLS bona fide. Isto foi feito por produzir uma série de fragmentos de TMV MP que saturado de todo o comprimento da proteína, etiquetando seus carboxila-termini com PCP e transitoriamente expressá-los em tecidos vegetais. Localização de PD de cada um dos fragmentos testados foi determinada por coexpressing-los com uma proteína de marcador de Pd, PDCB1 (Pd callose proteína 1)23. O fragmento menor que ainda localizada, Pd, mas não atravessar Pd, considerou-se para representar o PLS. Finalmente, o PLS era alanina-digitalizadas para determinar os resíduos de aminoácidos chave necessários para sua estrutura e/ou função.
Considerando que aqui ilustramos esta abordagem descrevendo a identificação de TMV MP PLS, podem ser empregada para descobrir PLSs em qualquer outras proteínas Pd-alvo, se codificado por patógenos vegetais ou pelas plantas Isso ocorre porque nosso método não leva vantagem de quaisquer características únicas de MPs virais com relação à sua capacidade de alvo para Pd.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1086">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:293px;">Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td>
			<td style="width:176px;">Zeiss</td>
			<td style="width:268px;">LSM5</td>
			<td style="width:349px;">Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zen software for confocal microscope imaging</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>2009 version</td>
			<td>The software should be compatible with the CLSM used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quickchange II site-directed mutagenesis kit&#160;</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>200523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acetosyringone</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D134406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MES</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>69892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringes without needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgCl2</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Spectinomycin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rifampicin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R3501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ampicillin&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

Dictiossomos (Pd) são ligações de celular para celular que funcionam como gateways através do qual moléculas pequenas e grandes são transportadas entre células vegetais. Considerando que o transporte de Pd de pequenas moléculas, como íons e água, presume-se ocorrer passivamente, célula a célula transporte de macromoléculas biológicas, tais proteínas, provavelmente ocorre através de um mecanismo ativo que envolve os sinais de direcionamentos específicos sobre o molécula transportada. A escassez de sinais de localização de dictiossomos identificados (Pd) (PLSs) restringiu severamente o entendimento de proteína-classificação vias envolvidas na planta transporte macromolecular de célula para célula e comunicação. De uma riqueza de planta endógenas e virais proteínas conhecidas para o tráfego por meio de Pd, PLSs apenas três foram relatados até à data, todos eles de proteínas vegetais endógenos. Assim, é importante desenvolver uma estratégia experimental sistemática e confiável para identificar uma sequência PLS funcional, que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, diretamente no vivo células vegetais. Aqui, descrevemos uma tal estratégia usando como um paradigma da proteína de célula para célula de movimento (MP) do vírus do mosaico do tabaco (TMV). Estas experiências, que identificaram e caracterizam a primeira planta PLS viral, pode ser adaptadas para descoberta de PLS sequências em proteínas mais Pd-alvo.

Dados do representante, que fielmente ilustram os resultados esperados dos protocolos descritos e identificam o TMV MP PLS, adaptam-se de Yuan et al . 21. figura 1A primeiro resume grandes construções expressando o MP TMV completos (1-268), TMV MP PLS (compreendendo os primeiros 50 resíduos de aminoácidos da proteína, 1-50), e sua digitalização V4A derivados de alanina fundido ao CFP (gerado como descrito em etapas 2.2, 5.2 e 6) Con...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K visualizações.  State University of New York. Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inferência genotípica do HIV-1 Tropismo Usando de base populacional de Seqüenciamento V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

Imunologia e Infecção

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

Visualizando Vírus da Dengue por meio Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and pathological processes such as CNS maturation in development, multiple sclerosis, and spinal cord injury. Microglia can be activated and recruited to action by neuronal injury or stimulation, such as axonal damage seen in MS or ischemic brain trauma resulting from stroke. These immunocompetent members of the CNS are also thought to have roles in synaptic plasticity under non-pathological conditions. We employ protocols for culturing microglia from the neonatal and adult tissues that are aimed to maximize the viable cell numbers while minimizing confounding variables, such as the presence of other CNS cell types and cell culture debris. We utilize large and easily discernable CNS components (e.g. cortex, spinal cord segments), which makes the entire process feasible and reproducible. The use of adult cells is a suitable alternative to the use of neonatal brain microglia, as many pathologies studied mainly affect the postnatal spinal cord. These culture systems are also useful for directly testing the effect of compounds that may either inhibit or promote microglial activation. Since microglial activation can shape the outcomes of disease in the adult CNS, there is a need for in vitro systems in which neonatal and adult microglia can be cultured and studied.

We outline methods for the efficient and quick isolation/culture of viable microglia from the neonatal cerebral cortex and adult spinal cord. The dissection and plating of cortical microglia can be accomplished within 90 minutes, with the subsequent microglial harvest taking place ~ 10 days following the initial dissection.

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells and can be further modified to visualize other components in the cell such as infection with viruses and bacteria. Spatial localization and visualization of viruses and bacteria during the infection process is an essential step that complements expression profiling experiments such as microarrays and RNAseq in response to different stimuli. Understanding the spatiotemporal infections with these agents complements biological experiments aimed at understanding their interaction with cellular components. Several techniques for visualizing viruses and bacteria such as reporter gene systems or immunohistochemical methods are time-consuming, and some are limited to work with model organisms&#160;and involve complex methodologies. FISH that targets RNA or DNA species in the cell is a relatively easy and fast method for studying spatiotemporal localization of genes and for diagnostic purposes. This method can be robust and relatively easy to implement when the protocols employ short hybridizing, commercially-purchased probes, which are not expensive. This is particularly robust when sample preparation, fixation, hybridization, and microscopic visualization do not involve complex steps. Here we describe a protocol for localization of bacteria and viruses in insect and plant tissues. The method is based on simple preparation, fixation, and hybridization of insect whole mounts and dissected organs or hand-made plant sections, with 20 base pairs short DNA probes conjugated to fluorescent dyes on their 5&#39; or 3&#39; ends. This protocol has been successfully applied to a number of insect and plant tissues, and can be used to analyze expression of mRNAs or other RNA or DNA species in the cell.

Fluorescence in situ Hybridizations FISH for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues

We describe here a simple fluorescence in situ hybridization (FISH) method for the localization of viruses and bacteria in insect and plant tissues. This protocol can be extended for the visualization of mRNA in whole mount and microscopic sections.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a name given to a variety of techniques commonly used for visualizing gene transcripts in eukaryotic cells ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

Usando proteínas fluorescentes para visualizar e Quantificar<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacúolo Crescimento Dynamics em células vivas

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional identification requires the sub-culture of signaled blood culture broth with identification available only after colonies on solid agar have matured. MALDI-TOF MS is a reliable, rapid method for identification of the majority of clinically relevant bacteria when applied to colonies on solid media. The application of MALDI-TOF MS directly to blood culture broth is an attractive approach as it has potential to accelerate species identification of bacteria and improve clinical management. However, an important problem to overcome is the pre-analysis removal of interfering resins, proteins and hemoglobin&#160;contained in blood culture specimens which, if not removed, interfere with the MS spectra and can result in insufficient or low discrimination identification scores. In addition it is necessary to concentrate bacteria to develop spectra of sufficient quality. The presented method describes the concentration, purification, and extraction of Gram negative bacteria allowing for the early identification of bacteria from a signaled blood culture broth.

The application of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry (MS) directly to blood culture broth expedites the identification of bacteria. The presented method is a rapid and reliable method for identification of Gram negative bacteria directly from blood culture broth.

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been successfully used for identification of protein-protein interactions (PPIs) in mammalian cells. However, requirements of toxic hydrogen peroxide (H2O2) in APEX-based PL, longer incubation time with biotin (16&#8211;24 h), and higher incubation temperature (37 &#176;C) in BioID-based PL severely limit their applications in plants. The recently described TurboID-based PL addresses many limitations of BioID and APEX. TurboID allows rapid proximity labeling of proteins in just 10&#8201;min under room temperature (RT) conditions. Although the utility of TurboID has been demonstrated in animal models, we recently showed that TurboID-based PL performs better in plants compared to BioID for labeling of proteins that are proximal to a protein of interest. Provided here is a step-by-step protocol for the identification of protein interaction partners using the N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domain of the nucleotide-binding leucine-rich repeat (NLR) protein family as a model. The method describes vector construction, agroinfiltration of protein expression constructs, biotin treatment, protein extraction and desalting, quantification, and enrichment of the biotinylated proteins by affinity purification. The protocol described here can be easily adapted to study other proteins of interest in Nicotiana and other plant species.

Described here is a proximity labeling method for identification of interaction partners of the TIR domain of the NLR immune receptor in Nicotiana benthamiana leaf tissue. Also provided is a detailed protocol for the identification of interactions between other proteins of interest using this technique in Nicotiana and other plant species.