Los autores desean agradecer a Jen Sheen, del Hospital General de Massachusetts por la generosa donación de plantones Nicotiana benthamiana. Jen Bush nos ayudó mucho en el asesoramiento en el cultivo de plantas y la creación de un área de la cámara de crecimiento. Tom Ferrante del Instituto Wyss ofreció ayuda decisiva con microscopía confocal. Los autores desean agradecer especialmente a Don Ingber del Hospital de Niños de Boston y el Instituto Wyss por la generosa donación de una pistola de genes y materiales asociados. Los fondos para este proyecto fueron proporcionados a través de un acuerdo de cooperación con el Departamento de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Energía (ARPA-E Award # DE-000079) para PAS, JCW, y Médicos del Mundo, y por medio de Chimerion Biotechnology, Inc. para MJV.

1. Diseño de secuencias Alternativamente empalmados-en caso de pluralidad Orgánulos Focalización <ol><li> Determinar los sitios para la expresión de la proteína final. Para este trabajo, el interés se centra en la orientación del cloroplasto, peroxisomas y citoplasma. </li><li> Usar la literatura para identificar las secuencias de proteínas y de ADN conocidos que atacan las proteínas de los orgánulos de interés. En este caso, una orientación del cloroplasto secuencia de Arabidopsis thaliana-L isoaspartate metiltransferasa 6,15, y una secuencia dirigida a los peroxisomas de Arabidopsis thaliana-transtiretina como S-alantoína sintasa 16,17 fueron determinado. </li><li> Identificar un régimen alternativo de empalme que deben orientar las proteínas de interés a los orgánulos correctas. Para este trabajo, los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis naturales 6. La secuencia de ARNm fue rediseñado dejando los sitios de empalme naturales, pero las secuencias de codificación se colocaron peroxis cloroplastos oome de metas de etiquetas dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). </li></ol> 2. Asamblea Gibson de piezas de ADN Ver también la Figura 2. El método de montaje Gibson depende de la acción de varias enzimas en una mezcla pre-hechos a 1) digerir parcialmente los extremos de la doble hebra de ADN para hacer de hebras sencillas y 2) de recocido pares de bases complementarias de la vecina partes de ADN. Esto permite la clonación de fragmentos de ADN sin las limitaciones de los sitios de restricción. <ol><li> Elige un órden para los elementos de la construcción del plásmido de ADN. Como un ejemplo TriTag-1 tiene elementos de: a) un vector plásmido (poros, que contiene una construcción de GFP se sabe que funciona en plantas, un marcador de resistencia a kanamicina, y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium tumefaciens anfitriones), b) una secuencia de promotor, (P ENTCUP2, demostrado ser constitutiva en plantas), C) una secuencia de direccionamiento de cloroplastos (CTS), c) una secuencia de dirección de peroxisomas (PTS), y d) una serie de sitios de empalme como se ha descrito previamente 6. </li><li> Diseñar la base para la construcción de la base con en el software de diseño de silico. ApE es un paquete de software gratuito de código abierto útil para este trabajo. Nota: TriTag-1, tiene la orden: vector de plásmido, promotor, ATG, sitio de empalme de donantes, secuencia diana del cloroplasto, el sitio donador de empalme, lugar neutral, el sitio aceptor de empalme, secuencia diana de peroxisomas, sitio aceptor de empalme, las buenas prácticas agrarias, que figura en el plásmido vector . <ol><li> Diseñar el silico construcción de ADN de tal que hay un solapamiento de 50 pb entre cada pieza en el pedido cebadores para la PCR. Es posible usar la superposición de 50 pb como los cebadores: 25 pb cada dirección. <ol><li> Asegúrese de no perder de vista el origen de cada uno de los pedazos de secuencia. Es como: un plásmido ser cultivadas y miniprepped; una secuencia lineal que se puede utilizar como una plantilla de PCR; o una secuencia que tiene que sersintetizado comercialmente? Varias compañías ofrecen servicios de síntesis de ADN de bajo costo para los fragmentos de &lt;500 pb. En este caso, la propia TriTag es 437 pb por lo que era conveniente pedirlo en el mercado. </li><li> Los mejores resultados vendrán si todos los fragmentos son amplificado por PCR y purificados a partir de su plantilla de ADN. El marcador de resistencia es un buen lugar para dividir esta gran ADN en dos plantillas más pequeñas que son más fácilmente amplificado por PCR. </li><li> Enzima de restricción Restricción DpnI corta el ADN metilado. Si la plantilla de PCR era un miniprep a partir de E. coli, el tratamiento DpnI se retire la plantilla de ADN contaminante. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar todas las secuencias de ADN por separado y se produzca la elución en agua, o TE Buffer EB. <ol><li> Pore ​​vector parte 1, ~ 3000 pb (flechas verdes). Amplificó por PCR y DpnI tratada. </li><li> Pore ​​vector parte 2, ~ 3000 pb (flechas negras). Amplificó por PCR y DpnI tratada. </li><li> TriTag inserción, 437 pb (flechas azules). Pedido comercialmente. Resuspend en ddH 2 O. </li><li> P promotor ENTCUP, ~ 750 pb (flechas de color naranja). Amplificado por PCR y DpnI tratada. </li></ol></li><li> Medir las concentraciones de cada una de las piezas de ADN. Apunta a 150 ng / l de las piezas de vectores. </li><li> Tomar una alícuota de la mezcla de ensamblaje Gibson del congelador y descongelar en hielo. Este está disponible comercialmente, pero también fácil de hacer en el laboratorio 12-14. <ol><li> Hay dos pasos para esta receta: una mezcla maestra 5x viscosa y 15 alícuotas 1.33x reacción de tamaño mL. La mezcla maestra 5x contiene: 3 ml de 1 M de Tris-HCl pH 7,5, 300 l 1 M de MgCl 2, 600 l 10 mM de cada dNTP, 300 l de DTT 1 M, 1,5 g de PEG-8000, 20 mg de NAD, y ddH 2 O a 6 ml. Preparar 320 ml de alícuotas (18) y la congelación de todos menos uno a -20 ° C. La solución será bastante viscoso. Etiquetar estos &quot;tampón 5X isoterma&quot; </li><li> Para el resto (320 l), añadir 1,2 l T5 Exonucleasa, 20 l Phusion alta FidElity ADN polimerasa, 160 l de Taq ADN ligasa y 700 l ddH 2 O. Preparar 15 ml de alícuotas (~ 80) en el hielo en tubos de PCR y se almacena a -20 ° C. </li></ol></li><li> Determinar los volúmenes de cantidades equimolares de cada uno de los fragmentos. Hay algunas calculadoras en línea, incluyendo Gibthon.org. Debe haber un total de 5 l de todas las piezas de ADN. Añadir a la l 15 Gibson mezclar alícuota. Si esto requiere volúmenes demasiado pequeño para pipeta, diluir los fragmentos de ADN y / o utilizar más de una parte alícuota. <ol><li> No te olvides de preparar un control del ADN vector solo (por ejemplo, la parte de ADN que contiene el marcador de resistencia a los antibióticos) y completar el volumen con agua. </li></ol></li><li> Incubar los tubos en un termociclador a 50-55 ° C durante 30-60 minutos. Vuelva a colocar en hielo y se transforman en E. coli mediante choque térmico células químicamente competentes. No utilice células electrocompetentes. La alta concentración de sal y la concentración de ADN relativamente bajapueden hacer que las células ARC. <ol><li> Aplicar todos los 20 l de una preparación comercial de 200 l de cloruro de calcio competente de E. coli. Incubar en hielo 30 min y el calor de choque 60 segundos a 42 ° C </li><li> Volver a hielo 2 min, aplicar 750 l de SOC o medio LB y recuperar agitación en un tubo de microcentrífuga de 30 min a 37 ° C. Placa de la mezcla y las diluciones adecuadas en LB + Kan (u otro antibiótico adecuado). Esto puede resultar en un mayor fondo (y un mayor número de eventos de recombinación no objetivo) que la clonación basada en la ligadura tradicional, pero vale la pena analizar cerca de 10 colonias. </li></ol></li><li> Confirmar clon a través de la secuencia y almacenar una parte alícuota a -80 ° C </li></ol> 3. Biolístico transfección de Tabaco de la pistola de Gene Esta es una técnica que se establece en JoVe 18,19. Los pasos clave y las diferencias se describen a continuación. <ol><li> Crecer 50-100 ml E. coLi o 200 ml de Agrobacterium. Maxi-prep de la cultura. Una concentración de aproximadamente 1500 ng / l se requiere para continuar. </li><li> Preparar balas de pistola de genes tal como se describe anteriormente. Cargarlos en la pistola de genes. </li><li> Para la transfección de Nicotiana benthamiana tabaco tejido foliar epidérmica, elija una hoja grande cerca de la base de una planta de 3 meses de edad. Corte con cuidado y colocarlo parte inferior hacia arriba en toallas de papel húmedas en un plato de 15 cm de Petri. </li><li> Ajustar la presión de Él para la pistola de genes de 200 a 250 psi. </li><li> Apuntar con cuidado la pistola de genes entre las costillas en la parte inferior de una hoja, unos 3-5 cm por encima de ella. Suelte la seguridad y entregar las partículas a la hoja. Cada bala puede ser utilizado dos veces en el mismo lugar en la hoja. Si estalla la hoja, descartan y empezar una nueva vida-hay una cierta variación en la hoja de la dureza debido a las condiciones de crecimiento, tales como la edad, la humedad, etc Para una hoja de 12 cm, le espera para encajar alrededor de 6 disparos. </li><li> Guarde la hoja, cubierta con la parte superior de unPlaca de Petri durante 2-3 días con poca luz en el banquillo. </li><li> Examine la hoja en un microscopio de disección equipado con fluorescencia UV, y la búsqueda de las células individuales que expresan GFP. Diseccionar 5-10 mm secciones de la hoja. </li><li> Sumerja la hoja en un portaobjetos de microscopio de pozo profundo en ~ 200 l 0,1% de Triton X-100. El detergente ayuda a prevenir la formación de burbujas de aire en la superficie, y la profunda portaobjetos de microscopio y permite una zona de formación de imágenes de tejido más grande. </li></ol> 4. Microscopía Confocal del tejido Transfectadas Estas instrucciones varían para cada instrumento, por lo que es esencial para conseguir una formación adecuada. <ol><li> Para los experimentos de detección por fluorescencia, ajuste el láser de excitación a 489 nm, y establecer los detectores fotomultiplicadores de 500-569 nm para GFP fluorescencia y 630-700 nm para la clorofila autofluorescencia. Celdas de imagen utilizando un objetivo de inmersión en agua 40x. </li></ol>

<ol>
	<li>Que, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trait+stacking+in+transgenic+crops:+challenges+and+opportunities.">Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities.</a> GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).</li><li>Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+plant+splicing+code:+experimental+and+computational+approaches+for+predicting+alternative+splicing+and+splicing+regulatory+elements.">Deciphering the plant splicing code: experimental and computational approaches for predicting alternative splicing and splicing regulatory elements.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (18), (2012).</li><li>Hickey, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgene+regulation+in+plants+by+alternative+splicing+of+a+suicide+exon.">Transgene regulation in plants by alternative splicing of a suicide exon.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4701-4710 (2012).</li><li>Syed, N. H., Kalyna, M., Marquez, Y., Barta, A., Brown, J. W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+splicing+in+plants+-+coming+of+age.">Alternative splicing in plants - coming of age.</a> Trends in Plant Science. 17 (10), 616-623 (2012).</li><li>Black, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+alternative+pre-messenger+RNA+splicing.">Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing.</a> Annual Review of Biochemistry. 72, 291-336 (2003).</li><li>Dinkins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+transcriptional+initiation+sites+and+alternative+5'-+and+3'-splice+site+selection+of+the+first+intron+deploys+Arabidopsis+protein+isoaspartyl+methyltransferase2+variants+to+different+subcellular+compartments.">Changing transcriptional initiation sites and alternative 5'- and 3'-splice site selection of the first intron deploys Arabidopsis protein isoaspartyl methyltransferase2 variants to different subcellular compartments.</a> The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 55 (1), 1-13 (2008).</li><li>Kebeish, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplastic+photorespiratory+bypass+increases+photosynthesis+and+biomass+production+in+Arabidopsis+thaliana.">Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in Arabidopsis thaliana.</a> Nature Biotechnology. 25 (5), 593-599 (2007).</li><li>Maier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+Introduction+of+a+Glycolate+Oxidative+Cycle+into+A.+thaliana+Chloroplasts+Leads+to+Growth+Improvement.">Transgenic Introduction of a Glycolate Oxidative Cycle into A. thaliana Chloroplasts Leads to Growth Improvement.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (38), 1-12 (2012).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+the+isoprenoid+pathway+in+tobacco+by+expressing+the+cytoplasmic+mevalonate+pathway+in+chloroplasts.">Remodeling the isoprenoid pathway in tobacco by expressing the cytoplasmic mevalonate pathway in chloroplasts.</a> Metabolic Engineering. 14 (1), (2012).</li><li>Sapir-Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+localization+of+Arabidopsis+isopentenyl+diphosphate+isomerases+suggests+that+part+of+the+plant+isoprenoid+mevalonic+acid+pathway+is+compartmentalized+to+peroxisomes.">Peroxisomal localization of Arabidopsis isopentenyl diphosphate isomerases suggests that part of the plant isoprenoid mevalonic acid pathway is compartmentalized to peroxisomes.</a> Plant Physiology. 148 (3), 1219-1228 (2008).</li><li>Voges, M. J., Silver, P. A., Way, J. C., Mattozzi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+a+heterologous+protein+to+multiple+plant+organelles+via+rationally+designed+5'+mRNA+tags.">Targeting a heterologous protein to multiple plant organelles via rationally designed 5' mRNA tags.</a> Journal of Biological Engineering. 7 (20), (2013).</li><li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments.">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods in Enzymology. 498, 349-361 (2011).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).</li><li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome.">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li><li>Lowenson, J. D., Clarke, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+D-aspartyl+residues+in+polypeptides+by+the+erythrocyte+L-isoaspartyl/D-aspartyl+protein+methyltransferase.+Implications+for+the+repair+hypothesis.">Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).</li><li>Lanyon-Hogg, T., Warriner, S. L., Baker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+camel+through+the+eye+of+a+needle:+the+import+of+folded+proteins+by+peroxisomes.">Getting a camel through the eye of a needle: the import of folded proteins by peroxisomes.</a> Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 102 (4), 245-263 (2010).</li><li>Reumann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+analysis+of+Arabidopsis+leaf+peroxisomes+reveals+novel+targeting+peptides,+metabolic+pathways,+and+defense+mechanisms.">Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms.</a> The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).</li><li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture.">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Hollender, C. A., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bimolecular+Fluorescence+Complementation+(BiFC)+Assay+for+Protein-Protein+Interaction+in+Onion+Cells+Using+the+Helios+Gene.">Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene.</a> (40), (2010).</li><li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC.">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se describen estrategias simples para la localización de una única proteína transgénica a múltiples compartimentos celulares en plantas. El objetivo era diseñar constructo que expresara un solo gen en más de un orgánulo en Nicotiana benthamiana. Las estrategias incluyen el diseño racional de construcciones de ADN basada en GFP, el montaje de Gibson, la entrega de los plásmidos de células de las hojas con la pistola de genes, y la observación de los resultados con microscopía confoc...

Este trabajo es un proyecto de ingeniería / biología sintética metabólica en la que las células vegetales están diseñados para expresar una proteína reportera en varios orgánulos, pero con una única construcción de ADN. Un enfoque para dirigir proteínas a más de un lugar de clonación implica múltiples copias genéticas, cada uno que contiene un péptido de localización diferente. Cada copia debe ser introducida por los sucesivos retransformación, o alternativamente, por retrocruzamiento transformaciones individuales 1. Esto implica la clonación por adición, y está limitado por una etiqueta de localización por terminal. Otra forma de localizar una proteína para múltiples ubicaciones es a través de splicing alternativo 2-5. ARN se transcribe a partir de un único gen, pero diferentes copias de la transcripción se procesa de manera diferente, a menudo en más de una forma por célula. Esto puede resultar en más de un ARN mensajero en la célula transcrito a partir de un único gen. Estos diferentes messengeARN R puede codificar para diferentes isoformas de la misma proteína, o en el caso de un desplazamiento del marco, una proteína totalmente diferente. Aunque splicing alternativo ha sido descrita en la literatura para muchos años, los mecanismos de acción y de donantes conservadas y sitios de empalme del receptor sólo están siendo elucidados más recientemente 6. A medida que se describen mejor estos sitios, se abren oportunidades para la ingeniería. Ingenieros metabólicos Plant se enfrentan a un desafío cuando la expresión de una proteína en múltiples orgánulos. Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen varias veces, cada una con una secuencia señal separada dirigir a los orgánulos de interés. Para un solo gen en tres orgánulos, esto es simplemente tres genes. Sin embargo, para una vía metabólica de seis genes, esto se expande a 18 genes, un importante esfuerzo de clonación. Combinación de varias secuencias de localización en un único signo de genes empalmados alternativamente-reduce ificantly este esfuerzo. Por ejemplo, la reingeniería de la fotorrespiración 7,8 y la síntesis de isoprenoides 9,10 involucra tanto a los cloroplastos y peroxisomas. En nuestro caso nos aprovechamos de los sitios de empalme como se observa en un sistema de Arabidopsis thaliana naturales descrito previamente 6. Nos racionalmente rediseñado la secuencia de ARNm de salir de los sitios de empalme naturales solo, pero colocamos secuencias que codifican cloroplasto-o etiquetas al peroxisoma dentro de los intrones empalmados alternativamente-(Figura 1). La proteína expresada puede o no puede tener una etiqueta, dependiendo de si la pre-ARNm que lo codifica se escindió como un intrón (Figuras 1g y 1h). Para obtener más información sobre el diseño de las construcciones que se presentan en este trabajo, por favor vea el artículo del compañero 11. Debido a que este es todavía un esfuerzo significativo clonación, montaje Gibson, un nuevo método para la clonación de las construcciones de ADN, es used en la construcción. El método de Gibson puede ser utilizado para cualquier secuencia, con independencia de los sitios de restricción (Figura 2) 12-14. La mezcla específica de enzimas permite un solo paso, el montaje isotérmica. En este método, varias partes de ADN lineal de doble cadena están diseñados de tal manera que tienen secuencias solapantes de ~ 50 pb. El conjunto de mezcla de enzimas Gibson digiere parcialmente las partes lineales de ADN, la exposición de cadenas simples de secuencias homólogas. Estas secuencias de una sola hebra parciales se vuelven a recocidas en la mezcla de reacción, lo que resulta en una, de un solo paso, independiente de la secuencia, la reacción subclonación-ligadura libre rápida. Este trabajo describe 1) Diseño de construcciones racionales empalmados alternativamente para la expresión en los cloroplastos de las plantas, los peroxisomas, y citosoles, 2) su clonación utilizando el nuevo método de ligadura libre de reunión Gibson, 3) de su entrega a las células de las hojas de tabaco con la pistola de genes, y 4) resultados que muestran la orientación de orgánulos, como se observa con las buenas prácticas agrariasy microscopía confocal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Oligonucleotide primers</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td style="width:167px;">Design specifically for construct</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GeneBlocks</td>
			<td style="width:191px;">IDT</td>
			<td style="width:119px;">(custom)</td>
			<td>500 bp oligonucleotides</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ApE software</td>
			<td style="width:191px;">U Utah</td>
			<td style="width:119px;">(download)</td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MinElute kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28004</td>
			<td>Used to purify PCR products</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">QIAprep spin miniprep kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td>Used to prepare cloning-appropriate amounts of plasmid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phusion Master Mix with GC Buffer</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0532S</td>
			<td>Used to PCR-amplify gene of interest</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibson assembly reaction mix</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">E2611L</td>
			<td>Master mix of the following 9 ingredients</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M Tris-HCl pH7.5</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">T1075</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M MgCl2</td>
			<td style="width:191px;">G Biosiences</td>
			<td style="width:119px;">82023-086</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP mix</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0192</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 M DTT</td>
			<td style="width:191px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">R0861</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PEG-8000</td>
			<td style="width:191px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">19966</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NAD</td>
			<td style="width:191px;">Applichem</td>
			<td style="width:119px;">A1124,0005</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">T5 exonuclease</td>
			<td style="width:191px;">Epicentre</td>
			<td style="width:119px;">T5E4111K</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Taq DNA ligase</td>
			<td style="width:191px;">NEB</td>
			<td style="width:119px;">M0208L</td>
			<td>Gibson assembly mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gibthon.org</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Website to simplify calculations</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plasmid PLUS Maxi kit</td>
			<td style="width:191px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">12963</td>
			<td>Used to prepare DNA for gene gun bullets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gene Gun system</td>
			<td style="width:191px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">165-2451</td>
			<td>Includes all parts necessary</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nicotania benthamiana</td>
			<td style="width:191px;">(n/a)</td>
			<td style="width:119px;">(n/a)</td>
			<td>Gift of Jen Sheen, MGH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:191px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">SP5 X MP</td>
			<td>Imaging of resultant cells</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Deep well slides</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">71561-01</td>
			<td>Used for confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A Plasmid Editor (ApE) </td>
			<td style="width:191px;">University of Utah </td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gibthon:Ligation calculator</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transient gene expression in tobacco using gibson assembly and the gene gun

Con el fin de dirigirse a una sola proteína a múltiples orgánulos subcelulares, las plantas normalmente duplican los genes pertinentes, y expresan cada gen por separado utilizando estrategias regulatorias complejas incluyendo promotores diferenciales y / o secuencias de señal. Ingenieros metabólicos y biólogos sintéticos interesadas en la orientación de las enzimas a un orgánulo particular, se enfrentan a un desafío: Para una proteína que es para ser localizada a más de un orgánulo, el ingeniero debe clonar el mismo gen múltiples veces. Este trabajo presenta una solución a esta estrategia: aprovechar splicing alternativo del mRNA. Esta tecnología se aprovecha de cloroplasto establecido y secuencias de peroxisomas focalización y los combina en un único ARNm que se empalmados alternativamente. Algunas variantes de empalme se envían al cloroplasto, algunos hasta el peroxisoma, y ​​algunos al citosol. Aquí, el sistema está diseñado para múltiples orgánulo que apunta con el corte y empalme alternativo. En este trabajo, se espera que las buenas prácticas agrarias para ser exprEssed en el cloroplasto, citosol, y peroxisomas por una serie de diseñados racionalmente 5 &#39;etiquetas de ARNm. Estas etiquetas tienen el potencial de reducir la cantidad de clonación requerido cuando los genes heterólogos necesitan ser expresado en múltiples orgánulos subcelulares. Las construcciones fueron diseñadas en el trabajo anterior 11, y se clonaron utilizando el montaje de Gibson, un método de clonación independiente de ligación que no requiere enzimas de restricción. Los plásmidos resultantes se introdujeron en las células epidérmicas de la hoja de Nicotiana benthamiana con un protocolo modificado pistola de genes. Finalmente, las hojas transformadas se observaron con microscopía confocal.

El esfuerzo de diseño fue el resultado de una planificación significativa. Novela de este proyecto es la utilización del splicing alternativo para crear un pre-ARNm que se traduce en proteínas expresadas diferencialmente. Estas proteínas se expresan en diferentes orgánulos, en este caso el cloroplasto, peroxisomas y / o citosol. Adaptamos gen Arabidopsis natural que se empalmados alternativamente 6, y se coloca conocidos cloroplasto 6 y peroxisomas 17 secuencias dirigidas ...

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

transient-gene-expression-tobacco-using-gibson-assembly-gene

Research

JoVE Journal

Environment

20.4K vistas.  Harvard University.  Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad. 

Video: Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Much of the nutrient cycling and carbon processing in natural environments occurs through the activity of extracellular enzymes released by microorganisms. Thus, measurement of the activity of these extracellular enzymes can give insights into the rates of ecosystem level processes, such as organic matter decomposition or nitrogen and phosphorus mineralization. Assays of extracellular enzyme activity in environmental samples typically involve exposing the samples to artificial colorimetric or fluorometric substrates and tracking the rate of substrate hydrolysis. Here we describe microplate based methods for these procedures that allow the analysis of large numbers of samples within a short time frame. Samples are allowed to react with artificial substrates within 96-well microplates or deep well microplate blocks, and enzyme activity is subsequently determined by absorption or fluorescence of the resulting end product using a typical microplate reader or fluorometer. Such high throughput procedures not only facilitate comparisons between spatially separate sites or ecosystems, but also substantially reduce the cost of such assays by reducing overall reagent volumes needed per sample.

Microplate based procedures are described for the colorimetric or fluorometric analysis of extracellular enzyme activity. These procedures allow for the rapid assay of such activity in large numbers of environmental samples within a manageable time frame.

Determinación de la actividad enzimática extracelular microbiana en aguas, suelos y sedimentos de los que utilizan y alto rendimiento de microplacas Ensayos

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Investigación

Medio ambiente

Transcript and Metabolite Profiling for the Evaluation of Tobacco Tree and Poplar as Feedstock for the Bio-based Industry

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the exploration of renewable resources are necessary to overcome these challenges. Within the multinational framework MultiBioPro we are developing biorefinery pipelines to maximize the use of plant biomass. More specifically, we use poplar and tobacco tree (Nicotiana glauca) as target crop species for improving saccharification, isoprenoid, long chain hydrocarbon contents, fiber quality, and suberin and lignin contents. The methods used to obtain these outputs include GC-MS, LC-MS and RNA sequencing platforms. The metabolite pipelines are well established tools to generate these types of data, but also have the limitations in that only well characterized metabolites can be used. The deep sequencing will allow us to include all transcripts present during the developmental stages of the tobacco tree leaf, but has to be mapped back to the sequence of Nicotiana tabacum. With these set-ups, we aim at a basic understanding for underlying processes and at establishing an industrial framework to exploit the outcomes. In a more long term perspective, we believe that data generated here will provide means for a sustainable biorefinery process using poplar and tobacco tree as raw material. To date the basal level of metabolites in the samples have been analyzed and the protocols utilized are provided in this article.

Plant biomass offers a renewable resource for multiple products, including fuel, feed, food, and a variety of materials. In this paper we investigate the properties of tobacco tree (Nicotiana glauca) and poplar as suitable sources for a biorefinery pipeline.

Transcripción y metabolito de perfiles para la Evaluación de árbol Tabaco y Poplar como materia prima para la industria basada en Bio

The global demand for food, feed, energy, and water poses extraordinary challenges for future generations. It is evident that robust platforms for the ...

Tracking Microbial Contamination in Retail Environments Using Fluorescent Powder - A Retail Delicatessen Environment Example

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne illness. Ready-to-eat (RTE) processed foods such as deli meats, cheese, and in some cases fresh produce, have been involved in foodborne disease outbreaks due to contamination with pathogens such as Listeria monocytogenes. With respect to L. monocytogenes, deli slicers are often the main source of cross contamination. The goal of this study was to use a fluorescent compound to simulate bacterial contamination and track this contamination in a retail setting. A mock deli kitchen was designed to simulate the retail environment. Deli meat was inoculated with the fluorescent compound and volunteers were recruited to complete a set of tasks similar to those expected of a food retail employee. The volunteers were instructed to slice, package, and store the meat in a deli refrigerator. The potential cross contamination was tracked in the mock retail environment by swabbing specific areas and measuring the optical density of the swabbed area with a spectrophotometer. The results indicated that the refrigerator (i.e. deli case) grip and various areas on the slicer had the highest risk for cross contamination. The results of this study may be used to develop more focused training material for retail employees. In addition, similar methodologies could also be used to track microbial contamination in food production environments (e.g.&#160;small farms), hospitals, nursing homes, cruise ships, and hotels.

The overall goal of this study was to demonstrate the potential cross contamination mechanism of foodborne pathogen Listeria monocytogenes in a retail deli setting. This methodology may be applied to a variety of different environments to track pathogen contamination. &#160;

El seguimiento de la contaminación microbiana en los entornos comerciales Usando fluorescente Polvo - Un menor Charcutería Ambiente Ejemplo

Cross contamination of foodborne pathogens in the retail environment is a significant public health issue contributing to an increased risk for foodborne ...

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expresión recombinante de celulasa de Cel5A<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; En plantas de tabaco

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Screening productos alimenticios para la Clase 1 integrones y Gene Cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That represents 100 million tons of food being destroyed or diverted to non-human consumption each year. Aflatoxins are powerful carcinogens normally accumulated by the fungi Aspergillus flavus and A. parasiticus in cereals, nuts, root crops and other agricultural products. Silencing of five aflatoxin-synthesis genes by RNA interference (RNAi) in peanut plants was used to control aflatoxin accumulation following inoculation with A. flavus. Previously, no method existed to analyze the effectiveness of RNAi in individual peanut transgenic events, as these usually produce few seeds, and traditional methods of large field experiments under aflatoxin-conducive conditions were not an option. In the field, the probability of finding naturally contaminated seeds is often 1/100 to 1/1,000. In addition, aflatoxin contamination is not uniformly distributed. Our method uses few seeds per transgenic event, with small pieces processed for real-time PCR (RT-PCR) or small RNA sequencing, and for analysis of aflatoxin accumulation by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). RNAi-expressing peanut lines 288-72 and 288-74, showed up to 100% reduction (p&#8804;0.01) in aflatoxin B1 and B2 compared to the control that accumulated up to 14,000 ng.g-1 of aflatoxin B1 when inoculated with aflatoxigenic A. flavus. As reference, the maximum total of aflatoxins allowable for human consumption in the United States is 20 ng.g-1. This protocol describes the application of RNAi-mediated control of aflatoxins in transgenic peanut seeds and methods for its evaluation. We believe that its application in breeding of peanut and other crops will bring rapid advancement in this important area of science, medicine and human nutrition, and will significantly contribute to the international effort to control aflatoxins, and potentially other mycotoxins in major food crops.

RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem

We demonstrate a method for the analysis of aflatoxins and transgene expression in peanut seeds that contain RNA-interference signals for silencing aflatoxin-synthesis genes in the fungus Aspergillus flavus. RNAi-mediated control of mycotoxins in plants has not been reported previously.

Control de RNAi mediada por aflatoxinas en Maní: método para analizar la producción de micotoxinas y expresión transgénica en el cacahuete /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Patosistema

The Food and Agriculture Organization of the United Nations estimates that 25% of the food crops in the world are contaminated with aflatoxins. That ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly relevant as a model for the studies of osmoregulatory mechanisms because of its extreme tolerance to low salinity. It is also widely used as a model of settling biology, in particular in relation to antifouling research. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae for studies. A protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus has been developed and a detailed description of all steps in the production line is outlined (i.e., the establishment of adult cultures on panels, the collection and rearing of barnacle larvae, and the administration of feed for adults and larvae). The description also provides guidance on troubleshooting and discusses critical parameters (e.g., the removal of contamination, the production of high-quality feed, the manpower needed, and the importance of high-quality seawater). Each batch from the culturing system maximally yields roughly 12,000 nauplii and can deliver four batches in a week, so up to almost 50,000 larvae per week can be produced. The method used to culture B. improvisus is, probably, to a large extent also applicable to other marine invertebrates with free-swimminglarvae. Protocols are presented for the dissection of various tissues from adults as well as the production of high-quality RNA for studies on gene expression. It is also described how cultured adults and reared cyprids can be utilized in a wide array of experimental designs for examining gene expression in relation to external factors. The use of cultured barnacles in gene expression is illustrated with studies of possible osmoregulatory roles of Na+/K+ ATPase and aquaporins.

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is a model for studying osmoregulation and antifouling. However, natural seasonal spawning yields an unpredictable supply of cyprid larvae. Here, a protocol for the all-year-round culturing of B. improvisus is described, including the production of larvae. The use of cultured barnacles in gene expression studies is illustrated.

El percebe Balanus improvisus como modelo Marina - cultivo y expresión del gen

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into the plant&#39;s genome. Here, we present two transformation systems to genetically modify potato (Solanum tuberosum) plants. In A. tumefaciens transformation, leaves are infected, the transformed cells are selected and a new complete transformed plant is regenerated using phytohormones in 18 weeks. In A. rhizogenes transformation, stems are infected by injecting the bacteria with a needle, the new emerged transformed hairy roots are detected using a red fluorescent marker and the non-transformed roots are removed. In 5-6 weeks, the resulting plant is a composite of a wild type shoot with fully developed transformed hairy roots. To increase the biomass, the transformed hairy roots can be excised and self-propagated. We applied both Agrobacterium-mediated transformation methods to obtain roots expressing the GUS reporter gene driven by a suberin biosynthetic gene promoter. The GUS staining procedure is provided and allows the cell localization of the promoter induction. In both methods, the transformed potato roots showed GUS staining in the suberized endodermis and exodermis, and additionally, in A. rhizogenes transformed roots the GUS activity was also detected in the emergence of lateral roots. These results suggest that A. rhizogenes can be a fast alternative tool to study the genes that are expressed&#160;in roots.

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Here, we present two protocols to transform potato plants. The Agrobacterium tumefaciens transformation leads to a complete transgenic plant while the Agrobacterium rhizogenes produces transgenic hairy roots in a wild type shoot that can be self-propagated. We then detect promoter activity by GUS staining in the transformed roots.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more streamlined herbivory protocols. Perturbations of chewing insects are usually studied in whole plant systems. While this whole organism strategy is popular, it is not necessary if similar observations can be replicated in a single detached leaf. The assumption is that basic elements required for signal transduction are present within the leaf itself. In the case of early events in signal transduction, cells need only to receive the signal from the perturbation and transmit that signal to neighboring cells which are assayed for gene expression.
The proposed method simply changes the timing of the detachment. In whole plant experiments, larvae are confined to a single leaf which is eventually detached from the plant and assayed for gene expression. If the order of excision is reversed, from last in whole plant studies, to first in the detached study, the feeding experiment is simplified.
Solanum tuberosum var. Kennebec is propagated by nodal transfer in a simple tissue culture medium and transferred to soil for further growth if desired. Leaves are excised from the parent plant and relocated to Petri dishes where the feeding assay is conducted with the larval stages of M. sexta. Damaged leaf tissue is assayed for the expression of relatively early events in signal transduction. Gene expression analysis identified infestation-specific Cys2-His2 (C2H2) transcription factors, confirming the success of using detached leaves in early response studies. The method is easier to perform than whole plant infestations and uses less space.

The presented method creates natural herbivore damaged plant tissue through the application of Manduca sexta larvae to detached leaves of potato. The plant tissue is assayed for expression of six transcription factor homologs involved in early responses to insect herbivory.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Leaf Area Index Estimation Using Three Distinct Methods in Pure Deciduous Stands

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for describing the vegetation structure in the fields of ecology, forestry, and agriculture. Therefore, procedures of three commercially used methods (litter traps, needle technique, and a plant canopy analyzer) for performing LAI estimation were presented step-by-step. Specific methodological approaches were compared, and their current advantages, controversies, challenges, and future perspectives were discussed in this protocol. Litter traps are usually deemed as the reference level. Both the needle technique and the plant canopy analyzer (e.g., LAI-2000) frequently underestimate LAI values in comparison with the reference. The needle technique is easy to use in deciduous stands where the litter completely decomposes each year (e.g., oak and beech stands). However, calibration based on litter traps or direct destructive methods is necessary. The plant canopy analyzer is a commonly used device for performing LAI estimation in ecology, forestry, and agriculture, but is subject to potential error due to foliage clumping and the contribution of woody elements in the field of view (FOV) of the sensor. Eliminating these potential error sources was discussed. The plant canopy analyzer is a very suitable device for performing LAI estimations at the high spatial level, observing a seasonal LAI dynamic, and for long-term monitoring of LAI.

An accurate estimation of leaf area index (LAI) is crucial for many models of material and energy fluxes within plant ecosystems and between an ecosystem and the atmospheric boundary layer. Therefore, three methods (litter traps, needle technique, and PCA) for taking precise LAI measurements were in the presented protocol.

Estimación del índice de área hoja utilizando tres métodos distintos en soportes caducifolios puros

Accurate estimations of leaf area index (LAI), defined as half of the total leaf surface area per unit of horizontal ground surface area, are crucial for ...