Name: identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
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スペースの不足は、我々 はほとんどレビュー記事を引用し、その元作品が引用された私たちの同僚に申し訳。仮想研究所の仕事は、仮想に BSF、バード、米国農務省/NIFA NSF NIH からの補助金によってサポートされ、S.G.L. 研究所 NIH と S.G.L. に植物微生物学植物病理学の部門からの資金でサポートされて

1. 植物材料
<ol><li>植物の選択</li>
	<li>関心、すなわち、内因性のタンパク質のこのタンパク質をエンコード、またはウイルス蛋白質の病原体の自然宿主を表す 1 つの蛋白質へのネイティブ植物種を使用します。さらに、選択した植物種は選択した一過性形質転換法に従う必要があります。 注: 研究日常的に採用ベンサミアーナ タバコ、TMV の良いホストを表しますし、アグロバクテリウム形質転換技術、すなわち、agroinfiltration によって効率的に変換されます (手順 3 を参照)。(名) 形質転換植物はまた容易に育つ、アグロバクテリウムを簡単に接種され、共焦点顕微鏡を用いて簡単に大型の葉を持っています。</li>
	<li>
植物の成長
	<ol>
<li>高密度でぬれた土で(名) ベンサミアーナ種子を植物します。20-25 ° C ~ 75 µmol 光子 m-2の-1での光の下で 16 時間と闇の 8 h で環境試験室でそれらを保ちます。Euphyll の直径は、0.5 cm に達した後慎重に大きいポットに苗を転送し、同じ条件下で同じ部屋で成長を続けます。</li>
		<li>4 週間に最大葉がでは、直径 4-6 cm 以内 4 8 葉期になるまでの植物を維持します。この時、彼らは、agroinfiltration を使用できます (手順 3 を参照)。 注: 重要なは、決して植物を使用、彼らは花のため、この発達の段階で葉アーキテクチャ ステッピング24,25、時々 矛盾した結果につながるようになった場合。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 発現用ベクター構築
<ol><li>
発現系の選択
	<ol>
<li>式システム、すなわちベクトル、ベクトル配信方法、植物研究の興味の蛋白質の表現に最適なを選択します。 注: 時折、テスト蛋白質/植物の種のような特定の組み合わせ可能性があります特定のベクトルを必要として最適な表現と興味の蛋白質の機能の配信方法をベクトルします。最も双子葉植物でただし、表現のベクトルおよび配信システムとして agroinfiltration としてバイナリ プラスミドを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質蛍光タグ
	<ol>
<li>蛍光タグの各表現された蛋白質細胞内分布の22、Pd などの分析のため。 注: CFP、DsRed2 などの蛍光タンパク質をタグとして採用。CFP とテスト蛋白質のタグは、無料 DsRed2 と coexpress。CFP 機能タグとウイルス関連のない貨物分子の両方。一過性発現の全体的な効率を調整する DsRed2 機能、それは最初に変換されたセルを識別するために、セル自律この後者の機能は、可能性のある非-セル-自律テストされた蛋白質の細胞間移動を評価する際に重要です。また細胞自律的である、PDCB1、Pd マーカーとの共発現の CFP と DsRed2 と PDCB1 テスト蛋白質をタグします。</li>
		<li>親指のルールとして発現蛋白のカルボキシル末端を蛍光タグを融合します。ただし、Pd をターゲットしてタグ付きのフルレングス テスト蛋白質展示が侵害された場合は、タンパク質のアミノ末端にタグを転送します。</li>
		<li>適した植物発現ベクターにテストする蛋白質のコード配列のクローンを作成します。 注: 蛍光タグ付けを許可する多くの異なった植物発現ベクターがあります。我々 は pSAT プラスミド26のシリーズやアミノ酸の両方に推奨されるタグ (2.2.1 の手順を参照してください) フレーム内で直接興味のシーケンスのクローニングのために適している、誘導体27,28のいくつかを使用- とカルボキシル基末端方向。</li>
		<li>アグロバクテリウム バイナリ ベクトルに各式カセットを転送します。 注: pSAT ベースの構成が agroinfiltration、植物の組織に直接 biolistic 配信に適したは変換メソッド (手順 3 を参照)、ここで推奨されている必要があります T DNA の間に位置する式カセットバイナリのボーダーはベクトル29をです。 注: すべての pSAT ベクトル私 CeuI-SceI、から珍しい切削核酸アスキーを使用してクローン作成シングル ステップで pPZP RCS2 多重遺伝子発現ベクター26,30このような転送を許可する設計されています PI PspI と PI TliI26. 研究者 recombinatorial のクローンを活用することを好むなど、異種loxサイト31を使用して pSAT ベクトル変形26,27を使用できます。</li>
		<li>共発現、両方式カセットを転送、例えば、テスト蛋白質 CFP DsRed2 またはテスト蛋白質 CFP と PDCB1 DsRed2 (参照ステップ 2.1)、同じ pPZP RCS2 バイナリ ベクトルに。 注: また、アグロバクテリウム文化の個々 のバイナリ構造をかくまっていることが一緒に混合する(名) ベンサミアーナ浸潤の (ステップ 3.1 参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
アグロバクテリウムひずみ EHA105 または GV3101 として記述されている32の有能なセルのステップ 2.2.5 に 100 μ L の文化からの pPZP ベース RCS2 プラスミド 1 μ g を追加、氷上で 30 分間インキュベート、1 分の液体窒素で急速凍結し、15 分の 28 ° C の孵化させなさい。
	<ol>
<li>その後、有能なセルの混合物に 1 mL の LB 培地 (10 g/L トリプトン、5 グラム/L の酵母エキスと 10 g/L の NaCl) を追加 2, スピン 1 分 3,000 × g で細胞を 28 ° C で孵化させなさい、再 0.2 mL の lb にそれらを中断、それらを (例えば、100 mg/L スペクチノマイシン、ベクトルの pPZP ベース RSC226,3050 mg/L リファンピシン) 適切な抗生物質を添加した LB 寒天プレート。個々 のコロニーが表示されるまで 48 時間 28 ° C で成長します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ピックアップし、新鮮な LB 寒天培地プレート上にいくつかの個々 のコロニーをプレート (ステップ 3.1 を参照)、48 h、28 ° C で成長し、コロニー PCR33特定のバイナリ構造の存在を確認する分析のための細菌の少量を取る。</li>
	<li>
(手順 3.1.1 参照) 適切な抗生物質を添加した LB 培地 5 mL に 28 ° C で一晩関心の構築と各アグロバクテリウム コロニーを成長します。3,000 × g で細胞を遠心し、再外径600それらを一時停止 = 0.5 agroinfiltration バッファー (10 mM MgCl2、10 mM MES (pH 5.6)、150 μ M の acetosyringone)。2 時間室温で孵化させなさい。
	<ol>
<li>タンパク質の共発現の単一の多重遺伝子発現プラスミドではなくバイナリ プラスミドの混合物を使用している場合は、浸透する前に 1:1 v/v 比で対応する細胞培養をミックスします。その後、2 h 28 ° C でセルを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
完全に成熟した(名) ベンサミアーナの下 (裏面) 表皮に対して注射器 (針なし) のノズルの葉 1 mL プラスチック注射器押しに接種をロードします。手袋をはめた指で葉を向軸面34,35にしがみつきます。
	<ol>
<li>低速注入による浸透中アグロバクテリウムをご紹介します。統計的な有意性、それぞれの植物の葉をいくつかに潜入します。 注意: 彼らは一貫性のある表現のレベルを得られないよう古い葉に使用されないこと。</li>
		<li>すべての葉原を接種します。前述のステップ 1.2 観測まで浸透した植物を維持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 共焦点顕微鏡
<ol><li>静脈間のフラグメントに各葉をカットする刃を使用して (に応じて特定のテストされたタンパク質の一過性発現の効率); 浸潤後 24-48 h各組織スライスのサイズは、スライスは顕微鏡用カバーガラス (22 mm × 40 mm) で完全に覆われているようなことをする必要があります。</li>
	<li>場所オブジェクトの葉片スライド、米粒葉面葉スライスに水の滴を配置、カバーガラスでそれをカバーします。それぞれの側にテープの小片とカバーガラスを固定します。</li>
	<li>
レーザー共焦点顕微鏡の下 agroinfiltrated の組織を観察し、結果の画像を記録します。
	<ol>
<li>まず、10 X 対物レンズを使用して信号の細胞を特定しより詳細な観測のため 63 x 対物レンズを使用します。</li>
		<li>CFP と 543 を励起するアルゴン イオン レーザーから使用、458 nm 波長 nm DsRed2 を刺激します。画像の獲得、すなわち、レーザー強度と実験間の光電子増倍管 (PMT) 設定のすべての設定を保持します。平均では、実験条件ごとに 100-120 細胞を検査します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 の同定 PLS
<ol><li>共焦点顕微鏡 (セクション 4) を使用してテストされた蛋白質の局在を診断します。テスト蛋白質に特徴的な末梢点状パターン ・25,36,37,38,39,40,41かどうかに、colocalizes をチェックします。Pd マーカー PDCB123。これは、テスト対象のタンパク質が最も可能性の高い PLS シーケンスに含まれていることを示します。</li>
	<li>テスト蛋白質の PLS の活動の確認は徐々 により小さいフラグメント、autofluorescently、(例えばCFP、) にそのオープンリーディング フレーム (ORF) (genbank 受入番号 BAF93925.1) を分割した後、それぞれのタグし、分析、内局の手順 4 に記載されています。当初は、細分化されたフラグメントごとに 100 アミノ酸残基のサイズをお勧めします。</li>
	<li>切り捨てられたフラグメントを PLS の活動があるし、まだ Pd に局在する最小フラグメントまで前述の手順 4 で、内局をチェックをさらに細分化、すなわち蛍光タグ貨物を輸送するのに十分です。Pd には識別されます。このフラグメントは、PLS のシーケンスを表すと推定されます。</li>
	<li>蛍光タグに推定 PLS なしテスト蛋白質の残りの部分を実物大のテスト蛋白質、すなわちヒューズから推定 PLS を削除し、手順で説明するように結果変異体タンパク質の細胞内局在を決定4. 推定 PLS を欠いているが、この変異タンパク質が Pd に合わせてローカライズする失敗した場合特定 PLS ではないことだけ十分な (を参照してくださいステップ 5.3)、テスト蛋白質の Pd 輸送にも必要なが、これがわかります。</li>
	<li>Agroinfiltrate の PLS の CFP タグし、無料 DsRed2 (ステップ 3.3 を参照) 式をかくまっているアグロバクテリウム文化の混合物と葉を構築します。10 ステップ 4.3 と同じ設定を使用して倍の対物レンズを用いた共焦点顕微鏡浸潤組織を観察します。</li>
	<li>細胞初期浸潤細胞と CFP と DsRed2 の両方の信号が含まれて、その展示運動と CFP 信号のみを含まれている隣接するセルのスコアを獲得します。 注: この手順を調べその潜在的な細胞間移動能力の識別された PLSこれ Pd (含むほとんどの植物ウイルスの MPs) を対象とする多くの蛋白質はまた隣接セルに Pd を移動するためです。アグロバクテリウムの浸透のために使用の濃度はそれぞれ異なる構造の発現効率に依存します。Agroinfiltration の確実に変形されてないセルを残し、単一のセルの変換 (i)、(ii) 式のような効率を実現する細胞文化希釈を使用することを確認します。たとえば、我々 の実験はそれぞれ外径600 0.01 と CFP タグ PLS の無料 DsRed2 式の 0.005 を利用します。</li>
</ol>6. アラニン スキャン42を使用して残基キー PLS の同定
<ol><li>標準 PCR のプロトコルを使用して、望ましい突然変異、すなわちアラニン、各プライマーの中央部の周りにターゲットのアミノ酸残基の置換が含まれて説明するように設計したプライマーのペアを用いたシーケンスを符号化 PLSを増幅するには21. プライマー設計や製造元の指示に従ってサイト指示された突然変異誘発用サイト指示された突然変異誘発キットを運ぶ。</li>
	<li>任意標準 DNA 精製キットを使用して結果 PCR の製品の浄化し、保護者による制限をなくす DpnI 37 ° C にそれらを消化 (すなわち、非変異) メチル化と hemimethylated DNA。(氷) ではなく室温で 5 分間これをクールダウンします。エシェリヒア属大腸菌の有能なセル43, 混合物に直接変換し、ステップ 3.2 で説明されているように目的の突然変異体の構造に植民地を識別します。</li>
	<li>2.2.4 の手順で説明するようバイナリのベクトルに突然変異体の構造を導入、手順 3 で説明されているように、agroinfiltration を実行、Pd ターゲットに前述の手順 4 で 5.1 を評価します。</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

このプロトコルは 4 つのコア成分: が必要であり、Pd、興味の蛋白質のフラグメントの長さは、徐々 に小さく分割体系的なテストの融合へ十分なシーケンスを識別する概念フラグメントとしても役立つタグとして高分子貨物と Pd が生活の中でターゲット機能試金される蛋白質を植物の次のテストの融合タンパク質の一過性発現組織。一過性発現のアグロバクテリウム仲介されたがの時間、...

原形質 (Pd) は、植物の成長と形態形成、転写因子 mRNA と小さな RNA 分子に至るまでの主調整装置の細胞間輸送のための導管として機能します。さらに、Pd のこの高分子輸送能力を用いてほとんどの植物ウイルスの細胞間伝播感染;具体的に Pd1,2,3,4,5,6にターゲット移行タンパク質 (Mp) と呼ばれる特殊な蛋白質を進化してきた植物ウイルス Pd を通過するには,7. Pd 輸送の分子経路が最も可能性の高いこれらの経路に運ばれたタンパク質を対象とする特定のシーケンスと密接に相互接続されました。したがって、これらの Pd のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の識別は、対応する Pd 輸送経路の診断可能性があります。これは Pd 輸送8、類推によって異なる核輸入道に、異なる核局在化信号 (NLS) シーケンス9,10のために特定することができますたとえば。概念的には、NLSs と PLSs は、必要かつ十分な対象は、非分解の細胞内ターゲット シーケンスを表します。ただし、NLSs11とは異なり、シーケンスについては、PLSs は厳しく制限されています。具体的には、Pd をターゲットに関与する唯一の 4 つのタンパク質配列は、内因性の植物タンパク質から派生したそれらのすべての報告されています。最初の 1 つは、KN112 -内側の細胞層から植物葉13の表皮に移動する転写因子-そのノックス同族体14のホメオ ドメインによって表されます。また、2 つ目は、モチーフ15を転写因子、Dof、これは細胞間人身売買 (IT) として記載されている推定 PLS が含まれているからです。3 番目のシーケンス PDLP1 1 原形質常駐型膜タンパク質から、膜貫通ドメイン16によって表されます。最後に、シーケンスをターゲット 4 Pd の一種 (GPI) の報告された最近の固定された蛋白質、それは一種 (GPI) 変更信号17で表されます。
興味深いことに、ごく最近まで PLSs が報告されていないウイルスの MPs のため。以前の研究に植物ウイルス MPs18,19、すなわち、必要と Pd を無関係な貨物分子 (ターゲットに十分な最小限のアミノ酸配列などない真 PLS で推定 PLS シーケンスの存在が示されています。例えば。、CFP) ウイルスの MP で確認されました。まだこれらの蛋白質は、タバコ モザイク ウイルス(TMV) の MP の Pd の局在と輸送が実証20されている最初でした。
このギャップに対処する私たちは TMV MP PLS を識別する実験的戦略を開発しました。この戦略は、3 つの概念に基づいていた。(i) 我々 は必要かつ Pd21に標的蛋白質の十分な最小限アミノ酸として PLS を定義しました。(ii) ため、TMV MP をまず Pd をターゲットからこれらのチャンネル22移行し、これらの 2 つのアクティビティの連結を解くことと、善意の PLS は、Pd がターゲットだけとないため以降のトランスポート機能を識別するを目指した。(iii) は、Pd かどうか、構造的または機能的活動をターゲットに重要なアミノ酸残基の同定された PLS を分析しました。このアプローチを使用すると、我々 を善意の PLS として TMV MP のアミノ末端の 50 アミノ酸残基のシーケンスで区切られました。これは蛋白質の全体の長さを飽和 TMV MP フラグメントのシリーズを生産、CFP と彼らのカルボキシル末端のタグ付け、一過性植物組織でそれらを表現することによって行われました。各テストのフラグメントの Pd ローカリゼーションは、Pd マーカー蛋白質、PDCB1 (Pd カロース結合蛋白質 1)23でそれらを coexpressing によって決定されました。まだ pd、ローカライズが Pd を通過した最小フラグメントは、PLS を表すと考えられていた。最後に、PLS は、その構造や機能に必要な重要なアミノ酸残基を決定するアラニン スキャンでした。
ここで TMV MP PLS の同定を記述することによってこのアプローチを説明、一方それ使用されるかもしれない他の Pd 対象のタンパク質で PLSs を発見する植物病原菌、植物自体をエンコードするかどうかこれは本手法は Pd にターゲットする能力に関してウイルス MPs の固有の機能の利点を取らないので。

<table><tbody><tr><td>Confocal laser scanning microscope (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Any CLSM with similar capabilities is appropriate</td></tr><tr><td>Zen software for confocal microscope imaging</td><td>Zeiss</td><td>2009 version</td><td>The software should be compatible with the CLSM used</td></tr><tr><td>Quickchange II site-directed mutagenesis kit&amp;nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Syringes without needles</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of plasmodesmal localization sequences in proteins in planta

原形質 (Pd) は、小規模および大規模な分子は植物細胞間輸送されるゲートウェイとして機能する細胞間の接続です。生体高分子、このようなタンパク質の細胞間輸送がほとんどの特定ターゲット信号を含むアクティブなメカニズムを介して発生しますイオンと水などの小分子の Pd トランスポートは、受動的に発生すると推定されているに対し、分子を輸送しました。識別された原形質 (Pd) のローカリゼーションのシグナル (PLSs) の希少性蛋白質の並べ替えについて厳しく制限している経路に関与する植物細胞間高分子輸送と通信します。植物の富から Pd は、通過するトラフィックに知られている内因性やウイルスの蛋白質のみ 3 PLSs 報告されているまでに、内因性の植物タンパク質からそれらのすべて。したがって、それは、必要かつ十分な生活の中で直接、Pd のターゲット機能 PLS のシーケンスを識別するために信頼性の高いかつ体系的な実験的戦略を策定する重要な植物細胞。ここでは、私たちはパラダイムとしてタバコ モザイク ウイルス(TMV) の細胞間移行タンパク質 (MP) を使用して 1 つのような戦略をについて説明します。これらの実験は、識別され、最初の特徴は、植物の PLS のウイルス、最も Pd ターゲット蛋白質の PLS シーケンスの発見のために適応することができます。

忠実に記述されていたプロトコルから期待される結果を説明し、TMV MP PLS を識別する、代表的なデータは元らから適応されます。21.図 1 aは最初フルレングス TMV MP (1-268) TMV MP PLS (蛋白 1 50 最初 50 アミノ酸残基から成る) を表現する主要な構造を要約し、CFP (として生成するスキャン V4A 誘導体、アラニンが融合しました。手順 2.2 5.2 ...

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

8.2K ビュー.  State University of New York. 植物の細胞間の接続、原形質 (Pd)、生理学と植物ウイルスの相互作用工場で中心的な役割を果たしてください。Pd 輸送に重要なは、Pd にタンパク質を直接信号を並べ替えています。しかし、これらのシーケンスに関する知識はまだ始まったばかりで。Pd Pd ターゲット蛋白質のローカリゼーションのシグナルを識別するための戦略について述べる。

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

生化学

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in understanding how such pathways are organized and how they function. There are many methods to detect protein-protein interactions in cells, but relatively few can be used to detect interactions between endogenous proteins. One such method, the proximity ligation assay (PLA), has several advantages to recommend its use. Compared to other common methods of protein-protein interaction analysis, PLA has relatively high sensitivity and specificity, can be performed with minimal cell manipulation, and, in the protocol described herein, requires only two target-specific antibodies derived from different species (e.g., from mouse and rabbit) and one specialized reagent: a set of secondary antibodies that are covalently linked to specific oligonucleotides that, when brought in close proximity of one another, create an amplifiable platform for in situ PCR or rolling circle amplification. In this presentation, we show how to apply the PLA technique to visualize changes in MST1 and MST2 proximity in fixed cells. The technique described in this manuscript is particularly applicable for the analysis of cell signaling studies.

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Here, we show how to use a Proximity Ligation Assay (PLA) to visualize MST1/MST2 heterodimerization in fixed cells with high sensitivity.

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Preparation of Chloroplast Sub-compartments from Arabidopsis for the Analysis of Protein Localization by Immunoblotting or Proteomics

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as well as synthesis of essential metabolites. These organelles consist of the following three key sub-compartments. The envelope, characterized by two membranes, surrounds the organelle and controls the communication of the plastid with other cell compartments. The stroma is the soluble phase of the chloroplast and the main site where carbon dioxide is converted into carbohydrates. The thylakoid membrane is the internal membrane network consisting of grana (flat compressed sacs) and lamellae (less dense structures), where oxygenic photosynthesis takes place. The present protocol describes step by step procedures required for the purification, using differential centrifugations and Percoll gradients, of intact chloroplasts from Arabidopsis, and their fractionation, using sucrose gradients, in three sub-compartments (i.e., envelope, stroma, and thylakoids). This protocol also provides instructions on how to assess the purity of these fractions using markers associated to the various chloroplast sub-compartments. The method described here is valuable for subplastidial localization of proteins using immunoblotting, but also for subcellular and subplastidial proteomics and other studies.

Here, we describe a method to purify intact chloroplasts from Arabidopsis leaves and their three main sub-compartments (envelope, stroma, and thylakoids), using a combination of differential centrifugations, continuous Percoll gradients, and discontinuous sucrose gradients. The method is valuable for subplastidial and subcellular localization of proteins by immunoblotting and proteomics.

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

Chloroplasts are major components of plant cells. Such plastids fulfill many crucial functions, such as assimilation of carbon, sulfur and nitrogen as ...

Identification of Post-translational Modifications of Plant Protein Complexes

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to infection via the recruitment and activation of immune complexes. Activation of immune complexes is associated with post-translational modifications (PTMs) of proteins, such as phosphorylation, glycosylation, or ubiquitination. Understanding how these PTMs are choreographed will lead to a better understanding of how resistance is achieved.
Here we describe a protein purification method for nucleotide-binding leucine-rich repeat (NB-LRR)-interacting proteins and the subsequent identification of their post-translational modifications (PTMs). With small modifications, the protocol can be applied for the purification of other plant protein complexes. The method is based on the expression of an epitope-tagged version of the protein of interest, which is subsequently partially purified by immunoprecipitation and subjected to mass spectrometry for identification of interacting proteins and PTMs.
This protocol demonstrates that: i). Dynamic changes in PTMs such as phosphorylation can be detected by mass spectrometry; ii). It is important to have sufficient quantities of the protein of interest, and this can compensate for the lack of purity of the immunoprecipitate; iii). In order to detect PTMs of a protein of interest, this protein has to be immunoprecipitated to get a sufficient quantity of protein.

We describe here a protocol for the purification and characterization of plant protein complexes. We demonstrate that by immunoprecipitating a single protein within a complex, so we can identify its post-translational modifications and its interacting partners.

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

Plants adapt quickly to changing environments due to elaborate perception and signaling systems. During pathogen attack, plants rapidly respond to ...

生物学

A Strategy to Validate the Role of Callose-mediated Plasmodesmal Gating in the Tropic Response

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The establishment of an auxin gradient is a key event leading to phototropism and gravitropism. Previously, polar auxin transport (PAT) was shown to establish an auxin gradient in different cellular domains of plants. However, Han et al. recently demonstrated that for proper auxin gradient formation, plasmodesmal callose-mediated symplasmic connectivity between the adjacent cells is also a critical factor. In this manuscript, the strategy to elucidate the role of particular genes, which can affect phototropism and gravitropism by altering the symplasmic connectivity through modulating plasmodesmal callose synthesis, is discussed. The first step is to screen aberrant tropic responses from 3-day-old etiolated seedlings of mutants or over-expression lines of a gene along with the wild type. This preliminary screening can lead to the identification of a range of genes functioning in PAT or controlling symplasmic connectivity. The second screening involves the sorting of candidates that show altered tropic responses by affecting symplasmic connectivity. To address such candidates, the movement of a symplasmic tracer and the deposition of plasmodesmal callose were examined. This strategy would be useful to explore new candidate genes that can regulate symplasmic connectivity directly or indirectly during tropic responses and other developmental processes.

This article describes the methods for screening the genes controlling plasmodesmal permeability and hence auxin gradient during tropic response. This includes the measurement of the degree of tropic response in hypocotyl of Arabidopsis thaliana and checking plasmodesmal permeability by 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) loading and finally callose level assessment.

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

The plant hormone auxin plays an important role in many growth and developmental processes, including tropic responses to light and gravity. The ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

AirID-Based Proximity Labeling for Protein-Protein Interaction in Plants

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have proven successful in identifying protein-protein interactions (PPIs). APEX, BioID, and TurboID, a revised version of BioID have some restrictions in addition to being valuable technologies. The recently developed AirID, a novel version of BioID for proximity identification in protein-protein interactions, overcame these restrictions. Previously, AirID has been used in animal models, while the current study demonstrates the use of AirID in plants, and the results confirmed that AirID performs better in plant systems as compared to other PL enzymes such as BioID and TurboID for protein labeling that are proximal to the target proteins. Here is a step-by-step protocol for identifying protein interaction partners using AT4G18020 (APRR2) protein as a model. The methods describe the construction of vector, the transformation of construct through agroinfiltration, biotin transformation, extraction of proteins, and enrichment of biotin-labeled proteins through affinity purification technique. The results conclude that AirID is a novel and ideal enzyme for analyzing PPIs in plants. The method can be applied to study other proteins in plants.

Here, we present a step-by-step protocol for performing the proximity labeling (PL) experiment in cucumber (Cucumis sativus L.) using AT4G18020 (APRR2)-AirID protein as a model. The method describes the construction of a vector, the transformation of a construct through agroinfiltration, biotin infiltration, protein extraction, and purification of biotin-labeled proteins through affinity purification technique.

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

In mammalian cells and plants, proximity labeling (PL) approaches using modified ascorbate peroxidase (APEX) or the Escherichia coli biotin ligase BirA ...

Visualization and Quantification of Endogenous Intra-Organelle Protein Interactions at ER-Mitochondria Contact Sites by Proximity Ligation Assays

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium and lipids) between the juxtaposed organelles without involving membrane fusion. MCSs are essential for cellular homeostasis, and their functions are ensured by the resident components, which often exist as multimeric protein complexes. MCSs often involve the endoplasmic reticulum (ER), a major site of lipid synthesis and cellular calcium storage, and are particularly important for organelles, such as the mitochondria, which are excluded from the classical vesicular transport pathways. In the last years, MCSs between the ER and mitochondria have been extensively studied, as their functions strongly impact cellular metabolism/bioenergetics. Several proteins have started to be identified at these contact sites, including membrane tethers, calcium channels, and lipid transfer proteins, thus raising the need for new methodologies and technical approaches to study these MCS components. Here, we describe a protocol consisting of combined technical approaches, that include proximity ligation assay (PLA), mitochondria staining, and 3D imaging segmentation, that allows the detection of proteins that are physically close (&gt;40 nm) to each other and that reside on the same membrane at ER-mitochondria MCSs. For instance, we used two ER-anchored lipid transfer proteins, ORP5 and ORP8, which have previously been shown to interact and localize at ER-mitochondria and ER-plasma membrane MCSs. By associating the ORP5-ORP8 PLA with cell imaging software analysis, it was possible to estimate the distance of the ORP5-ORP8 complex from the mitochondrial surface and determine that about 50% of ORP5-ORP8 PLA interaction occurs at ER subdomains in close proximity to mitochondria.

The need for new approaches to study membrane contact sites (MCSs) has grown due to increasing interest in studying these cellular structures and their components. Here, we present a protocol that integrates previously available microscopy technologies to identify and quantify intra-organelle and inter-organelle protein complexes that reside at MCSs.

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

Membrane contact sites (MCSs) are areas of close membrane proximity that allow and regulate the dynamic exchange of diverse biomolecules (i.e., calcium ...

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーションシーケンスの同定

要約

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植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソフォームの Heterodimerization の検出

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーション シーケンスの同定

要約

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植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

免疫ブロットやプロテオミクスによるタンパク質局在の解析シロイヌナズナから葉緑体小班の準備

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

トロピック応答におけるカロース媒介Plasmodesmalゲーティングの役割を検証するための戦略

細胞膜の末梢関連タンパク質の分割の決定

マイクロタンパク質同定と配列解析のための統合アプローチ

植物におけるタンパク質間相互作用のためのAirIDベースの近接標識

近接ライゲーションアッセイによるER-ミトコンドリア接触部位における内因性オルガネラ内タンパク質相互作用の可視化と定量

タンパク質Planta Plasmodesmal ローカリゼーションシーケンスの同定

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソフォームの Heterodimerization の検出