Con TRAP, podemos investigar el procesamiento del desarrollo en resolución celular. Usamos promotores específicos de tipo celular para conducir una subunidad ribosomal etiquetada, y desde allí podemos aislar el ARN polisoma. Este protocolo produce ARN de alta calidad, pero en cantidades muy limitadas, por lo tanto, se necesitan métodos especializados para la entrada ultrabajo para producir de forma fiable bibliotecas de ARN de alta calidad.
TRAP es una herramienta ideal para la investigación de plantas, ya que muchos procesos de desarrollo se basan en vías de señalización mecánica y relacionadas con la pared celular. Utilizamos TRAP para estudiar la comunicación célula-célula en la formación de raíz lateral. Como la obtención de ARN de buena calidad demostró no ser tan directo como esperábamos, esperamos que esta instrucción de video paso a paso aumente la aplicabilidad de TRAP y ayude a promover esta poderosa técnica.
Para esterilizar las líneas homocigotas propagadas, esparza menos de 300 microlitros de semillas uniformemente en platos Petri de 12 por 12 centímetros cuadrados, y apila los platos en un desecador de 60 litros. Después de la esterilización de gas durante la noche, deje que el gas se evapore antes de recoger las semillas en un tubo de almacenamiento de 50 mililitros. Antes de enchapar, diluir las semillas esterilizadas con 0,1% de agar para obtener un mililitro de mezcla de semillas impregnadas por placa.
Para la mezcla de semillas, utilice tapas cuadradas para el plato Petri para crear un porta plantillas laminadas para plantar tres filas de semillas por plato, y coloque las placas de agar vacías en el soporte de la plantilla. Distribuya un mililitro de las semillas impregnadas uniformemente en tres filas de placas. Y coloque las placas procesadas en pilas en un flujo laminar, hasta que las semillas estén secas.
Cuando las semillas se hayan pegado a la superficie del agar, cierre las tapas y selle cada placa con cinta adhesiva de microprés. Para el tratamiento exógeno de las raíces de Arabidopsis con un agente de interés, prepare tiras de papel tisú de 1,5 a dos centímetros de ancho y 10 centímetros de largo. Remoje el papel tisú en 10 MIA micromolares y use pinzas para aplicar una tira de papel tisú a cada fila de raíces.
A continuación, presione suavemente cualquier burbuja de aire y vacíe el exceso de líquido de la placa, antes de etiquetar la placa con el tiempo. En el punto final experimental apropiado, utilice fórceps para extraer cuidadosamente las tiras de papel tisú de cada placa sin separar las raíces, y utilice una cuchilla quirúrgica para cortar una vez por fila a lo largo de la unión de raíz de brote, en un solo trazo determinado. Usa pinzas para deslizar a lo largo de las raíces de cada fila, para recoger las raíces en tres paquetes.
Y vacíe las raíces en un tubo de 50 mililitros lleno de nitrógeno líquido, para congelar a presión. Cuando se hayan recogido todas las muestras de raíz por tratamiento, decante el exceso de nitrógeno líquido utilizando la tapa del tubo para evitar que las raíces se derramen. Y coloque el tubo en un recipiente de hacedor, para un almacenamiento de 80 grados centígrados.
Para la molienda y homogeneización de tejidos, use guantes de algodón debajo de guantes de laboratorio estándar y agregue PMSF al tampón de extracción de polisomas. Vacíe la muestra de tejido en un mortero que contenga nitrógeno líquido y utilice un pestillo enfriado para moler cuidadosamente los tejidos hasta que todo el material aparezca como un polvo blanco. Cuando todo el tejido haya sido molido, agregue cinco mililitros de tampón de extracción de polisoma a la muestra y mezcle rápidamente los fragmentos de tejido congelados con el polvo antes de que el tampón se congele.
Tan pronto como la mezcla se puede transferir, vacíe la suspensión en un homogeneizador de vidrio sobre hielo, y utilice dos mililitros adicionales de tampón de extracción de polisoma para enjuagar el mortero y el pestillo. Moler manualmente la suspensión hasta que el extracto sea homogéneo. A continuación, vierta el extracto de raíz bruta en un tubo centrífugo de 50 mililitros sobre hielo, y procese la siguiente muestra como se ha demostrado.
Para la recolección total de ARN, transfiera 200 alícuotas de microlitros de cada muestra bruta a tubos de microcentrífugas individuales limpios, preenfriados y etiquetados. Para eliminar las paredes celulares, los desechos y los orgánulos grandes, centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante en tubos cónicos frescos y preenfriados para una segunda centrifugación. Mientras los tubos giran, aliquot 60 microlitros de cuentas magnéticas de GFP por muestra, en un tubo de 1,5 mililitros.
Y coloque el tubo en un soporte magnético, para facilitar la extracción de sobrenadantes. Luego, lave las cuentas dos veces en un mililitro de tampón de lavado en frío por lavado, y vuelva a suspender las perlas en 60 microlitros de tampón de lavado por muestra. Inmediatamente después de la centrifugación, decantar el sobrenadante despejado en tubos etiquetados de 15 mililitros, y agregue 60 microlitros de perlas lavadas a cada muestra.
A continuación, coloque todas las muestras horizontalmente en un cubo de hielo, durante una incubación de dos horas con balanceo. Al final de la incubación, recoja las perlas en un soporte magnético sobre hielo y agregue PMSF al búfer de extracción de polisoma restante. Después de desechar los sobrenadantes, agregue aproximadamente cinco mililitros de tampón de extracción de polisoma a las muestras, y vuelva a suspender las perlas dentro de las muestras con una inclinación suave.
Mece las muestras durante 15 minutos en la coctelera sobre hielo, seguido de dos lavados con tampón de lavado fresco en el imán, como se ha demostrado. Después del último lavado, transfiera las muestras en un mililitro de tampón de lavado, a un tubo de 1,5 mililitros. Y recoger las cuentas una vez más en el soporte magnético, para eliminar todo el sobrenadante.
A continuación, coloque los tubos sobre hielo hasta que se hayan procesado todas las muestras. Para el reacondicionamiento de los suministros de laboratorio, primero, enjuague todo el equipo en los residuos químicos. Lavar a mano los morteros, las plagas y los homogeneizadores con jabón, antes de enjuagar cada instrumento a fondo.
A continuación, coloque el equipo en un recipiente seguro para el calor y hornee los materiales durante la noche a más de 220 grados centígrados. Cepille todos los tubos centrífugos limpios con detergente, antes de colocar los tubos en una bandeja autoclaveable con una llanta y una campana de humo. Vierta un mililitro de pirocarbonato líquido de dietil y un litro de solución de agua desionizada en los tubos durante tres a 18 horas.
A continuación, recoja la solución antes de esterilizar la bandeja de tubos en el autoclave. Aquí se muestran las plantas representativas con señales GFP. La contramancha con yoduro propidium marca los contornos de la pared celular.
Las líneas corresponden al patrón de localización de la endodermis y al periciclo de polo xilem. En estas mediciones representativas obtenidas a partir de ARN polisoma, la mayoría de las muestras mostraron muy poca degradación, con números de integridad del ARN que oscilaban entre nueve y 10. En estos gráficos, se pueden observar rastros de bibliotecas preparadas con éxito, destacando la robustez del procedimiento, a pesar de los volúmenes de reacción reducidos.
Antes de que se produzca un conjunto de datos de expansión del genoma, el ARN TRAP de un experimento piloto puede ser sondeado por RTPCR cuantitativo para validar el éxito del tratamiento y/o las condiciones experimentales, así como la especificidad del tejido. En este análisis, la prueba de tres genes sensibles a la auxina confirmó una inducción hormonal exitosa después de dos horas de tratamiento. Los perfiles de genes marcadores específicos del tejido recuperados de los datos de secuenciación confirmaron la especificidad del tipo de célula.
Siga los consejos de buenas prácticas cuando maneje el ARN. Trabaje en un banco estéril, limpie su equipo con una solución para remover arneses, use guantes y cámbielos inmediatamente cuando se contaminen. Asegúrese de manipular y desechar adecuadamente todos los productos químicos y gases tóxicos que se han utilizado durante el procedimiento, especialmente el gas de cloro fenol-DEPC y el nitrógeno líquido.
En la cartera de estudios omic, TRAP ocupa un nicho importante, y ya se ha utilizado para responder a muchas preguntas biológicas, especialmente en biología del desarrollo, TRAP tiene un enorme potencial.
