Este trabajo fue apoyado por fondos de la enfermedad de Crohn y Colitis Foundation of America, (CCFA; 3711) Prevención del Cáncer y el Instituto de Investigación de Texas (CPRIT; RP160169), y UT Southwestern Medical Center dan a MHZ

Todos los experimentos aquí descritos se realizaron con ratones de 6-8 semanas de edad de tipo salvaje macho (C57BL6 / J) mantenido en una instalación libre de patógenos específicos (SPF) en el Centro de Recursos Animales (ARC), de UT Southwestern Medical Center. Todos los estudios fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) y se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del IACUC y los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Recogida y preparación del colon <ol><li> La eutanasia a los ratones con asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. </li><li> Pulverizar ratones con 70% de etanol y el pin extremidades para fijar una placa de mantenimiento de la cara dorsal del ratón sobre la tabla. </li><li> El uso de tijeras y pinzas de disección pre-esterilizados, hacer una incisión de línea media en el peritoneo del abdomen. Abrir el abdomen por plegado el peritoneo con fórceps. </li><li> Retire el intestino desde el wi cavidad abdominalº pinzas de disección y tijeras. Separar el colon desde el intestino delgado mediante el corte en la parte inferior del ciego y el otro extremo en el recto. </li><li> Coloque el colon en una placa petri estéril que contenía PBS enfriado en hielo. Enjuague el contenido de la luz del colon con PBS enfriado con hielo utilizando una jeringa de 20 ml que sostiene una aguja G 20 o una aguja de sonda oral hasta que la materia fecal dentro de la luz del colon es eliminado por completo. </li><li> Cortar el colon con tijeras longitudinalmente. Lavar el colon agitando vigorosamente en PBS enfriado con hielo en una placa de Petri estéril. </li><li> Cortar el tejido del colon en trozos de aproximadamente 1 cm de longitud utilizando un bisturí o tijeras estériles. </li><li> Anotar el peso de las piezas de colon. NOTA: Todos los pasos de la sección 1 se pueden realizar ya sea dentro o fuera de una cabina de seguridad biológica. Una vez que los dos puntos están listos para la cultura, todos los pasos se deben realizar dentro de una cabina de seguridad biológica para mantener la esterilidad. </li></ol> 2. Colon Orguna cultura <ol><li> Coloque un filtro de células (100 micras) en una placa de cultivo de 6 pocillos. Transferencia de todas las piezas de colon obtenidos de un ratón en el filtro de células. </li><li> Añadir 5 ml de medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS, penicilina-estreptomicina (1x), y gentamicina (20 mg / ml). Cubra completamente las piezas de colon con los medios de comunicación. </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO2 y 95% de aire. </li><li> Levante el filtro de células y aspirar los medios de comunicación. </li><li> Coloque el filtro de células de nuevo en el pozo y añadir 5 ml de medio fresco sin ningún antibiótico. Levante el filtro de células y aspirar los medios de comunicación. </li><li> Repita el paso anterior de lavado (Paso 2.5) dos veces más (3x total) para eliminar todos los antibióticos residuales. </li><li> La transferencia de las piezas de colon de un solo filtro de células en un solo pocillo de una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos. </li><li> Añadir medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS (sin antibióticos). Ajuste el volumen del medio con el Weight de las piezas de colon, por ejemplo, 1 ml de medio para 100 mg de tejido. Incubar durante 12 horas a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de CO2 y 95% de aire. </li><li> Recoger el sobrenadante del cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar a 12.000 xga 4 ° C durante 5 min. Separar el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml para su uso en las bacterias matar ensayo y / u otros ensayos inmunológicos. El sobrenadante se puede almacenar a -80 ° C hasta el ensayo. </li><li> Recoger las piezas de colon en un tubo para aislamiento de ARN. </li></ol> 3. Ensayo de E. coli Killing <ol><li> Inocular E. coli en ml Luria-Bertani (LB) caldo de 5 en un tubo de 15 ml y se incuba a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche. Mantenga la tapa del tubo de cultivo ligeramente suelto. </li><li> Centrifugar el tubo de cultivo bacteriano a 1200 xg durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en PBS 5 ml de hielo-frío. </li><li> Transferencia de 1 ml de la BACTsuspensión erial en una cubeta y OD medida a 600 nm. Utilice PBS como blanco. </li><li> Calcular la unidad formadora de colonias (ufc) utilizando una curva estándar predeterminada. Aquí, se supone que 1 DO = 2 x 10 9 ufc / ml (aproximadamente). </li><li> Diluir la suspensión bacteriana para hacer la suspensión de acciones 1 x 10 5 ufc / mL. </li><li> Transferir el sobrenadante de cultivo de órganos de colon (500 l / pocillo) recogidos en la Sección 2.10 en pocillos duplicados de una placa de cultivo celular de 24 pocillos. </li><li> Añadir 10 l de cultivo de E. coli (1.000 ufc) en un pocillo que contiene 500 l de órganos de colon sobrenadante del cultivo. Deje el otro bien sin ninguna inoculación E. coli para confirmar que el sobrenadante de cultivo de órganos de colon no contiene ninguna contaminación. </li><li> Incubar el mismo número de bacterias (1.000 ufc) en el medio de cultivo (DMEM / F12 más 5% FBS) sin antibióticos como un control. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Colocar 50 l de cada muestra de gota-wiSE en placas de agar MacConkey. Se incuban las placas de agar MacConkey a 37 ° C durante la noche. </li><li> Contar el número de colonias y calcular el ufc / ml. </li></ol> 4. El efecto de los factores extrínsecos e intrínsecos de colon antimicrobianos Las respuestas de defensa del huésped NOTA: El ensayo de destrucción antimicrobiana como se describe aquí se pueden adoptar para examinar el efecto de los patrones de patógenos asociados moleculares (PAMPs) y citoquinas sobre la actividad bactericida de sobrenadante de cultivo de órganos. Un ejemplo de tal experimento usando IL-1β y IL-18 se describe a continuación. <ol><li> Suma dos puntos de los ratones como se describe en la Sección 1. </li><li> Coloque los dos puntos sobre una toalla de papel estéril. Cortar los dos puntos longitudinalmente en tres partes con unas tijeras (Figura 2). </li><li> Lavar cada parte del colon en PBS frío como se describe en la Sección 1. </li><li> Corta cada parte del colon en trozos pequeños y se pesa asépticamente. La transferencia de las piezas de cada partede los dos puntos en tres tamices de células separadas (100 M) colocados en tres pocillos de una placa de cultivo celular de 6 pocillos (Figura 2). </li><li> Añadir 2 ml de DMEM medio / F12 que contenía 5% de FBS, penicilina-estreptomicina (1x), y gentamicina (20 mg / ml). </li><li> Incubar durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de CO2 y 95% de aire. </li><li> Lavar las piezas de colon como se describe en 2,4-2,6. La transferencia de las piezas de colon de un solo filtro de células en un solo pocillo de una placa de cultivo celular estéril de 12 pocillos. Los tres pocillos que contienen tres partes del colon de un solo ratón deben ser designados como no tratada, IL-1β, IL-18 y (figura 2). </li><li> Añadir medio DMEM / F12 que contenía 5% de FBS (sin antibióticos). Ajustar el volumen del medio con el peso de las piezas de colon, por ejemplo, 1 ml de medio para 100 mg de tejido. </li><li> Estimular el cultivo de órganos de colon con IL-1β (20 ng / ml) o IL-18 (20 ng / ml) durante 12 h. El colon sin tratar<html> cultivo de órgano sirve como control. </li><li> Después de 12 h de incubación a 37 ° C en una incubadora inyección de 5% de CO2 y 95% de aire, recoger el sobrenadante del cultivo en un tubo estéril de 1,5 ml. </li><li> Transferir 500 l del sobrenadante del cultivo en pocillos duplicados de una placa de 24 pocillos. </li><li> Inocular E. coli (1.000 ufc) en el órgano de colon sobrenadante de cultivo como se describe en la Sección 3. Para cada condición, inocular E. coli en un solo pozo. El otro pocillo que contiene sobrenadante del cultivo mismo órgano sin E. coli servirá como control para la contaminación bacteriana. </li><li> Incubar la misma cantidad de bacterias en medios de cultivo sin antibióticos como un control. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Colocar 50 l de cada muestra gota a gota sobre placas de agar MacConkey. Se incuban las placas de agar MacConkey durante la noche a 37 ° C. </li><li> Contar el número de colonias y calcular el ufc / ml (Figura 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. La medición de la expresión de genes antimicrobianos <ol><li> Después de la incubación durante la noche (12 h) de cultivo de órganos del colon como se describe en las secciones 2 y 4, lavar las piezas de colon con 2 ml de PBS enfriado con hielo (2x). </li><li> Reunir las piezas de colon en un tubo con tapón de rosca libre de 2 ml de RNasa / DNasa. Colocar los tubos en hielo. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo Trizol comercial y de lisis perlas de matriz en el tubo. </li><li> Lyse el tejido utilizando un homogeneizador de tejidos automatizada. </li><li> Recoger el lisado de tejido en un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Aislar el ARN utilizando el protocolo estándar. </li><li> Medir la concentración de ARN. </li><li> Diluir RNA apropiadamente con agua desionizada y el uso de 500 ng de ARN para sintetizar cDNA. </li><li> Utilice el ADNc para análisis en tiempo real de RT-PCR de genes dirigidos antimicrobianos, citocinas, quimiocinas y otros genes de interés. </li></ol>

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The authors have no competing financial interests.

Las células epiteliales intestinales son muy sensibles en cuanto a sus necesidades de crecimiento y por lo tanto difíciles de cultivar. Las células epiteliales aisladas por tratamiento con EDTA no sobreviven en medios de cultivo celular convencionales, tales como DMEM 8. Por lo tanto, huésped-patógeno estudios de interacción utilizando cripta aislado o células epiteliales primarias son muy difíciles. Recientemente, Sato et al. se describe un sistema de cultivo organoid cripta, que es muy ...

El intestino representa un sistema dinámico que actúa como una barrera para los microorganismos comensales, lucha contra los patógenos invasores, y regula la composición microbiana 1. Las células epiteliales intestinales, que consta de los enterocitos, células caliciformes, células de Paneth y células enteroendocrinas, son las principales poblaciones de células que proporcionan las respuestas de defensa del huésped contra microbiota intestinal. Las células caliciformes producen mucinas que crean una zona desmilitarizada en la parte superior de la capa epitelial 2. Las células de Paneth y enterocitos producen péptidos antimicrobianos, citoquinas, y las especies de oxígeno y nitrógeno reactivos que constituyen las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos y contribuyen a la formación de la composición microbiana intestinal 3, 4. Además de las células epiteliales, las células inmunes incluyendo macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, células asesinas naturales, linfocitos y inna<html> células linfoides de TE en la lámina propia y la submucosa juegan un papel crítico en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales por citoquinas que producen, quimiocinas, y otros mediadores de 5 - 7. Con el fin de entender cómo el sistema inmune de la mucosa regula microbiota y proporciona protección contra la infección microbiana, es importante tener en cuenta la compleja interacción de las poblaciones de células heterogéneas de la tripa. Sin embargo, un modelo in vitro que abarca todas las características del intestino no está disponible. Por lo tanto, los estudios moleculares en la interacción huésped-patógeno en el intestino son muy desafiante. En los últimos años, varios sistemas de modelos que imitan aspectos de la mucosa intestinal han sido desarrollados para la investigación de los procesos fisiopatológicos implicados en las enfermedades inflamatorias del intestino (IBD) y otros trastornos gastrointestinales 8 -= &quot;xref&quot;&gt; 14. líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas son a menudo utilizados para estudiar las respuestas específicas de células epiteliales. Sin embargo, debido a la expresión diferencial de genes y la función en las células inmortalizadas, los datos obtenidos del uso de esas células no suelen coincidir con los observados en los estudios in vivo. Cripta intestinal organoid cultura recientemente ha surgido como una herramienta potencial para la evaluación de la respuesta del epitelio intestinal a diferentes estímulos 13. En este sistema, se permitió que las células madre de la cripta para crecer y desarrollar una estructura organoid 3D. Mientras que el sistema de cultivo organoide es muy útil para el estudio de muchos aspectos del epitelio intestinal, que no imita la compleja interacción de las células inmunes, células epiteliales y productos microbianos. El cultivo ex vivo del tejido intestinal ofrece una mejor representación de las respuestas de defensa en vivo de acogida. En este método, una parte del intestino se cultiva en una placa de cultivo celular ingenioh medios adecuados que permitan a los diferentes tipos de poblaciones de células en el intestino para ser metabólicamente activo durante al menos 48 h. Por lo tanto, un cultivo ex vivo del órgano se puede utilizar para medir la expresión de genes antimicrobianos y las respuestas de defensa del huésped del intestino a un estímulo particular. Los investigadores han estado utilizando el sistema de cultivo de órganos ex vivo para estudiar las respuestas de defensa del huésped frente a la infección microbiana en el intestino 15 de - 21 años. Recientemente hemos adoptado el sistema de cultivo de órganos para estudiar el papel de la inflamasoma en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos en colones de ratones 22. El inflamasoma es una plataforma molecular para la activación de la caspasa-1, que se requiere para la producción de IL-1β madura y IL-18. Hemos demostrado que la IL-1β e IL-18 inducen péptidos antimicrobianos que matan con eficacia pathobionts comensales tales como E. coli </em&gt;. Esta observación fue consistente con el aumento de la carga de E. coli en colones de ratones inflamosoma-22 defectuosa. Este sistema, por lo tanto se puede utilizar para estudiar el papel de los receptores de reconocimiento de patrones (PRRS) y otras moléculas inmunes innatas en las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos intestinales, así como la patogénesis de los trastornos intestinales tales como la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) y el cáncer colorrectal (CRC). Hay más de 200 genes de susceptibilidad IBD, y mutaciones en muchos de estos genes están asociados con la composición microbiana alterada en el intestino. Es de gran importancia clínica para determinar el mecanismo preciso por el que los genes de susceptibilidad IBD-regulan microbiota intestinal. El objetivo general de este método es introducir un protocolo básico de ex vivo de cultivo de órganos de colon y demostrar cómo este método de cultivo se puede utilizar para estudiar las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos del intestino.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/ F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &amp;amp; Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>5634</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1b recombinan</td><td>Reprokine</td><td>RKP10749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-18 recombinant</td><td>Reprokine</td><td>RKP70380</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria-Bertani Broth&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0075-17-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Uded to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>BECKMAN</td><td>DU 530</td><td>Used to determine E. coli count</td></tr><tr><td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix S (1/8&quot;), 2 ml Tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G System</td><td>Bio-Rad</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>5687</td><td></td></tr><tr><td>Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td><td>Cellstar</td><td>5085</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>5698</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific orbital shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

El intestino muestra una arquitectura de cripta estructuras repetitivas que consisten en diferentes tipos de células epiteliales, lámina propia que contiene células del sistema inmune, y el estroma. Todas estas células heterogéneas contribuyen a la homeostasis intestinal y participar en la defensa del huésped antimicrobiana. Por lo tanto, la identificación de un modelo sustituto para el estudio de la respuesta inmune y la actividad antimicrobiana del intestino en un entorno in vitro es extremadamente difícil. Los estudios in vitro con líneas de células epiteliales intestinales inmortalizadas o incluso cripta primaria organoid cultura no representan la fisiología exacta del intestino normal y su microambiente. Aquí, se discute un método de tejido de colon cultivo ratón en una placa de cultivo y cómo este ex vivo sistema de cultivo de órganos se puede implementar en estudios relacionados con las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos. En experimentos representativos, se demostró que dos puntos en cultivo de órganos expresan péptidos antimicrobianos en respOnse a exógenos IL-1β y IL-18. Además, las moléculas efectoras antimicrobianos producidos por los tejidos de colon en el cultivo de órganos matan eficientemente Escherichia coli in vitro. Este enfoque, por lo tanto, puede ser utilizado para diseccionar el papel de patrones moleculares de patógenos y asociado de peligros y sus receptores celulares en la regulación de la respuesta inmune innata intestinales y las respuestas de defensa del huésped antimicrobianos.

Una imagen representativa de dos puntos en cultivo de órganos se muestra en la Figura 1. Las piezas de colon en la cultura siguen siendo metabólicamente y fisiológicamente activo. Responden de manera eficiente a los estímulos exógenos añadidos al medio de cultivo. Un flujo de trabajo esquemática de la preparación del tejido del colon para el cultivo ex vivo y la estimulación con estímulos exógenos, por ejemplo, IL-1β y IL-18, se muestra en l...

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The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organo cultura y su uso en estudios de defensa antimicrobiana de host

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

14.0K vistas.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Investigación

Bioquímica

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

In vitro organoide Cultura de tumores de colon primarios Ratón

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Medicina

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Investigación sobre el cáncer

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Inmunología e Infección

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Biología

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

Un sistema de cultivo de órganos intestinales intestinales para analizar las interacciones huésped-microbiota

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

Efectos epiteliales de la inflamación intestinal en colonoides murinos establecidos

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Autor destacado: Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

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Evaluar la viabilidad de un consorcio bacteriano sintético en la interfaz de Host-microbio In Vitro Gut

In vitro organoide Cultura de tumores de colon primarios Ratón

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

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Monocapas de Colonoid humano para estudiar las interacciones entre patógenos, comensales y epitelio Intestinal Host

Un nuevo método para la Cultura y polarizado estimulación de explantes mucosa intestinal humana

Un sistema de cultivo de órganos intestinales intestinales para analizar las interacciones huésped-microbiota

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos

Estudio de los efectos epiteliales de la inflamación intestinal in vitro en colonoides murinos establecidos