Name: the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies
Uploaded: 2017-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
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MHZに与えられた、とUTサウスウェスタン医療センター、がん予防テキサスの研究所（RP160169 CPRIT）;この作業は、クローン病とアメリカの大腸炎財団、（3711 CCFA）からの資金によってサポートされていました

ここで説明する全ての実験は、動物資源センター（ARC）、サウスウエスタン大学医療センターの特定病原体不在（SPF）施設で維持さ6〜8週齢の雄の野生型（C57BL6 / J）マウスを用いて行きました。すべての研究では、施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたとIACUCガイドラインおよび実験動物の管理と使用に関する健康ガイドの国立研究所に従って行いました。 1.収集とコロンの調製<ol><li>頸椎脱臼に続いてCO 2窒息でマウスを安楽死させます。 </li><li> 70％エタノールをマウスにスプレーし、ボード上のダウンマウスの背側を維持ピニングボードに手足をピン。 </li><li>予め滅菌解剖ハサミとピンセットを用いて、腹部の腹膜に中線切開を行います。鉗子で腹膜を折り畳むことにより、腹部を開きます。 </li><li>腹腔のwiから腸を削除します鉗子とはさみを解剖番目。盲腸の底部と直腸にもう一方の端に切断することにより、小腸からコロンを区切ります。 </li><li>氷冷PBSを含む滅菌ペトリ皿にコロンを置きます。コロンのルーメン内の便が完全に除去されるまで20 G針または経口胃管栄養針を保持する20 mLの注射器を使用して氷冷PBSで、大腸の内腔の内容をフラッシュします。 </li><li>縦にハサミでコロンをカット。滅菌ペトリ皿に氷冷PBS中で激しく振とうすることにより、大腸を洗浄します。 </li><li>約1cmの長滅菌メスやハサミを使用して小片に結腸組織をカット。 </li><li>結腸片の重量を記録します。 注：第1節のすべてのステップは、内部または生物学的安全キャビネットの外側のいずれかを行うことができます。コロンは、培養のための準備ができたら、すべてのステップは、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネット内で実行する必要があります。 </li></ol> 2.大腸組織文化<ol><li> 6ウェル細胞培養プレート上の細胞ストレーナー（100μm）を置きます。セルストレーナーに1匹のマウスから採取した結腸作品のすべてを転送します。 </li><li> 5％FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン（1×）、およびゲンタマイシン（20μg/ ml）を含有する5mlのDMEM / F12培地を追加します。完全にメディアと大腸の部分をカバーしています。 </li><li> 5％CO 2、95％空気インキュベーター中で37℃で2時間インキュベートします。 </li><li>セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。 </li><li>バックも上のセルストレーナーを配置し、任意の抗生物質を含まない5ミリリットルに新鮮な培地を追加します。セルストレーナーを持ち上げて、メディアを吸引除去します。 </li><li>残留抗生物質のすべてを除去するために、上記の洗浄工程（ステップ2.5）を2回以上（合計3回）繰り返します。 </li><li>滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーからコロン片を転送します。 </li><li> （任意の抗生物質を含まない）は、5％FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。 weigでメディアの音量を調整します結腸片のHT、 例えば 、100mgの組織のための1ミリリットル培地。 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートします。 </li><li>無菌の1.5mlチューブに培養上清を収集します。 </li><li> 5分間、4℃、12,000×gで遠心分離します。アッセイおよび/または他の免疫アッセイを殺す細菌中での使用のための新たな1.5 mLチューブに上清を分離します。上清を分析まで-80℃で保存することができます。 </li><li> RNA単離のためのチューブでコロン片を収集します。 </li></ol>アッセイキリング3. 大腸菌 <ol><li> 15mlチューブに5mLのルリア-ベルターニ（LB）ブロス中で大腸菌を接種し、一晩200 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。少しゆるめ培養管のキャップを保管してください。 </li><li> 4℃で10分間、1200×gで遠心分離細菌の培養管。上清を除去し、5mlの氷冷PBSに細菌ペレットを再懸濁します。 </li><li> BACTの移転を1mL600 nmでのキュベットとメジャーODにerialサスペンション。ブランクとしてPBSを使用してください。 </li><li>所定の標準曲線を用いて、コロニー形成単位（CFU）を計算します。ここでは、（約）1 OD = 2×10 9 CFU / mlのことを想定しています。 </li><li>ストック懸濁液1×10 5 CFU / mLのを作るために細菌懸濁液を希釈します。 </li><li> 24ウェル細胞培養プレートの複製ウェルに2.10に収集結腸器官培養上清を転送する（500μL/ウェル）。 </li><li> 1つのウェルを含む500μL大腸器官培養上清中に10μLの大腸菌培養液（千CFU）を追加します。大腸器官培養上清は、任意の汚染が含まれていないことを確認するために、任意の大腸菌接種せずに他のままにしておきます。 </li><li>コントロールとして任意の抗生物質を含まない培地（DMEM / F12 + 5％FBS）中の細菌の数が同じ（千CFU）をインキュベートします。 </li><li> 1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>各サンプルドロップのwiの50μLを配置SEマッコンキー寒天プレート上。 37℃で一晩マッコンキー寒天プレートをインキュベートします。 </li><li>コロニーの数をカウントし、CFU / mlで計算します。 </li></ol> 4.結腸抗菌宿主防御応答に対する外因性および内因性因子の影響注：ここで説明したように、抗菌性殺傷アッセイ、器官培養上清の殺菌活性の病原体関連分子パターン（のPAMPs）およびサイトカインの効果を調べるために採用することができます。 IL-1βおよびIL-18を使用して、このような実験例について説明します。 <ol><li>第1節で説明したようにマウスの大腸を収集します。 </li><li>滅菌ペーパータオル上でコロンを置きます。はさみを使用して、3つの部分（ 図2）へ縦方向にコロンをカット。 </li><li>第1節で説明したように、氷冷PBS中で、結腸の各部分を洗います。 </li><li>小片に結腸の各部分をカットし、無菌的に重量を量ります。各パーツの部分を転送します6ウェル細胞培養プレートの3つのウェル（ 図2）上に配置された3つの別々のセルストレーナー（100ミクロン）に結腸。 </li><li> 5％FBS、ペニシリン - ストレプトマイシン（1×）、およびゲンタマイシン（20μg/ ml）を含有する2ミリリットルのDMEM / F12培地を追加します。 </li><li> 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中、37℃で2時間インキュベートします。 </li><li> 2.4から2.6に記載されているように、コロンの部分を洗います。滅菌12ウェル細胞培養プレートの単一のウェルに、単一のセルストレーナーのコロンの部分を転送します。単一のマウスからの結腸の3部を含む3つのウェルは、未処理のIL-1β、およびIL-18（ 図2）として指定する必要があります。 </li><li> （任意の抗生物質を含まない）は、5％FBSを含むDMEM / F12培地を追加します。結腸片の重量、 例えば 、100mgの組織のために1 mLの培地で培地の音量を調整します。 </li><li> 12時間IL-1β（20 ngの/ ml）またはIL-18（20 ngの/ mL）で大腸器官培養を刺激します。未処理のコロン<html>器官培養は、コントロールとして機能します。 </li><li> 5％CO 2および95％空気を注入し、インキュベーター中で37℃で12時間インキュベートした後、滅菌した1.5 mLチューブに培養上清を収集します。 </li><li> 24ウェルプレートの複製ウェルに500μLの培養上清を移します。 </li><li>各条件については、項3に記載のように単一のウェルに大腸菌を接種し、大腸器官培養上清中の大腸菌 （千CFU）を接種します。ウェル大腸菌なしで同一の器官培養上清を含む他の細菌汚染の対照として役立ちます。 </li><li>コントロールとして、任意の抗生物質を含まない培地中で細菌の同量をインキュベートします。 </li><li> 1時間37℃でインキュベートします。 </li><li>滴下マッコンキー寒天プレート上の各サンプルの50μLを置きます。 37℃で一晩のためにマッコンキー寒天プレートをインキュベートします。 </li><li>コロニーの数を数え、CFU / mLの（ 図4）を計算します。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 5。抗菌遺伝子の発現の測定<ol><li>セクション2および4に記載されているように結腸器官培養物の一晩のインキュベーション（12時間）後、2 mlの氷冷PBS（2×）で結腸片を洗浄します。 </li><li> 2 mlのRNase / DNaseを無料でスクリューキャップチューブにコロン片を収集します。氷の上にチューブを入れます。 </li><li> 1ミリリットルを商業Trizol試薬を加え、チューブにマトリックスビーズを溶解。 </li><li>溶解自​​動組織ホモジナイザーを用いて組織。 </li><li>新しいマイクロチューブに組織溶解液を収集します。 </li><li>標準プロトコルを用いてRNAを分離します。 </li><li> RNA濃度を測定します。 </li><li>脱イオン水で適切にRNAを希釈し、cDNAを合成するために500 ngのRNAを使用します。 </li><li>標的抗菌遺伝子、サイトカイン、ケモカイン、および目的の他の遺伝子のリアルタイムRT-PCR分析のためのcDNAを使用します。 </li></ol>

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	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

腸上皮細胞は、それらの増殖要件の点で非常に敏感で培養することが困難です。 EDTA処理により単離された上皮細胞は、DMEM 8のような従来の細胞培養培地中で生存しません。そのため、孤立した陰窩または一次上皮細胞を用いて、宿主 - 病原体相互作用の研究は非常に困難です。最近、佐藤ら。腸の病態生理13に関連した研究のための非常に有望かつ有用で...

腸は、共生微生物、病原体の侵入と戦うための障壁として作用する動的システムを表し、及び微生物組成物1を調節します 。腸上皮細胞は、腸細胞、杯細胞、パネート細胞および腸内分泌細胞からなる、腸内微生物叢に対する宿主防御反応を提供する主要な細胞集団です。杯細胞は、上皮層2の上に非武装地帯を作成するムチンを産生します。パネート細胞および腸細胞は、抗菌性ペプチド、サイトカイン、および抗菌宿主防御応答を構成し、腸内微生物組成物3、4整形に寄与し、反応性酸素及び窒素種を生成します。上皮細胞に加えて、マクロファージを含む免疫細胞、樹状細胞、好中球、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、およびインナ<html> 7 -粘膜固有層および粘膜下組織のTEリンパ球様細胞は、サイトカイン、ケモカイン、および他のメディエーター5を生成することによって、腸抗菌宿主防御応答に重要な役割を果たしています。粘膜免疫系は、微生物叢を調節し、微生物感染に対する保護を提供する方法を理解するためには、消化管の不均一な細胞集団の複雑な相互作用を考慮することが重要です。しかし、腸の機能をすべて網羅in vitroモデルは使用できません。したがって、腸における宿主 - 病原体相互作用に関する分子研究は非常に挑戦的です。 過去数年にわたり、腸粘膜の側面を模倣するいくつかのモデル系は、炎症性腸疾患（IBD）および他の胃腸障害8に関わる病態生理学的プロセスを研究するために開発されています-= &quot;外部参照&quot;&gt; 14。不死化された腸上皮細胞系は、しばしば、上皮細胞特異的応答を研究するために使用されます。しかし、不死化細胞における示差的遺伝子発現および機能の、これらの細胞を使用することから得られたデータは、多くの場合、in vivo試験で観察されたものと一致していません。最近、種々の刺激13への腸管上皮の応答を評価するための潜在的なツールとして浮上してきたオルガノイド文化腸陰窩。このシステムでは、陰窩の幹細胞が増殖し、3Dオルガノイド構造を開発することが許可されています。オルガノイド培養システムは、腸管上皮の多くの側面を研究するために非常に有用であるが、それは、免疫細胞、上皮細胞および微生物産物の複雑な相互作用を模倣しません。腸組織のex vivo培養は、in vivo宿主防御応答のよりよい表現を提供しています。この方法では、腸の一部が細胞培養プレートウィットで培養します腸内の細胞集団の異なるタイプが、少なくとも48時間、代謝的に活性であることを可能にする時間の適切な媒体。このように、臓器のエクスビボ培養物は、抗菌性の遺伝子の発現と特定の刺激に対する腸の宿主防御応答を測定するために使用することができます。 21 -研究者は、腸15内の微生物感染に対する宿主防御応答を研究するためのex vivoでの器官培養系を使用してきました。我々は最近、マウスのコロン22における抗菌宿主防御応答におけるインフラマソームの役割を研究するために器官培養系を採用しました。インフラマソームが成熟IL-1βおよびIL-18の産生のために必要とされるカスパーゼ1の活性化のための分子プラットフォームです。我々は、IL-1βおよびIL-18が効果的に大腸菌など共生pathobiontsを殺す抗菌ペプチドを誘発することが示されました</em&gt;。この観察は、インフラマソーム欠陥マウス結腸22で増加した大腸菌負担と一致しました。このシステムは、したがって、パターン認識受容体（PRR）および腸抗菌宿主防御応答の他の先天性免疫の分子の役割だけでなく、そのような炎症性腸疾患（IBD）および結腸直腸癌（CRC）のような腸疾患の病因を研究するために使用することができます。そこに200以上のIBD感受性遺伝子であり、これらの遺伝子の多くの突然変異は、腸内で改変された微生物組成物に関連しています。これは、IBD感受性遺伝子が腸内細菌叢を調節するを通じて正確なメカニズムを決定するために偉大な臨床的意義のあります。この方法の全体的な目標は、ex vivoで結腸器官培養の基本的なプロトコルを導入し、この培養方法は、腸の抗菌宿主防御応答を研究するために使用することができる方法を示すことです。

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/ F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &amp;amp; Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>5634</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1b recombinan</td><td>Reprokine</td><td>RKP10749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-18 recombinant</td><td>Reprokine</td><td>RKP70380</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria-Bertani Broth&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0075-17-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Uded to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>BECKMAN</td><td>DU 530</td><td>Used to determine E. coli count</td></tr><tr><td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix S (1/8&quot;), 2 ml Tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G System</td><td>Bio-Rad</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>5687</td><td></td></tr><tr><td>Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td><td>Cellstar</td><td>5085</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>5698</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific orbital shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

腸上皮細胞の異なるタイプ、ラミナの免疫細胞を含むpropia、及び間質からなる反復陰窩構造のアーキテクチャを表示します。これらの異種の細胞のすべてが腸の恒常性に貢献し、抗菌宿主防御に参加しています。したがって、 インビトロの設定で免疫応答および腸の抗菌活性を研究するための代用モデルを特定することは極めて困難です。 インビトロ研究は、不死化腸上皮細胞株または正常な腸とその微小環境の正確な生理機能を表すものではありませんオルガノイド培養しても、プライマリのcryptを使用。ここでは、培養皿とどのようにこのex vivoの器官培養系抗菌宿主防御応答に関連した研究で実装することが可能で、マウスの結腸組織を培養する方法を議論します。代表的な実験では、器官培養内のコロンがRESPにおける抗菌ペプチドを発現することを示しました外因性IL-1βおよびIL-18にオンセ。さらに、器官培養における大腸組織によって生成された抗菌エフェクター分子を効率的にin vitroで大腸菌を殺します。このアプローチは、従って、腸の自然免疫応答および抗菌宿主防御応答の調節における病原体及び危険関連分子パターンとその細胞受容体の役割を分析するために利用することができます。

器官培養における結腸の代表的な画像は、 図1に示されています。文化の中でコロン片は、代謝および生理活性のまま。彼らは、培養培地に添加外因性の刺激に効率的に対応します。 ex vivoで培養し、外因性刺激による刺激、 例えば、IL-1βおよびIL-18結腸組織の調製の概略的な作業の流れは、 図2に示されています。器官培養中の...

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The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ザ<em&gt; ex vivoで</em&gt;コロン器官培養および抗菌生体防御研究におけるその使用

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

14.0K ビュー.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

ビデオ: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

生化学

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

医学

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

がん研究

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ザ<em&gt; ex vivoで</emマウス腸オルガノイドの&gt;文化とパターン認識受容体刺激

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

免疫・感染学

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

生物学

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮的影響

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

著者スポットライト:確立されたマウスコロノイドに対するIn vitroでの腸の炎症の上皮的影響の研究  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

ザ

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培養腸宿主微生物インターフェイスで合成細菌コンソーシアムの実行可能性を評価します。

プライマリマウス大腸腫瘍のin vitroオルガノイド培養で

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

ザ

病原体、共生生物、およびホストの腸上皮間の相互作用を研究する人間 Colonoid 単分子膜

人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する

確立されたマウスコロノイドに対する腸の炎症の上皮効果を in vitro で研究する