Name: the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies
Uploaded: 2017-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מימון קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, (CCFA; 3711) מניעת סרטן לבין מכון המחקר של טקסס (CPRIT; RP160169), ו UT Southwestern Medical Center שניתנה MHZ

כל הניסויים שתוארו כאן בוצעו באמצעות wild-type גבר בן 6-8 שבועות (C57BL6 / J) עכברים נשמרו מתקן חינם ספציפי פתוגן (SPF) במרכז משאבי בעלי החיים (ARC), המרכז הרפואי Southwestern UT. כל המחקרים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) ו נערכו בהתאם להנחיות IACUC לבין המכון הלאומי של מדריך הבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. איסוף והכנה של קולון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם מחנק 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס עכברים עם 70% אתנול ו להצמיד גפיים ללוח מצמיד שמירה בצד הגבי עכבר למטה על הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מראש מעוקר לנתח מספרי מלקחיים, לעשות חתך אונליין באמצע הצפק של הבטן. פתח את הבטן על ידי קיפול הצפק עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי מן wi חלל הבטןה לנתח מלקחיים ומספריים. הפרד את המעי הגס מן המעי הדק באמצעות חיתוך בתחתית של cecum ואת הקצה השני בבית הרקטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי סטרילית המכילה קר כקרח PBS. לרוקן את התוכן של לומן של המעי הגס עם קרים כקרח PBS באמצעות מזרק 20 מ&quot;ל מחזיק מחט 20 G או מחט gavage הפה עד שרפרף בתוך לומן של המעי הגס יוסר כליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הגס עם מספריים longitudinally. שטפו את המעי הגס על ידי רועדת במרץ קר כקרח PBS בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את רקמת המעי הגס לחתיכות כ 1 ס&quot;מ באמצעות אזמל או מספריים סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המשקל של החלקים המעי הגס. הערה: כל השלבים המפורטים בסעיף 1 יכול להתבצע גם בתוך או מחוץ ארון בטיחות ביולוגית. לאחר נקודות מוכנות תרבות, כל הצעדים חייבים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות. </li></ol> 2. קולון Orgתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא (100 מיקרומטר) על צלחת תרבית תאים 6 באר. להעביר את כל חלקי המעי הגסים שנאספו עכבר אחד לתוך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל DMEM / בינוני F12 המכיל 5% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (1x), ו gentamycin (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל). מכסות לחלוטין את חתיכות המעי הגס עם התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO 2 ואוויר 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את מסננת התא לשאוב התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת התא בחזרה על היטב ומוסיפים 5 מ&quot;ל התקשורת טריים ללא אנטיביוטיקה. הרם את מסננת התא לשאוב התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה מעל (שלב 2.5) עוד פעמים (3x הכל) כדי להסיר את כל האנטיביוטיקה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות המעי הגס מן מסננת תא בודד לתוך הבאר אחד של צלחת תרבית תאים סטריליים 12 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני DMEM / F12 המכיל FBS 5% (ללא אנטיביוטיקה). כוון את עוצמת הקול של המדיום עם weight של חתיכות המעי הגס, למשל, 1 בינוני מ&quot;ל עבור 100 מ&quot;ג של רקמת גוף. דגירה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת אוויר 5% CO 2 ו -95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant תרבות צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 12,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הפרד את supernatant לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש לשימוש חיידקים הרג assay ו / או מבחני אחרים של מערכת החיסון. את supernatant ניתן לאחסן ב -80 ° C עד assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השברים המעי הגס בתוך שפופרת עבור בידוד RNA. </li></ol> 3. חיידק הריגת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן בחיידק הזה 5 מ&quot;ל לוריא- Bertani (LB) מרק בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד לילה. שמור את הכובע של צינור התרבות מעט רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור תרבות חיידקי 1,200 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ו resuspend גלולה חיידקים לתוך 5 מ&quot;ל קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של bactההשעיה erial לתוך OD קובט ולמדוד ב 600 ננומטר. השתמש PBS כמו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחידת המושבה להרכיב (CFU) באמצעות עקומת סטנדרט קבוע מראש. הנה, להניח 1 OD = 2 x 10 9 CFU / ml (כ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את השעית החיידקים כדי להפוך את השעית מניית 1 x 10 5 CFU / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant תרבות איבר המעי הגס (500 μl / טוב) שנאסף בסעיף 2.10 לתוך בארות כפולות של צלחת תרבית תאי 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 תרבות coli μL E. (1000 CFU) לתוך supernatant תרבות איבר המעי הגס אחד היטב המכיל 500 μL. השאר הבאר השנייה ללא כל חיסון חיידק כדי לאשר את supernatant תרבות איבר המעי הגס אינו מכיל כל זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותו המספר של חיידקים (1,000 CFU) בתקשורת התרבות (FBS DMEM / F12 בתוספת 5%) ללא אנטיביוטיקה כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 μL של כל דגימה ירידה-wise על צלחות אגר MacConkey. דגירה צלחות אגר MacConkey ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות לחשב את CFU / ml. </li></ol> 4. השפעת חיצונית ו גורמים פנימיים על תגובות הגנה מארחות גס Antimicrobial הערה: assay הרג מיקרוביאלית כמתוארת כאן ניתן לאמץ כדי לבחון את השפעת דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) וציטוקינים על פעילות bactericidal של supernatant תרבות איברים. דוגמא ניסוי כזה באמצעות IL-1β ו- IL-18 מתוארת להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נקודתיים מעכברים כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעי הגס על מגבת נייר סטרילי. חותכים את המעי הגס longitudinally לשלושה חלקים באמצעות מספריים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל חלק של המעי הגס ב קר כקרח PBS כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל חלק של המעי הגס לחתיכות קטנות ולשקול בסביבה נקייה מחיידקים. מעביר את החתיכות של כל חלקשל המעי הגס לשלוש מסננות בתא נפרדות (100 מיקרומטר) הניחו על שלוש בארות צלחת תרבית תאי 6-היטב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל בינוני DMEM / F12 המכיל 5% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (1x), ו gentamycin (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת אוויר 5% CO 2 ו -95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את חלקי נקודות כמתוארים 2.4-2.6. מעבירים את חתיכות המעי הגס של מסננת תא בודד לתוך הבאר אחד של צלחת תרבית תאים סטריליים 12 גם. השלוש הבארות המכילות שלושה חלקים של המעי הגס מתוך עכבר אחת צריכות להיות מיועדות מטופל, IL-1β, ו- IL-18 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני DMEM / F12 המכיל FBS 5% (ללא אנטיביוטיקה). כוון את עוצמת הקול של המדיום עם משקל של חתיכות המעי הגס, למשל, 1 בינוני מ&quot;ל עבור 100 מ&quot;ג של רקמת גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את תרבות איבר המעי הגס עם IL-1β (20 ng / mL) או IL-18 (20 ng / mL) במשך 12 שעות. נקודות המטופל<html> תרבות איבר משמשת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 הדגירה שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת 5% CO 2 ו -95 אוויר%, לאסוף את supernatant תרבות צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 500 μL supernatant התרבות לתוך בארות כפולות של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן E. coli (1,000 CFU) ב supernatant תרבות איבר המעי הגס כמתואר בסעיף 3. עבור כל תנאי, לחסן בחיידק הזה באר יחיד. שני היטב המכיל אותו האיבר supernatant התרבות ללא אי-קולי ישמש כשלט עבור זיהום חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את אותה כמות של חיידקים בתקשורת תרבות ללא אנטיביוטיקה כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 μL של כל דגימה-חכם טיפה על צלחות אגר MacConkey. דגירה צלחות אגר MacConkey עבור לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות לחשב את CFU / mL (איור 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. מדידה של הביטוי של גנים Antimicrobial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה לילה (12 שעות) של התרבות איבר הגס כמתואר בסעיפים 2 ו -4, לשטוף את חתיכות המעי הגס עם 2 מ&quot;ל PBS קר כקרח (2x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השברים המעי הגס לתוך צינור בורג מכסה חינם 2 מ&quot;ל RNase / DNase. מניחים את הצינורות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מסחרי מגיב Trizol וחרוזים מטריקס lysing לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse הרקמה באמצעות homogenizer רקמות אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את lysate רקמה לתוך צינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA באמצעות פרוטוקול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ריכוז RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל RNA כראוי עם מים ללא יונים ולהשתמש 500 RNA ng לסנתז cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cDNA לניתוח בזמן אמת RT-PCR של גנים מיקרוביאלית ממוקד, ציטוקינים, כמוקינים, וגנים אחרים בעלי עניין. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

תאי אפיתל המעי רגישים מאוד מבחינת דרישות הצמיחה שלהם ולכן קשים תרבות. תאי אפיתל מבודדים על ידי טיפול EDTA אינם שורד תרבית תאי תקשורת קונבנציונלית כגון DMEM 8. לכן, מחקרי אינטראקציה לפתוגן מארח באמצעות הקריפטה מבודד או תאי אפיתל עיקריים הם מאוד מאתגרים. לאחרו?...

המעי מייצג מערכת דינאמית כי משמשת כמחסום עבור מיקרואורגניזמים commensal, נלחם נגד פתוגנים פולשים, ומסדיר את רכב חיידקי 1. תאי אפיתל במעי, מורכב enterocytes, תאי גביע, תאי פנט ותאי enteroendocrine, הוא אוכלוסיות התאים העיקריות המספקות תשובות הגנה מארחות נגד חיידקים במעיים. תאי הגביע לייצר מוקיוס יוצרים מפורזים על גבי שכבת אפיתל 2. התאים ו enterocytes פנט לייצר פפטידים מיקרוביאלית, ציטוקינים, ומיני חמצן וחנקן תגובתי המהווים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית לתרום לעיצוב בהרכב המיקרוביאלי במעיים 3, 4. בנוסף לתאי אפיתל, תאי מערכת החיסון כולל מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, תאי הרג טבעיים, לימפוציטים, ואינה<html> תאי הלימפה טה שכבת הרירית המיוחדת ואת submucosa לשחק תפקיד קריטי בתגובות ההגנה המארחת מיקרוביאלית מעיים על ידי ציטוקינים ייצור, כמוקינים, ומתווכים אחרים 5 - 7. כדי להבין איך המערכת החיסונית ברירית מסדיר חיידקים ומספקת הגנה מפני זיהום מיקרוביאלי, חשוב לשקול את יחסי הגומלין המורכבים של אוכלוסיות תאים הטרוגנית של המעי. עם זאת, מודל במבחנה שמקיף את כל התכונות של המעי אינו זמין. לכן, מחקרים מולקולריים על אינטראקצית מארח הפתוגן במעי הם מאוד מאתגרים. במהלך השנים האחרונות, מערכות מודל מספר המחקים ההיבטים של רירית המעי פותחו על חקירת תהליכים פתופיזיולוגיים המעורבים במחלות מעי דלקתיות (IBD) והפרעות במערכת העיכול אחרים 8 -= &quot;Xref&quot;&gt; 14. הונצחו שורות תאים אפיתל במעי משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד מענה ספציפי תא אפיתל. עם זאת, בגלל ביטוי גנים ההפרש ותפקוד בתאים הנציח, את הנתונים המתקבלים באמצעות תאים אלה אינם לעיתים קרובות להתאים עם אלו שנצפו במחקרים in vivo. הקריפטה מעי organoid התרבות התפתח לאחרונה ככלי פוטנציאל להערכת התגובה של האפיתל במעי לגירויים שונים 13. במערכת זו, תאי גזע הקריפטה מותר לגדול ולהתפתח מבנה organoid 3D. בעוד מערכת התרבות organoid מאוד שימושי לחקר היבטים רבים של האפיתל במעי, זה לא לחקות את האינטראקציה המורכבת של תאי מערכת החיסון, תאי אפיתל ומוצרים מיקרוביאלי. תרבות vivo לשעבר של רקמת המעי מציעה ייצוג טוב יותר של תגובות הגנה מארחות in vivo. בשיטה זו, חלק של המעי הוא בתרבית שנינות צלחת תרבית תאיםתקשורת h המתאימה המאפשרת את הסוגים השונים של אוכלוסיות תאים במעי להיות פעילה מבחינה מטבולית עבור h 48 לפחות. לפיכך, תרבות vivo לשעבר של האיבר יכול לשמש כדי למדוד את הביטוי של גנים מיקרוביאלית והתגובות ההגנה המארחת של המעי לגירוי מסוים. חוקרים כבר משתמשים במערכת תרבות איבר vivo לשעבר ללמוד תגובות הגנה מארחות נגד זיהום מיקרוביאלי במעי 15 - 21. לאחרונה אמצו את מערכת התרבות האיבר כדי ללמוד את התפקיד של inflammasome בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית נקודות עכבר 22. Inflammasome היא פלטפורמה מולקולרית עבור הפעלת caspase-1, אשר נדרש לייצור התבגר IL-1β ו- IL-18. הראינו כי IL-1β ו- IL-18 להשרות פפטידים מיקרוביאלית אשר למעשה להרוג pathobionts commensal כגון E. coli </em&gt;. תצפית זו עולה בקנה אחד עם ניטל coli גדילת א ב 22 נקודות עכבר פגום-inflammasome. מערכת זו ולכן ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) ומולקולות חיסון מולדות אחרות בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית מעיים וכן בפתוגנזה של הפרעות במערכת עיכול כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן מעי גס (CRC). ישנם יותר מ -200 גני רגישות IBD, ומוטציות רבות מאותם גנים המשויכים רכב חיידקים שינה במעיים. זה הוא בעל משמעות קלינית רבה לקבוע את המנגנון המדויק שדרכו גני IBD-הרגישות להסדיר חיידקים במעיים. המטרה הכללית של שיטה זו היא להציג את פרוטוקול בסיסי בתרבות איבר vivo לשעבר מעי גס להדגים כיצד שיטת התרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית של המעי.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/ F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &amp;amp; Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>5634</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1b recombinan</td><td>Reprokine</td><td>RKP10749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-18 recombinant</td><td>Reprokine</td><td>RKP70380</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria-Bertani Broth&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0075-17-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Uded to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>BECKMAN</td><td>DU 530</td><td>Used to determine E. coli count</td></tr><tr><td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix S (1/8&quot;), 2 ml Tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G System</td><td>Bio-Rad</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>5687</td><td></td></tr><tr><td>Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td><td>Cellstar</td><td>5085</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>5698</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific orbital shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

המעי מציג ארכיטקטורה של מבנים הקריפטה חוזרים המורכבים מסוגים שונים של תאי אפיתל, שכבת רירית מיוחדת המכילה תאים חיסוניים, ו stroma. כל תאים הטרוגניים אלו תורמים הומאוסטזיס מעיים ולהשתתף הגנה מארחת מיקרוביאלית. לכן, זיהוי מודל פונדקאי ללימוד תגובה חיסונית ופעילות מיקרוביאלית של המעי בסביבה במבחנה הוא מאוד מאתגר. במחקרים במבחנה באמצעות שורות תאים אפיתל במעי הנציחו או אפילו הקריפטה עיקרי organoid תרבות אינו מייצגים את הפיסיולוגיה המדויקת של מעי נורמלי microenvironment שלה. כאן, אנו דנים בשיטה של רקמת מעי גסת עכבר culturing בצלחת התרבות וכיצד מערכת ההתרבות לשעבר vivo האיבר הזה יכול להיות מיושמת במחקרים הקשורים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית. בניסויי נציג, הראינו כי נקודות בתרבות איבר לבטא פפטידים מיקרוביאלית שו&quot;תonse IL-1β אקסוגניים ו- IL-18. יתר על כן, מולקולות מפעיל מיקרוביאלית המיוצר על ידי רקמות המעי הגס בתרבות איבר ביעילות להרוג coli Escherichia במבחנה. גישה זו, אם כן, יכולה להיות מנוצלת כדי לנתח את התפקיד של דפוסים מולקולריים pathogen- וסכנה הקשורים ואת הקולטנים הסלולרי שלהם בויסות תגובה חיסונית מולדת מעיים ותגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית.

תמונה מייצגת של נקודות בתרבות איבר מוצגת באיור 1. חתיכות המעי הגס בתרבות להישאר מבחינה מטבולית ופעיל מבחינה פיזיולוגית. הם מגיבים ביעילות לגירויים חיצוניים מתווספים התקשורת והתרבות. זרם עבודה סכמטית של הכנת הרקמה המעי הגס לתרבות vivo לשעב...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

14.0K Views.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Video: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biochemistry

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Medicine

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Cancer Research

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Biology

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

השפעות אפיתל של דלקת מעיים על קולונואידים מורינים מבוססים

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

Author Spotlight: חקר ההשפעות האפיתליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

ה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הערכת הכדאיות של קונסורציום חיידקי סינתטי על הממשק מארח-חיידק במעיים במבחנה

בתרבות Organoid מבחנה של גידולים במעי גס עכבר העיקרי

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

ה

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

מערכת תרבית איברי מעיים לניתוח אינטראקציות מארח-מיקרוביוטה

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים