עבודה זו נתמכה על ידי מימון קרוהן קוליטיס קרן של אמריקה, (CCFA; 3711) מניעת סרטן לבין מכון המחקר של טקסס (CPRIT; RP160169), ו UT Southwestern Medical Center שניתנה MHZ

כל הניסויים שתוארו כאן בוצעו באמצעות wild-type גבר בן 6-8 שבועות (C57BL6 / J) עכברים נשמרו מתקן חינם ספציפי פתוגן (SPF) במרכז משאבי בעלי החיים (ARC), המרכז הרפואי Southwestern UT. כל המחקרים אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) ו נערכו בהתאם להנחיות IACUC לבין המכון הלאומי של מדריך הבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. 1. איסוף והכנה של קולון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים עם מחנק 2 CO ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריסוס עכברים עם 70% אתנול ו להצמיד גפיים ללוח מצמיד שמירה בצד הגבי עכבר למטה על הלוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מראש מעוקר לנתח מספרי מלקחיים, לעשות חתך אונליין באמצע הצפק של הבטן. פתח את הבטן על ידי קיפול הצפק עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי מן wi חלל הבטןה לנתח מלקחיים ומספריים. הפרד את המעי הגס מן המעי הדק באמצעות חיתוך בתחתית של cecum ואת הקצה השני בבית הרקטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעי הגס בצלחת פטרי סטרילית המכילה קר כקרח PBS. לרוקן את התוכן של לומן של המעי הגס עם קרים כקרח PBS באמצעות מזרק 20 מ&quot;ל מחזיק מחט 20 G או מחט gavage הפה עד שרפרף בתוך לומן של המעי הגס יוסר כליל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את המעי הגס עם מספריים longitudinally. שטפו את המעי הגס על ידי רועדת במרץ קר כקרח PBS בצלחת פטרי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את רקמת המעי הגס לחתיכות כ 1 ס&quot;מ באמצעות אזמל או מספריים סטריליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את המשקל של החלקים המעי הגס. הערה: כל השלבים המפורטים בסעיף 1 יכול להתבצע גם בתוך או מחוץ ארון בטיחות ביולוגית. לאחר נקודות מוכנות תרבות, כל הצעדים חייבים להתבצע בתוך ארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות. </li></ol> 2. קולון Orgתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת תא (100 מיקרומטר) על צלחת תרבית תאים 6 באר. להעביר את כל חלקי המעי הגסים שנאספו עכבר אחד לתוך מסננת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל DMEM / בינוני F12 המכיל 5% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (1x), ו gentamycin (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל). מכסות לחלוטין את חתיכות המעי הגס עם התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם 5% CO 2 ואוויר 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את מסננת התא לשאוב התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים מסננת התא בחזרה על היטב ומוסיפים 5 מ&quot;ל התקשורת טריים ללא אנטיביוטיקה. הרם את מסננת התא לשאוב התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה מעל (שלב 2.5) עוד פעמים (3x הכל) כדי להסיר את כל האנטיביוטיקה שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות המעי הגס מן מסננת תא בודד לתוך הבאר אחד של צלחת תרבית תאים סטריליים 12 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני DMEM / F12 המכיל FBS 5% (ללא אנטיביוטיקה). כוון את עוצמת הקול של המדיום עם weight של חתיכות המעי הגס, למשל, 1 בינוני מ&quot;ל עבור 100 מ&quot;ג של רקמת גוף. דגירה במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת אוויר 5% CO 2 ו -95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את supernatant תרבות צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 12,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. הפרד את supernatant לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל חדש לשימוש חיידקים הרג assay ו / או מבחני אחרים של מערכת החיסון. את supernatant ניתן לאחסן ב -80 ° C עד assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השברים המעי הגס בתוך שפופרת עבור בידוד RNA. </li></ol> 3. חיידק הריגת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן בחיידק הזה 5 מ&quot;ל לוריא- Bertani (LB) מרק בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד לילה. שמור את הכובע של צינור התרבות מעט רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור תרבות חיידקי 1,200 XG במשך 10 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ו resuspend גלולה חיידקים לתוך 5 מ&quot;ל קר כקרח PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של bactההשעיה erial לתוך OD קובט ולמדוד ב 600 ננומטר. השתמש PBS כמו ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחידת המושבה להרכיב (CFU) באמצעות עקומת סטנדרט קבוע מראש. הנה, להניח 1 OD = 2 x 10 9 CFU / ml (כ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את השעית החיידקים כדי להפוך את השעית מניית 1 x 10 5 CFU / mL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant תרבות איבר המעי הגס (500 μl / טוב) שנאסף בסעיף 2.10 לתוך בארות כפולות של צלחת תרבית תאי 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 תרבות coli μL E. (1000 CFU) לתוך supernatant תרבות איבר המעי הגס אחד היטב המכיל 500 μL. השאר הבאר השנייה ללא כל חיסון חיידק כדי לאשר את supernatant תרבות איבר המעי הגס אינו מכיל כל זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה אותו המספר של חיידקים (1,000 CFU) בתקשורת התרבות (FBS DMEM / F12 בתוספת 5%) ללא אנטיביוטיקה כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 μL של כל דגימה ירידה-wise על צלחות אגר MacConkey. דגירה צלחות אגר MacConkey ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות לחשב את CFU / ml. </li></ol> 4. השפעת חיצונית ו גורמים פנימיים על תגובות הגנה מארחות גס Antimicrobial הערה: assay הרג מיקרוביאלית כמתוארת כאן ניתן לאמץ כדי לבחון את השפעת דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs) וציטוקינים על פעילות bactericidal של supernatant תרבות איברים. דוגמא ניסוי כזה באמצעות IL-1β ו- IL-18 מתוארת להלן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף נקודתיים מעכברים כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המעי הגס על מגבת נייר סטרילי. חותכים את המעי הגס longitudinally לשלושה חלקים באמצעות מספריים (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף כל חלק של המעי הגס ב קר כקרח PBS כמתואר בסעיף 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים כל חלק של המעי הגס לחתיכות קטנות ולשקול בסביבה נקייה מחיידקים. מעביר את החתיכות של כל חלקשל המעי הגס לשלוש מסננות בתא נפרדות (100 מיקרומטר) הניחו על שלוש בארות צלחת תרבית תאי 6-היטב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל בינוני DMEM / F12 המכיל 5% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין (1x), ו gentamycin (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת אוויר 5% CO 2 ו -95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את חלקי נקודות כמתוארים 2.4-2.6. מעבירים את חתיכות המעי הגס של מסננת תא בודד לתוך הבאר אחד של צלחת תרבית תאים סטריליים 12 גם. השלוש הבארות המכילות שלושה חלקים של המעי הגס מתוך עכבר אחת צריכות להיות מיועדות מטופל, IL-1β, ו- IL-18 (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני DMEM / F12 המכיל FBS 5% (ללא אנטיביוטיקה). כוון את עוצמת הקול של המדיום עם משקל של חתיכות המעי הגס, למשל, 1 בינוני מ&quot;ל עבור 100 מ&quot;ג של רקמת גוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר את תרבות איבר המעי הגס עם IL-1β (20 ng / mL) או IL-18 (20 ng / mL) במשך 12 שעות. נקודות המטופל<html> תרבות איבר משמשת שליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 12 הדגירה שעות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור הזרקת 5% CO 2 ו -95 אוויר%, לאסוף את supernatant תרבות צינור 1.5 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 500 μL supernatant התרבות לתוך בארות כפולות של צלחת 24 גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן E. coli (1,000 CFU) ב supernatant תרבות איבר המעי הגס כמתואר בסעיף 3. עבור כל תנאי, לחסן בחיידק הזה באר יחיד. שני היטב המכיל אותו האיבר supernatant התרבות ללא אי-קולי ישמש כשלט עבור זיהום חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את אותה כמות של חיידקים בתקשורת תרבות ללא אנטיביוטיקה כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 50 μL של כל דגימה-חכם טיפה על צלחות אגר MacConkey. דגירה צלחות אגר MacConkey עבור לילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות לחשב את CFU / mL (איור 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. מדידה של הביטוי של גנים Antimicrobial <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה לילה (12 שעות) של התרבות איבר הגס כמתואר בסעיפים 2 ו -4, לשטוף את חתיכות המעי הגס עם 2 מ&quot;ל PBS קר כקרח (2x). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את השברים המעי הגס לתוך צינור בורג מכסה חינם 2 מ&quot;ל RNase / DNase. מניחים את הצינורות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מסחרי מגיב Trizol וחרוזים מטריקס lysing לתוך הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse הרקמה באמצעות homogenizer רקמות אוטומטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את lysate רקמה לתוך צינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד RNA באמצעות פרוטוקול סטנדרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ריכוז RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל RNA כראוי עם מים ללא יונים ולהשתמש 500 RNA ng לסנתז cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cDNA לניתוח בזמן אמת RT-PCR של גנים מיקרוביאלית ממוקד, ציטוקינים, כמוקינים, וגנים אחרים בעלי עניין. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

תאי אפיתל המעי רגישים מאוד מבחינת דרישות הצמיחה שלהם ולכן קשים תרבות. תאי אפיתל מבודדים על ידי טיפול EDTA אינם שורד תרבית תאי תקשורת קונבנציונלית כגון DMEM 8. לכן, מחקרי אינטראקציה לפתוגן מארח באמצעות הקריפטה מבודד או תאי אפיתל עיקריים הם מאוד מאתגרים. לאחרו?...

המעי מייצג מערכת דינאמית כי משמשת כמחסום עבור מיקרואורגניזמים commensal, נלחם נגד פתוגנים פולשים, ומסדיר את רכב חיידקי 1. תאי אפיתל במעי, מורכב enterocytes, תאי גביע, תאי פנט ותאי enteroendocrine, הוא אוכלוסיות התאים העיקריות המספקות תשובות הגנה מארחות נגד חיידקים במעיים. תאי הגביע לייצר מוקיוס יוצרים מפורזים על גבי שכבת אפיתל 2. התאים ו enterocytes פנט לייצר פפטידים מיקרוביאלית, ציטוקינים, ומיני חמצן וחנקן תגובתי המהווים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית לתרום לעיצוב בהרכב המיקרוביאלי במעיים 3, 4. בנוסף לתאי אפיתל, תאי מערכת החיסון כולל מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, תאי הרג טבעיים, לימפוציטים, ואינה<html> תאי הלימפה טה שכבת הרירית המיוחדת ואת submucosa לשחק תפקיד קריטי בתגובות ההגנה המארחת מיקרוביאלית מעיים על ידי ציטוקינים ייצור, כמוקינים, ומתווכים אחרים 5 - 7. כדי להבין איך המערכת החיסונית ברירית מסדיר חיידקים ומספקת הגנה מפני זיהום מיקרוביאלי, חשוב לשקול את יחסי הגומלין המורכבים של אוכלוסיות תאים הטרוגנית של המעי. עם זאת, מודל במבחנה שמקיף את כל התכונות של המעי אינו זמין. לכן, מחקרים מולקולריים על אינטראקצית מארח הפתוגן במעי הם מאוד מאתגרים. במהלך השנים האחרונות, מערכות מודל מספר המחקים ההיבטים של רירית המעי פותחו על חקירת תהליכים פתופיזיולוגיים המעורבים במחלות מעי דלקתיות (IBD) והפרעות במערכת העיכול אחרים 8 -= &quot;Xref&quot;&gt; 14. הונצחו שורות תאים אפיתל במעי משמשות לעתים קרובות כדי ללמוד מענה ספציפי תא אפיתל. עם זאת, בגלל ביטוי גנים ההפרש ותפקוד בתאים הנציח, את הנתונים המתקבלים באמצעות תאים אלה אינם לעיתים קרובות להתאים עם אלו שנצפו במחקרים in vivo. הקריפטה מעי organoid התרבות התפתח לאחרונה ככלי פוטנציאל להערכת התגובה של האפיתל במעי לגירויים שונים 13. במערכת זו, תאי גזע הקריפטה מותר לגדול ולהתפתח מבנה organoid 3D. בעוד מערכת התרבות organoid מאוד שימושי לחקר היבטים רבים של האפיתל במעי, זה לא לחקות את האינטראקציה המורכבת של תאי מערכת החיסון, תאי אפיתל ומוצרים מיקרוביאלי. תרבות vivo לשעבר של רקמת המעי מציעה ייצוג טוב יותר של תגובות הגנה מארחות in vivo. בשיטה זו, חלק של המעי הוא בתרבית שנינות צלחת תרבית תאיםתקשורת h המתאימה המאפשרת את הסוגים השונים של אוכלוסיות תאים במעי להיות פעילה מבחינה מטבולית עבור h 48 לפחות. לפיכך, תרבות vivo לשעבר של האיבר יכול לשמש כדי למדוד את הביטוי של גנים מיקרוביאלית והתגובות ההגנה המארחת של המעי לגירוי מסוים. חוקרים כבר משתמשים במערכת תרבות איבר vivo לשעבר ללמוד תגובות הגנה מארחות נגד זיהום מיקרוביאלי במעי 15 - 21. לאחרונה אמצו את מערכת התרבות האיבר כדי ללמוד את התפקיד של inflammasome בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית נקודות עכבר 22. Inflammasome היא פלטפורמה מולקולרית עבור הפעלת caspase-1, אשר נדרש לייצור התבגר IL-1β ו- IL-18. הראינו כי IL-1β ו- IL-18 להשרות פפטידים מיקרוביאלית אשר למעשה להרוג pathobionts commensal כגון E. coli </em&gt;. תצפית זו עולה בקנה אחד עם ניטל coli גדילת א ב 22 נקודות עכבר פגום-inflammasome. מערכת זו ולכן ניתן להשתמש כדי ללמוד את התפקיד של קולטנים זיהוי תבניות (PRRs) ומולקולות חיסון מולדות אחרות בתגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית מעיים וכן בפתוגנזה של הפרעות במערכת עיכול כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן מעי גס (CRC). ישנם יותר מ -200 גני רגישות IBD, ומוטציות רבות מאותם גנים המשויכים רכב חיידקים שינה במעיים. זה הוא בעל משמעות קלינית רבה לקבוע את המנגנון המדויק שדרכו גני IBD-הרגישות להסדיר חיידקים במעיים. המטרה הכללית של שיטה זו היא להציג את פרוטוקול בסיסי בתרבות איבר vivo לשעבר מעי גס להדגים כיצד שיטת התרבות זו יכולה לשמש כדי לחקור תגובות הגנה מארחת מיקרוביאלית של המעי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/ F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &#38; Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1b recombinan</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP10749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-18 recombinant</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP70380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria-Bertani Broth&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0075-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Uded to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>DU 530</td>
			<td>Used to determine E. coli count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix S (1/8&#34;), 2 mL Tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>5085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST40R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

המעי מציג ארכיטקטורה של מבנים הקריפטה חוזרים המורכבים מסוגים שונים של תאי אפיתל, שכבת רירית מיוחדת המכילה תאים חיסוניים, ו stroma. כל תאים הטרוגניים אלו תורמים הומאוסטזיס מעיים ולהשתתף הגנה מארחת מיקרוביאלית. לכן, זיהוי מודל פונדקאי ללימוד תגובה חיסונית ופעילות מיקרוביאלית של המעי בסביבה במבחנה הוא מאוד מאתגר. במחקרים במבחנה באמצעות שורות תאים אפיתל במעי הנציחו או אפילו הקריפטה עיקרי organoid תרבות אינו מייצגים את הפיסיולוגיה המדויקת של מעי נורמלי microenvironment שלה. כאן, אנו דנים בשיטה של רקמת מעי גסת עכבר culturing בצלחת התרבות וכיצד מערכת ההתרבות לשעבר vivo האיבר הזה יכול להיות מיושמת במחקרים הקשורים תגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית. בניסויי נציג, הראינו כי נקודות בתרבות איבר לבטא פפטידים מיקרוביאלית שו&quot;תonse IL-1β אקסוגניים ו- IL-18. יתר על כן, מולקולות מפעיל מיקרוביאלית המיוצר על ידי רקמות המעי הגס בתרבות איבר ביעילות להרוג coli Escherichia במבחנה. גישה זו, אם כן, יכולה להיות מנוצלת כדי לנתח את התפקיד של דפוסים מולקולריים pathogen- וסכנה הקשורים ואת הקולטנים הסלולרי שלהם בויסות תגובה חיסונית מולדת מעיים ותגובות הגנה מארחות מיקרוביאלית.

תמונה מייצגת של נקודות בתרבות איבר מוצגת באיור 1. חתיכות המעי הגס בתרבות להישאר מבחינה מטבולית ופעיל מבחינה פיזיולוגית. הם מגיבים ביעילות לגירויים חיצוניים מתווספים התקשורת והתרבות. זרם עבודה סכמטית של הכנת הרקמה המעי הגס לתרבות vivo לשעב...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; קולון איברי תרבות השימוש בו מארח אנטימיקרוביים ללימודי ביטחון

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

13.9K Views.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Video: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

בתחום ההדמיה vivo של טפילים טראנסגנטי שושנת יריחו שורה חיים

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ה<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גירוי קולטן הכרת תרבות תבנית של עכבר המעיים Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

שלית Decidual אדם תרבויות איברים ללמוד זיהומים בבית הממשק האם והעובר

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

לא פולשנית דגימה של נוזל שורות Mucosal עבור כימות של In Vivo דרכי הנשימה העליונות החיסון-מגשרת רמות

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

מודל תרבות Bursal-תא ראשי לשעבר Vivo עוף ללמוד פתוגנזה וירוס מחלה זיהומית Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to improve surgical efficiency. In our lab, we have optimized the cuff technique with two major steps. First, we used the inner tube technique to insert a temporary inner tube into the external jugular vein and carotid artery blood vessel to facilitate eversion of the vessel over the cuff. Second, we performed complete heterotopic cardiac transplantation through the collaboration of two experienced surgeons. These modifications effectively reduced the operation time to 25 minutes, with a success rate of 95%. In this report, we describe these procedures in detail and provide a supplemental video. We believe that this report on the improved cuff technique will offer practical guidance for murine heterotopic heart transplantation and will enhance the utility of this mouse model for basic research.

We introduce an inner tube approach to the cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation to help evert the vessel over the cuff. We found that cooperation between two experienced surgeons markedly shortens the operation time.

אופטימיזציה של טכניקת השרוול עבור השתלת לב מוריין

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

הקמת דגם חזיר אקס ויוו קרנית לחקר טיפולים תרופתיים נגד קרטיטיס בקטריאלי

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Ex vivo Assay לחקר קנדידה אלביקנים מקף מורפוגנזה במערכת העיכול

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

בדיקות יעילות אנטיביוטית במודל אקס ויוו של פסאודומונס aeruginosa ו Staphylococcus aureus Biofilms בריאה סיסטיק פיברוזיס

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...