Cancer Prevention Research Institute of Texas (CPRIT; RP160169) und UT Southwestern Medical Center zu MHZ gegeben; Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Morbus Crohn und Colitis Foundation of America (3711 CCFA) unterstützt

Verwendung von 6-8 Wochen alten männlichen Wildtyp (C57BL6 / J) Mäuse gehalten in einem spezifischen Pathogen (SPF) Anlage im Tier Resource Center (ARC), UT Southwestern Medical Center Alle hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt. Alle Untersuchungen wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC und die National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. 1. Sammlung und Vorbereitung des Colon <ol><li> Euthanize Mäuse mit CO 2 Erstickung durch zervikale Dislokation gefolgt. </li><li> Spray-Mäuse mit 70% Ethanol und Stift Gliedmaßen zu einem Pinning Bord der Maus Rückenseite nach unten auf dem Brett zu halten. </li><li> Mit vorsterilisiert Dissektionsscheren und Zange, machen einen Einschnitt Mittellinie in das Peritoneum des Bauches. Öffnen Sie den Bauch durch das Peritoneum mit einer Pinzette zu falten. </li><li> Entfernen Sie den Darm aus der Bauchhöhle with Pinzette und Schere. Trenne die Kolon vom Dünndarm durch am Boden des Blinddarms Schneiden und das andere Ende am Rektum. </li><li> Platzieren Sie den Darm in eine sterile Petrischale mit eiskaltem PBS. Spülen, den Inhalt des Lumens des Dickdarms mit eiskaltem PBS unter Verwendung einer 20 ml-Spritze mit einer 20 G Nadel oder eine Schlundsonde Nadel, bis der Stuhl in dem Lumen des Kolons Halte vollständig entfernt wird. </li><li> Schneiden Sie den Dickdarm mit einer Schere in Längsrichtung. Waschen Sie den Doppelpunkt durch kräftiges in eiskaltem PBS in einer sterilen Petrischale schütteln. </li><li> Schneiden Sie den Doppelpunkt Gewebe in Stücke von etwa 1 cm lange ein steriles Skalpell oder einer Schere. </li><li> Nehmen Sie das Gewicht der Kolon Stücke. HINWEIS: Alle Schritte in dem Abschnitt 1 kann entweder innerhalb oder außerhalb eines biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden. Sobald Doppelpunkte für Kultur bereit sind, alle Schritte müssen in einem biologischen Sicherheitsschrank durchgeführt werden, zur Aufrechterhaltung der Sterilität. </li></ol> 2. Colon Orgeine Kultur <ol><li> Legen Sie eine Zelle Sieb (100 um) auf einer 6-Well-Zellkulturplatte. Übertragen Sie alle von den Kolon Stücke von einer Maus in die Zelle Sieb gesammelt. </li><li> Werden 5 ml DMEM / F12 Medium mit 5% FBS, Penicillin-Streptomycin (1x) und Gentamycin (20 ug / ml). Decken Sie die Kolon Stücke mit den Medien. </li><li> In einem Inkubator mit 5% CO 2 und 95% Luft bei 37 ° C für 2 Stunden inkubieren. </li><li> Heben Sie die Zelle Sieb und absaugen Medien. </li><li> Legen Sie die Zelle Sieb wieder auf den Brunnen und 5 ml frisches Medium ohne Antibiotika. Heben Sie die Zelle Sieb und absaugen Medien. </li><li> Wiederholen der obigen Waschschritt (Schritt 2.5) zweimal (insgesamt 3x) alle restlichen Antibiotika zu entfernen. </li><li> Übertragen Sie die Kolon Stücke aus einer einzigen Zelle Sieb in eine einzige Vertiefung einer sterilen 12-Well-Zellkulturplatte. </li><li> Hinzufügen DMEM / F12 Medium mit 5% FBS (ohne Antibiotika). Stellen Sie die Lautstärke des Mediums mit dem weight der colon Stücken, beispielsweise 1 ml Medium pro 100 mg Gewebe. Inkubieren für 12 h bei 37 ° C in einem Inkubator Injizieren von 5% CO 2 und 95% Luft. </li><li> Sammeln Sie die Kulturüberstand in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 12.000 × g bei 4 ° C für 5 min. Trennen der Überstand in ein neues 1,5 ml-Röhrchen zur Verwendung in den Assays der Abtötung von Bakterien und / oder andere Immunassays. Der Überstand kann bis zum Test bei -80 ° C gelagert werden. </li><li> Sammeln Sie die Kolon Stücke in einem Rohr für die RNA-Isolierung. </li></ol> 3. E. coli Assay Töten <ol><li> Impfen E. coli in 5 ml Luria-Bertani (LB) Brühe in einem 15 - ml - Röhrchen und Inkubation über Nacht bei 37 ° C bei 200 Umdrehungen pro Minute unter Schütteln. Halten Sie die Kappe des Kulturröhrchen etwas locker. </li><li> Zentrifugieren der Bakterienkulturröhrchen bei 1.200 xg für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Bakterienpellet in 5 ml eiskaltem PBS. </li><li> 1 ml der bacterial Suspension in eine Küvette und messen der OD bei 600 nm. Verwenden Sie PBS als leer. </li><li> Berechnen der Kolonie bildenden Einheit (cfu) mit einer vorbestimmten Standardkurve verwendet wird. Hier wird angenommen , dass 1 OD = 2 x 10 9 cfu / ml (ungefähr). </li><li> Verdünnen Sie die Bakteriensuspension auf die Stoffsuspension 1 x 10 5 KBE / ml zu machen. </li><li> Übertragen Sie die Kolon-Organkulturüberstand (500 ul / Vertiefung) gesammelt in Abschnitt 2.10 in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte. </li><li> In 10 &amp; mgr; l E. coli - Kultur (1000 KBE) in eine Vertiefung mit 500 ul Kolon Organkulturüberstand. Lassen Sie die anderen auch ohne E. coli Impfung zu bestätigen , dass der Darm Organkulturüberstand keine Verunreinigung enthält. </li><li> Inkubiere die gleiche Anzahl von Bakterien (cfu 1000) in Kulturmedium (DMEM / F12 plus 5% FBS) ohne Antibiotika als Kontrolle. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Man gibt 50 &amp; mgr; l jeder Probe Drop-wise auf MacConkey-Agar-Platten. Inkubieren der MacConkey-Agarplatten bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Zähle die Anzahl der Kolonien und die Berechnung der cfu / ml. </li></ol> 4. Die Wirkung von extrinsischen und intrinsischen Faktoren auf Kolon Antimicrobial-Host Defense Antworten HINWEIS: Die antimikrobielle Tötung Test, wie hier beschrieben ist, kann die Wirkung von pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Zytokinen auf die bakterizide Aktivität der Organkulturüberstand zu prüfen, angenommen werden. Ein Beispiel eines solchen Experiments unter Verwendung von IL-1β und IL-18 wird nachfolgend beschrieben. <ol><li> Sammeln Sie Doppelpunkte von Mäusen, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Platzieren Sie den Doppelpunkt auf einer sterilen Papiertuch. Schneiden Sie den Doppelpunkt der Länge nach in drei Teile mit einer Schere (Abbildung 2). </li><li> Waschen Sie jeden Teil des Dickdarms in eiskaltem PBS, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Schneiden Sie jeden Teil des Dickdarms in kleine Stücke und aseptisch wiegen. Übertragen Sie die Stücke jedes Teilsdes Kolons in drei separate Zellsiebe (100 um) , die auf drei Wells einer 6-Well - Zellkulturplatte (Abbildung 2). </li><li> 2 ml DMEM / F12 Medium mit 5% FBS, Penicillin-Streptomycin (1x) und Gentamycin (20 ug / ml). </li><li> Bei 37 ° C für 2 h Inkubieren in einem Inkubator Injizieren 5% CO 2 und 95% Luft. </li><li> Waschen Sie die Kolon Stücke wie in 2,4-2,6 beschrieben. Übertragen Sie die Kolon Stücke aus einer einzigen Zelle Sieb in eine einzige Vertiefung einer sterilen 12-Well-Zellkulturplatte. Die drei Vertiefungen , die drei Teile des Dickdarms von einer einzelnen Maus sollte als unbehandelte, IL-1β bezeichnet werden, und IL-18 (Abbildung 2). </li><li> Hinzufügen DMEM / F12 Medium mit 5% FBS (ohne Antibiotika). Stellen Sie das Volumen des Mediums mit dem Gewicht der colon Stücke, beispielsweise 1 ml Medium pro 100 mg Gewebe. </li><li> Stimulieren des Dickdarms Organkultur mit IL-1β (20 ng / ml) oder IL-18 (20 ng / ml) für 12 h. Die unbehandelte Kolon<html> Organkultur dient als Kontrolle. </li><li> Nach 12 h Inkubation bei 37 ° C in einem Inkubator Injizieren von 5% CO 2 und 95% Luft, der Kulturüberstand in einem sterilen 1,5 ml - Röhrchen sammeln. </li><li> Übertragen Sie 500 ul Kulturüberstand in zwei Vertiefungen einer 24-Well-Platte. </li><li> Impfen E. coli (1000 KBE) in Überstand Kolon Organkultur als für jede Bedingung in Abschnitt 3 beschrieben impfen E. coli in einem einzigen gut. Die andere gut enthaltende Organkulturüberstand ohne E. coli wird als Kontrolle für bakterielle Kontamination dienen. </li><li> Inkubiere die gleiche Menge Bakterien in Kulturmedium ohne Antibiotika als Kontrolle. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C für 1 h. </li><li> Man gibt 50 &amp; mgr; l jeder Probe tropfenweise auf MacConkey-Agar-Platten. Inkubieren der MacConkey-Agar-Platten über Nacht bei 37 ° C. </li><li> Zähle die Anzahl der Kolonien und die Berechnung der cfu / ml (Abbildung 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. Die Messung der Expression von Genen Antimicrobial <ol><li> Nach Inkubation über Nacht (12 h) von Kolon Organkultur wie in den Abschnitten 2 und 4, waschen Sie die Kolon-Stücke mit 2 ml eiskaltem PBS (2x) beschrieben. </li><li> Sammeln Sie die Kolon Stücke in ein 2 ml RNase / DNase frei Schraubverschluss Rohr. Die Röhrchen auf Eis. </li><li> 1 mL kommerzielle Trizolreagenz und Lysismatrix Perlen in die Röhre. </li><li> Lyse das Gewebe eines automatisierten Gewebe-Homogenisator. </li><li> Sammeln Sie die Gewebelysat in ein neues Reaktionsgefäß. </li><li> Isolieren RNA-Standard-Protokoll. </li><li> Messen Sie RNA-Konzentration. </li><li> Verdünnte RNA in geeigneter Weise mit entsalztem Wasser und verwenden 500 ng RNA cDNA zu synthetisieren. </li><li> Verwenden Sie die cDNA für real-time RT-PCR-Analyse von gezielten antimikrobiellen Genen, Zytokine, Chemokine und andere Gene von Interesse. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Die intestinalen Epithelzellen sind sehr empfindlich in Bezug auf ihre Wachstumsanforderungen und daher schwierig zu kultivieren. Die Epithelzellen isoliert durch EDTA - Behandlung nicht überleben in konventionellen Zellkulturmedien , wie beispielsweise DMEM 8. Daher Wirt-Pathogen-Interaktion Studien isoliert Krypta oder primäre Epithelzellen sind sehr anspruchsvoll. Vor kurzem Sato et al. eine Krypta organoiden Kultursystem beschrieben , die für Studien im Zusammenhang mit Darm Pathophysiolog...

Der Darm stellt ein dynamisches System , das für commensal Mikroorganismen als Barriere wirkt, kämpft gegen eindringende Krankheitserreger, und reguliert die mikrobielle Zusammensetzung 1. Die intestinalen Epithelzellen, bestehend aus Enterozyten, Becherzellen, Panethzellen und enteroendokrinen Zellen sind die Hauptzellpopulationen, die Abwehrreaktionen gegen Darmmikrobiota liefern. Die Becherzellen produzieren Muzine , die eine entmilitarisierte Zone auf der Oberseite der Epithelschicht 2 erstellen. Die Panethzellen und Enterozyten produzieren antimikrobielle Peptide, Zytokine und reaktive Sauerstoff und Stickstoff - Spezies , die eine antimikrobielle Abwehrreaktionen darstellen und tragen 3, die Darmflora 4 zu formen. Zusätzlich zu Epithelzellen, die Immunzellen, einschließlich Makrophagen, dendritische Zellen, Neutrophile, natürliche Killerzellen, Lymphozyten und inna<html> te lymphatischen Zellen in der Lamina propria und Submukosa durch die Herstellung Zytokinen, Chemokinen eine entscheidende Rolle bei Darm-antimikrobielle Abwehrreaktionen spielen, und andere Vermittler fähig 5 - 7. Um zu verstehen, wie die Schleimhaut Immunsystem reguliert Mikrobiota und bietet Schutz gegen mikrobielle Infektionen, ist es wichtig, das komplexe Zusammenspiel der heterogenen Zellpopulationen des Darms zu berücksichtigen. Jedoch ist ein in vitro - Modell , das alle Merkmale des Darmes umfasst ist nicht verfügbar. Daher sind molekulare Untersuchungen auf Wirt-Pathogen-Interaktion im Darm sehr herausfordernd. In den letzten Jahren mehrere Modellsystemen , die Aspekte der Darmschleimhaut zu imitieren wurden zur Untersuchung der pathophysiologischen Prozesse bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und anderen gastrointestinalen Störungen 8 entwickelt -= &quot;xref&quot;&gt; 14. Immortalized Darmepithel-Zelllinien werden oft zu studieren epithelialen Zell-spezifische Antworten verwendet. Wegen der differentiellen Genexpression und Funktion in immortalisierten Zellen jedoch die erhaltenen Daten aus diesen Zellen unter Verwendung von nicht mit denen häufig in in vivo Studien beobachtet entsprechen. Intestinale Krypta organoiden Kultur wurde als mögliches Instrument zur Beurteilung der Reaktion des Darmepithels auf verschiedene Reize 13 kürzlich entstanden. In diesem System werden Krypta Stammzellen erlaubt eine 3D-organoiden Struktur zu wachsen und sich entwickeln. Während die organoiden Kultursystem für die Untersuchung vieler Aspekte des Darmepithels sehr nützlich ist, ist es nicht die komplexe Interaktion von Immunzellen, Epithelzellen und mikrobielle Produkte nachahmen. Die ex vivo Kultur des Darmgewebe bietet eine bessere Darstellung der in vivo - Wirtsabwehrreaktionen. In diesem Verfahren wird ein Teil des Darms kultiviert in einer Zellkulturplatte with geeigneten Medien, die verschiedenen Arten von Zellpopulationen im Darm ermöglichen, aktiv zu sein metabolisch für mindestens 48 h. Somit kann eine ex vivo - Kultur des Organs kann verwendet werden , um die Expression von antimikrobiellen Genen und die Abwehrreaktionen des Darmes auf einen bestimmten Reiz zu messen. Die Ermittler haben die Ex - vivo - Organkultursystem unter Verwendung von zu Abwehrreaktionen gegen mikrobielle Infektion im Darm 15 studieren - 21. Wir nahmen kürzlich die Organkultursystem die Rolle des Inflammasoms in antimikrobiellen Abwehrreaktionen in Maus Doppelpunkte 22 zu studieren. Die Inflammasoms ist eine molekulare Plattform für die Aktivierung von Caspase-1, die für die Produktion von IL-1β gereift und IL-18 benötigt wird. Wir haben gezeigt , dass IL-1β und IL-18 antimikrobielle Peptide induzieren , die effektiv commensal pathobionts wie E. coli töten </em&gt;. Diese Beobachtung wurde im Einklang mit einer erhöhten Belastung E. coli in Inflammasoms defekten Maus Doppelpunkte 22. Dieses System kann daher verwendet werden, um die Rolle der Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) und andere angeborene Immunmoleküle in intestinalen antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen zu untersuchen sowie Pathogenese von intestinalen Erkrankungen, wie entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) und Darmkrebs (CRC). Es gibt mehr als 200 IBD Suszeptibilitätsgene, und Mutationen in vielen dieser Gene mit veränderten mikrobiellen Zusammensetzung im Darm verbunden sind. Es ist von großer klinischer Bedeutung, die genaue Mechanismus, durch den die IBD-Anfälligkeit Gene regulieren Darmflora zu bestimmen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Basisprotokoll von Ex - vivo - Kolon Organkultur einzuführen und zu zeigen , wie diese Kulturverfahren verwendet werden können antimikrobielle Abwehrreaktionen des Darms zu studieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/ F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &#38; Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1b recombinan</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP10749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-18 recombinant</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP70380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria-Bertani Broth&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0075-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Uded to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>DU 530</td>
			<td>Used to determine E. coli count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix S (1/8&#34;), 2 mL Tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>5085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST40R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

Der Darm zeigt eine Architektur von repetitiven Krypta Strukturen, die aus verschiedenen Typen von Epithelzellen, Lamina Propria Immunzellen enthalten, und Stroma. Alle diese heterogenen Zellen tragen dazu bei, antimikrobielle Abwehrdarm Homöostase und daran teilzunehmen. Daher ist für das Studium Immunantwort und antimikrobielle Aktivität des Darmes in einem in vitro - Einstellung ein Ersatzmodell identifizieren , ist extrem schwierig. In - vitro - Studien mit verewigte Darmepithel - Zelllinien oder auch primäre Krypta organoiden Kultur nicht die genaue Physiologie der normalen Darm und seine Mikroumgebung darstellen. Hier haben wir ein Verfahren zum Kultivieren der Maus Kolongewebe in einer Kulturschale und darüber , wie diese ex vivo - Organkultursystem kann in Studien durchgeführt werden in Bezug auf antimikrobielle Wirtsabwehrreaktionen. In repräsentativen Experimenten haben wir gezeigt, dass Doppelpunkte in Organkultur exprimieren antimikrobiellen Peptiden in bzw.onse auf exogenes IL-1β und IL-18. Die antimikrobiellen Effektor - Molekülen durch den Dickdarm Gewebe in der Organkultur produziert effizient Escherichia coli in vitro Ferner töten. Dieser Ansatz kann daher genutzt werden, um die Rolle der pathogen und Gefahren associated molecular patterns und ihre zellulären Rezeptoren bei der Regulierung der Darm angeborenen Immunantwort und antimikrobielle Abwehrreaktionen zu sezieren.

Ein repräsentatives Bild von Doppelpunkte in Organkultur ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Doppelpunkt Stücke in der Kultur bleiben metabolisch und physiologisch aktiv. Sie reagieren effizient auf exogene Stimuli zu den Kulturmedien hinzugefügt. Eine schematische Arbeitsablauf der Herstellung des Kolongewebe für ex vivo - Kultur und Stimulation mit exogenen Stimuli, wie zB IL-1β und IL-18, ist in Abbildung 2 dargestellt. Die repr...

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The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Colon Organ Culture und seine Verwendung in Antimicrobial-Host Defense Studies

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

13.9K Aufrufe.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Serie: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

In-vivo-Imaging von transgenen Leishmania Parasiten in einer Live-Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Die Nutzung der EpiAirway Modell zur Charakterisierung Langfristige Host-Pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to improve surgical efficiency. In our lab, we have optimized the cuff technique with two major steps. First, we used the inner tube technique to insert a temporary inner tube into the external jugular vein and carotid artery blood vessel to facilitate eversion of the vessel over the cuff. Second, we performed complete heterotopic cardiac transplantation through the collaboration of two experienced surgeons. These modifications effectively reduced the operation time to 25 minutes, with a success rate of 95%. In this report, we describe these procedures in detail and provide a supplemental video. We believe that this report on the improved cuff technique will offer practical guidance for murine heterotopic heart transplantation and will enhance the utility of this mouse model for basic research.

We introduce an inner tube approach to the cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation to help evert the vessel over the cuff. We found that cooperation between two experienced surgeons markedly shortens the operation time.

Optimierung der Manschettentechnik für DieMurine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

Antibiotika-Wirksamkeitstests in einem Ex-vivo-Modell von Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus aureus Biofilmen in der Mukoviszidose-Lunge

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Das

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