PAnap fue un regalo amable del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigaciones en Salud Subvenciones MOP-102689 y MOP-136894 (a RB) y la Fundación Canadiense para la Innovación Subvención 950-225005.

Las manipulaciones de las ranas se realizaron de acuerdo con las directrices canadienses y han sido aprobadas por el comité de ética (CDEA, protocolo # 15-042) de la Universidad de Montreal. 1. Preparación de mRNA para la incorporación de fUAA <ol><li> Elija un sitio de interés en la proteína donde se esperan cambios conformacionales. Seleccione un aminoácido en esta región para sustituir a la fUAA. NOTA: La elección de la posición se basa en los reordenamientos estructurales que se esperan. Si existe una estructura de alta resolución y una hipótesis de los movimientos esperados, el anap debe colocarse de tal manera que el ambiente químico se altere; Esto podría ser un cambio en la constante dieléctrica (ambiente hidrófobo frente a medio hidrófilo) o, más probablemente, extinción por otro aminoácido. Los mejores extinguidores son los triptófanos. Anap debe estar en contacto con el extintor en un estado (superposición de los radios van-der-Waals) y libre de él enel otro. Si no existen estructuras o modelos de alta resolución, habría que escanear la región de interés. En cualquier caso, es aconsejable seleccionar varias localizaciones cercanas para aumentar la probabilidad de obtener expresión y señal de fluorescencia. Con el fin de minimizar los efectos estéricos durante la maduración y / o función de la proteína, se puede optar por reemplazar los aminoácidos grandes y aromáticos (Phe, Trp, Tyr). Los autores, sin embargo, han experimentado que escanear una región de interés para la inserción de fUAA independientemente del aminoácido sustituido, es más productivo. </li><li> Insertar un codón de parada ámbar (TAG) en el sitio seleccionado utilizando mutagénesis dirigida al sitio 15 . Asegúrese de que la proteína de interés no termina en un codón de parada ámbar (TAG). Si es así, mutar a otro (codón de parada ocre o ópalo). Amplificar, aislar y secuenciar el ADN. Obtener ARNm de proteína con transcripción in vitro 16 y almacenar el mRNA a 20 ° C o 80 ° C. </li> &lt;Ol 2. Preparación y inyección de ovocitos <ol><li> Obtención quirúrgica de ovocitos en estadio V o VI de ranas Xenopus laevis y defolliculate con colagenasa como se describió previamente 17 . <ol><li> Anestesiar las ranas con un anestésico apropiado según el protocolo animal aprobado (aquí: éster etílico del ácido 3-aminobenzoico). Cuando no responden a un pellizco suave a una punta del pie (pérdida del reflejo de la retirada), entonces se anestesian adecuadamente para la cirugía. </li><li> Retire inmediatamente las ranas de la solución anestésica y enjuague bien su piel con agua fresca. Este enjuague impedirá que el animal caiga en niveles más profundos de anestesia al eliminar el producto químico no absorbido de la superficie de la piel. </li><li> Quitar los ganglios ováricos de un lado quirúrgicamente y cuidadosamente abrir los nodos con dos pinzas. Incubar y agitar los ovocitos en &quot;solución estándar de oocitos&quot; (SOS) que contiene 1% (p / v) de colagenasa durante 20-30 minPara defolliculate. Lavar tres veces con solución SOS. </li><li> Seleccionar ovocitos grandes y sanos individualmente e incubarlos en una solución de Barth suplementada con antibióticos (100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 10 mg / 100 mL de kanamicina) y 5% de suero de caballo a 18 ºC durante al menos 4 horas antes de la inyección . NOTA: Después de 2 a 4 cirugías con un retraso de 4 meses, Xenopus laevis se eutanasia por incubación prolongada (&gt; 1 h) con éster etílico del ácido 3-aminobenzoico. </li></ol></li><li> Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para poder alcanzar el núcleo y evitar dañar el ovocito. Llene la punta de la inyección con aceite y monte en el dispositivo nanoinjetor. <ol><li> Instale el nano-inyector bajo un microscopio estéreo y utilice una pinza para romper el extremo de la punta. Expulse el aceite hasta que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del extremo de la punta. </li></ol></li><li> Coloque 1 μl de 0,1 μg /# 181; L pAnap en agua libre de nucleasa que contenga NaOH (1% de NaOH 1 N) sobre un trozo de parafilm bajo un estereoscopio y llene la punta de inyección con el ADN. </li><li> Transferir 40 oocitos a un plato de inyección revestido con malla que contenga solución de Barth suplementada con antibióticos. NOTA: Para hacer el plato de inyección revestido con malla, corte una pieza de tamaño adecuado de malla de nylon de 800 μm para llenar una placa de Petri de poliestireno. Añadir cloroformo al centro y luego colocar la malla en la parte superior. Mantenga la malla plana hasta que el plástico se pone. </li><li> A medida que el núcleo del oocito se encuentra en el polo animal (oscuro), apunte la punta de la inyección en el centro del polo animal y empale de modo que la punta llegue cerca del centro del hemisferio animal (o 2-3x la profundidad comparada con la inyección de ARN ). Inyectar 9,2 nL de pAnap en el núcleo de cada ovocito. La punta fina y el volumen pequeño de inyección pueden resultar en una inyección irregular o una punta bloqueada. De vez en cuando, compruebe si la inyección funciona inyectándose en el aire. NOTA: Si el ADN se inyecta correctamente en el núcleo es incierto. Espere por lo tanto 10 - 40% de los ovocitos a no expresar el par tRNA / sintetasa. Véase Discusión para mayor elaboración. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustración de la inyección de ADN y ARN en los ovocitos de Xenopus para la incorporación de Anap. En primer lugar, pAnap se inyecta en el núcleo del ovocito de Xenopus ( 1 ). Después de 6-24 h, Anap y el canal ARN se coinjected en el polo vegetal ( 2 ). Anap será ortogonalmente aminoacilado con el tRNA que lleva un anti-codón de bloqueo ámbar, por la aminoacil-ARNt sintetasa que está codificada por pAnap. De esta manera, los Anap-tRNAs aminoacilados son reconocidos por el ribosoma en el codón de parada ámbar insertado en el canalL de ARN, dando como resultado la supresión del codón de parada y la inserción de Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="6"><li> Incubar los ovocitos en 2 ml de solución de Barth suplementada con antibióticos y 5% de suero de caballo (HS) a 18 ° C durante 6-24 h para permitir la expresión robusta de Anap tRNAs específicos y tRNA-sintetasas. NOTA: El tiempo de incubación del ADN puede durar varios días antes de la inyección de ARN, pero no aumenta la expresión. </li><li> Preparar el nano-inyector para la inyección de ARN (igual que el paso 2.2, pero la punta de inyección no necesita ser tan delgada como para la inyección de ADN). Trabajar sólo bajo luz roja desde este punto para evitar el fotoblanqueo del Anap. </li><li> Mezclar 1 μl de Anap 1 mM con 1 μl de mRNA de 1-2 μg / μL directamente sobre un trozo de parafilm y llenar la punta de inyección con la solución mezclada. Impala justo debajo de la membrana en el(Brillante) e inyectar 46 nL en cada ovocito inyectado con pAnap. NOTA: La concentración de mRNA requerida depende de la proteína de interés. </li><li> Incubar los ovocitos protegidos de la luz en una caja o envueltos en papel de aluminio, en antibióticos suplementados con solución de Barth y suero de caballo al 5% a 18 ° C durante 2-3 días. Intercambiar con la solución fresca de Barth todos los días y eliminar los ovocitos muertos para evitar la contaminación. </li></ol> 3. Configuración VCF <ol><li> Instale el equipo de sujeción de voltaje de oocitos abierto como se describe anteriormente 18 . </li><li> Montar el sistema de registro electrofisiológico en un microscopio de fluorescencia vertical mediante la instalación de la cámara de grabación en un deslizador que permite moverlo entre el estereoscopio estándar para colocar el ovocito y el microscopio para realizar las mediciones de fluorescencia ( Figura 2c ). NOTA: La geometría de la cámara para los ovocitos cortados no es adecuada para usar la tra normalNsmitted la luz para la iluminación durante la manipulación. Por lo tanto, una lámpara halógena &quot;cuello de cisne&quot; con filtro rojo se utiliza para iluminar lateralmente desde la parte superior. El condensador del microscopio puede ser removido hacer espacio para bajar la etapa de la cámara de electrofisiología. </li><li> Conecte un sistema de detección de fotodiodos al puerto de salida de montaje en C del microscopio de fluorescencia ( Figura 2a ). Conecte la lectura de la fotocorriente a un segundo canal de entrada en el procesador digital de señales (DSP, analógico / digital - digital / analógico). </li><li> Utilice una lámpara halógena de 100 W, 12 V como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. NOTA: Alternativamente, pueden utilizarse quemadores de Hg, pero deben reducirse en intensidad para evitar un fotoblanqueo demasiado rápido durante las grabaciones. La iluminación LED sólo se recomienda si los respectivos LEDs muestran una intensidad significativa en el rango de excitación ( por ejemplo, ~ 350 nm para Anap). La mayoría de los LEDs blancos no llegan lejos en el espectro UV. </li><li> InsErt un obturador controlado eléctricamente entre la fuente de luz de excitación y el microscopio y conectar su control (típicamente TTL-pulso) a una salida digital del DSP. Tiempo de TTL-pulso en el software de grabación (véase la documentación del fabricante), de tal manera que el obturador se abre ~ 100 ms antes del comienzo de la grabación. De esta manera, cualquier vibración durante el proceso de apertura no interfiere con la grabación. El tiempo depende de la velocidad y vibración del obturador. Termine el pulso 5ms antes del final de la grabación como se muestra en la Figura 4 . De esta manera, también se registra el valor para la fluorescencia total. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Para Anap, utilice el paso de banda Ex: 377/50 nm, el paso largo dicroico 409 nm y el paso banda Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : Configuración de VCF. ( A ) Vista lateral de la configuración VCF que muestra el trayecto de la luz dentro del microscopio. El cubo del filtro contiene un filtro de excitación, un espejo dicroico y un filtro de emisión. ( B ) Las dimensiones seleccionadas de la cámara de ovocitos son de 3,4 cm para el radio de la cámara superior (1), 5,5 cm para la cámara inferior (2), 1,4 cm para la anchura de la cámara inferior (3) y 1,7 cm para la anchura de la cámara intermedia (4). ( C ) Vista frontal de la configuración VCF. El primer ocular de la izquierda es para montar el ovocito en la cámara de abrazadera de tensión cortada y para la permeabilización. Entonces, la cámara se desliza bajo el microscopio en el segundo ocular a la derecha. Aquí, el electrodo V1 se inserta en el ovocito usando el objetivo 4X, y la fluorescencia se registra usando el objetivo 40X de inmersión en agua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Grabación VCF <ol><li> Seguir los pasos de preparación para la abrazadera de voltaje de ovocitos abierta como se describió anteriormente y visualizar 18 (preparación del puente de agar, montaje del ovocito, permeabilización de la saponina). Sin embargo, trabaje bajo luz roja en todo momento para evitar blanquear el fluoróforo antes de las grabaciones. Al colocar el ovocito, asegúrese de que el polo animal esté orientado hacia arriba. La pigmentación bajo la membrana del polo animal protege contra la autofluorescencia procedente del citosol y por lo tanto reduce la fluorescencia de fondo. </li><li> Deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque con un objetivo de 4X. </li><li> Empalar el ovocito con el electrodo V1 de detección de voltaje (3 M KCl), cambiar al objetivo 40X de inmersión en agua (NA 0.8 - 0.9). Concéntrese en el polo animal que está mirando hacia arriba. </li><li> Apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro correcto girando la torreta de cubo de filtro y el puerto de salida óptica conectado al fotodiodo. Encienda el halEn la lámpara en la intensidad más alta y en breve cambiar el obturador abierto durante 2-5 s para leer la intensidad de fluorescencia de fondo procedente del ovocito. Con la configuración descrita el valor debe ser alrededor de 50-200 pA para Anap. </li><li> Encienda la abrazadera, vuelva a activar el interruptor de baño / protector y ajuste el potencial de membrana (V1 - V2) al potencial de mando girando el mando en la posición I. </li><li> Seleccione el potencial de retención, el protocolo de paso, el número y la longitud de los impulsos, etc. en el software de grabación. Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia Anap. </li></ol> 5. VCF bicolor <ol><li> Para monitorizar simultáneamente dos localizaciones en la misma proteína, mute un aminoácido extracelular y accesible en cisteína, y elimine otras cisteínas para asegurar un etiquetado específico con química tiol. </li><li> Realice el paso 2.1-2.5. </li><li> Antes de las grabaciones de VCF, incube los oocitos en TMR-maleimida 5 μM en solución de marcado durante 15 min (u otro coloranteCon un espectro no superpuesto comparado con Anap). </li><li> Lave los ovocitos con solución de etiquetado tres veces para eliminar el exceso de colorante. </li><li> Realice el paso 4.1-4.6. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado para TMR (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Cambie al cubo del filtro TMR girando la torreta del filtro. </li><li> Lea la fluorescencia de fondo para TMR como se describe para Anap en el paso 4.4. NOTA: El etiquetado con la química tiol produce una alta fluorescencia de fondo debido al etiquetado inespecífico en la membrana. Por lo tanto, la fluorescencia de fondo TMR puede saturar el amplificador (&gt; 2000 pA). En ese caso, no disminuya la intensidad de la luz, sino que simplemente resta la fluorescencia de fondo añadiendo una corriente de desplazamiento al fotodiodo. En sistemas comercialmente disponibles, utilice la función de &quot;muestreo y retención&quot; en el sistema detector. Observe el valor de fluorescencia de fondo (utilizando un filtro de densidad neutra 10X) en un laboratorio jYa que este valor no será registrado (saturación). </li><li> Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia TMR simultáneamente como en el paso 4.6. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La aminoacilación in vivo de tRNAs que se transcriben continuamente junto con la tRNA-sintetasa, hace posible obtener altos niveles de expresión para mediciones de fluorescencia. Para una eficaz incorporación de fUAA, es fundamental que pAnap se inyecte correctamente en el núcleo. Debido a la incertidumbre de la ubicación exacta del núcleo, 10-40% de las inyecciones de ADN se espera que fallen, dando lugar a no expresar (o expresar fugas) ovocitos. Por lo tanto, es importante verificar la expresión en au...

Más de 200 aminoácidos naturales de diversas propiedades químicas y físicas han sido incorporados genéticamente en proteínas en células de E. coli , levaduras y mamíferos [ 3] . El aminoácido no natural se incorpora en respuesta a un codón de parada específico a través de un par ortogonal de tRNA / sintetasa. El enfoque genético para modificar las proteínas ha proporcionado información valiosa sobre la estructura y función de la proteína. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de Voltaje-Clamp Fluorometría (VCF) en combinación con un fluorescente SAU. En VCF, la observación simultánea de datos funcionales y reordenamientos estructurales localizados alrededor de la sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obtener información dinámica con una resolución de milisegundos 1 . Las sondas fluorescentes alteran su estado de extinción tras el movimiento localizado de la proteína. Un movimiento de sólo 1-2 Å es suficiente para conducir a cambios significativos en la fluorescenciaIntensidad 4 . Después de la identificación del sitio de interés en la proteína diana, el sitio es mutado por mutación puntual. Clásicamente, el residuo se había mutado a una cisteína, mientras que ahora, se introduce un codón de detención ámbar (TAG) para la incorporación genética de fUAA. La proteína se transcribe entonces in vitro . Mientras que otros sistemas de expresión ( p. Ej., Células de mamíferos) pueden usarse 5 , 6 , 7 , los oocitos de Xenopus son preferibles para estudios de estructura-función debido a su mayor tamaño, lo que conduce a una manipulación más fácil ya una mayor intensidad de fluorescencia (más fluoróforos) Ruido. Además, los ovocitos de Xenopus tienen un bajo trasfondo de las proteínas endógenas 2 , 8 , y la pigmentación oscura en el polo animal se escuda contra la fluorescencia de fondo de tEl citosol. Los ovocitos de Xenopus se eliminan quirúrgicamente y el ADN que codifica el par ortogonal tRNA / tRNA-sintetasa específico para la fUAA se inyecta en el núcleo de los oocitos. Después de un tiempo de incubación de 6-24 h, la proteína ARN se co-inyecta con la fUAA en el citosol de los ovocitos, seguido por un período de incubación de 2-3 días. Con el fin de evitar cualquier daño a la fUAA (fotoblanqueo), los procedimientos que incluyen Anap tienen que llevarse a cabo bajo luz roja para evitar la excitación del fluoróforo. Se estudian los ovocitos en una configuración de tensión-abrazadera de ovocitos abierta, que se monta en un microscopio de fluorescencia vertical, y se registran simultáneamente cambios de corriente eléctrica y fluorescencia 9 , 10 . Alternativamente, pueden usarse una abrazadera de tensión de dos electrodos 1 o configuraciones de abrazadera de parche 11 . La fluorescencia se excita mediante longitudes de onda apropiadas con bajo ruido RMS y<html> Emisión registrada usando un fotodiodo ligado a un amplificador con alta amplificación. Hay varias ventajas del uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAAs) en fluorometría de tensión-abrazadera. Una es el acceso al lado citosólico de las proteínas de la membrana; Aquí se encuentran muchos procesos reguladores ( por ejemplo, sitios de unión a Ca2 + o nucleótidos, inactivación rápida y cerrada de canales iónicos con voltaje, apertura de poros, acoplamiento de módulos). Todos estos procesos ahora son accesibles para el etiquetado fluorescente. Otra ventaja es el tamaño pequeño de la sonda que conduce a menos alteración de la proteína. Hasta ahora, se han diseñado dos pares ortogonales tRNA / ARNt sintetasa para fUAA 12 , 13 , donde el ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) es el único fUAA que se ha utilizado en ovocitos de Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap es un fluoróforo ambientalmente sensible con un peso molecular de 272,3 g / mol y es sólo ligeramente mayor que el triptófano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Debido a su pequeño tamaño, es probable que se introduzcan menos efectos estéricos por el fluoróforo en comparación con los fluoróforos convencionales unidos a través de un engarce (típicamente más de 500 g / mol). Por otra parte, en el caso de Anap, el fluoróforo se encuentra más cerca de la cadena principal de proteínas que los vinculados a las cisteínas, y, en consecuencia, Anap está probando más localizados reordenamientos. Por último, la eliminación de las cisteínas endógenas en el VCF convencional con el fin de asegurar el etiquetado específico del sitio ya no es un requisito en el UAA-VCF y por lo tanto (i) deja las proteínas en (casi) su estado nativo y (ii) permite aplicar VCF Para estudiar una gama más amplia de proteínas en las que la función puede ser alterada por la sustitución de cisteína. <img alt="Figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Anap y espectros de fluorescencia. ( A ) Estructura química de Anap. ( B ) Espectro de absorción normalizado y espectros de emisión para Anap 1 nM, demostrando la sensibilidad de la fluorescencia de Anap a la hidrofobicidad del disolvente. Los espectros de emisión se obtuvieron por excitación a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Una desventaja del uso de UAA fluorescentes es que una población heterogénea de proteínas puede resultar de la lectura de codón de terminación, reiniciación traslacional, proteínas C-terminales truncadas o diafonía con aminoacilación endógena si la cantidad de ARNt aminoacilados es escasa. Tal expresión de fugas siempre debe comprobarse en ausencia de la fUAA y el tRNA / tRNA synthetase par. Abordamos la cuestión de la transReinicialización lacional y cómo evitarlo para los sitios de inserción N-terminal anteriormente 14 . Sin embargo, cuando la fUAA, tRNA y tRNA sintetasa están presentes en cantidades saturadas, sólo queda una baja probabilidad de expresión de fugas. La principal diferencia de procedimiento entre fUAA-VCF y VCF convencional es la inyección y manipulación de los ovocitos; La inyección de ADN que codifica el tRNA y la ARNt sintetasa (pAnap) es seguida por la introducción de Anap, que se co-inyecta con el ARNm de la proteína o se añade alternativamente a la solución de incubación como un éster de acetoximetilo (AM).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Fluorometría de tensión-abrazadera (VCF) ha sido la técnica de elección para investigar la estructura y función de las proteínas de membrana electrogenic donde las mediciones en tiempo real de la fluorescencia y las corrientes informan simultáneamente sobre los reordenamientos locales y la función global, respectivamente 1 . Mientras que las técnicas estructurales de alta resolución como la microscopía cryoelectrónica o la cristalografía de rayos X proporcionan imágenes estáticas de las proteínas de interés, el VCF proporciona datos estructurales dinámicos que nos permiten vincular los reordenamientos estructurales (fluorescencia) a datos funcionales dinámicos (electrofisiología). Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido a las plantas de las proteínas restringía el alcance del enfoque porque todas las cisteínas accesibles, incluidas las endógenas, estarían etiquetadas. De este modo se requirió la construcción de proteínas libres de cisteínas endógenas. El etiquetado también se restringió a los sitios accesibles desde el extracelularlado. Esto cambió con el uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAA) para incorporar específicamente una pequeña sonda fluorescente en respuesta a la supresión del codón de parada utilizando un par ortogonal tRNA y tRNA sintetasa par 2 . La mejora de VCF sólo requiere un procedimiento de inyección de dos etapas de inyección de ADN (par tRNA / sintetasa) seguido de co-inyección de ARN / fUAA. Ahora, el etiquetado tanto intracelular y sitios enterrados es posible, y el uso de VCF se ha expandido significativamente. La técnica VCF se convierte así en atractiva para estudiar una amplia gama de proteínas y, lo que es más importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

La Figura 4 muestra un ejemplo de grabaciones de VCF obtenidas a partir de un ovocito que expresa canales de Shaker con inactivación rápida eliminada (IR), L382stop-W434F en presencia de pAnap y Anap. La mutación W434F bloquea las corrientes de potasio iónico, lo que permite medir los desplazamientos transitorios de la carga de giro (corrientes de gating). Las grabaciones simultáneas de las corrientes de gating (traza superior) y Anap cambios de intensidad de fluore...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K vistas.  University of Montréal.  Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas. 

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A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Un sensor basado en polianilina de ácidos nucleicos

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Investigación

Bioquímica

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Un protocolo optimizado para el ensayo de cambio de movilidad electroforética utilizando oligonucleótidos marcados con colorante fluorescente infrarrojo

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the double bond. Changes in FA composition play a crucial role in the adaptation of bacteria to their environment. These modifications entail a change in the ratio of iso versus anteiso branched FAs, and in the proportion of unsaturated FAs relative to saturated FAs, with double bonds created at specific positions. Precise identification of the FA profile is necessary to understand the adaptation mechanisms of Bacillus species.
Many of the FAs from Bacillus are not commercially available. The strategy proposed herein identifies FAs by combining information on the retention time (by calculation of the equivalent chain length (ECL)) with the mass spectra of three types of FA derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). This method can identify the FAs without the need to purify the unknown FAs.
Comparing chromatographic profiles of FAME prepared from Bacillus cereus with a commercial mixture of standards allows for the identification of straight-chain saturated FAs, the calculation of the ECL, and hypotheses on the identity of the other FAs. FAMEs of branched saturated FAs, iso or anteiso, display a constant negative shift in the ECL, compared to linear saturated FAs with the same number of carbons. FAMEs of unsaturated FAs can be detected by the mass of their molecular ions, and result in a positive shift in the ECL compared to the corresponding saturated FAs.
The branching position of FAs and the double bond position of unsaturated FAs can be identified by the electron ionization mass spectra of picolinyl and DMOX derivatives, respectively. This approach identifies all the unknown saturated branched FAs, unsaturated straight-chain FAs and unsaturated branched FAs from the B. cereus extract.

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

Identificación de los ácidos grasos en la<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological macromolecules. Until recently, a major requirement has been the availability of relatively large, well diffracting crystals, which are often challenging to obtain. However, the advent of serial crystallography and a renaissance in multi-crystal data collection methods has meant that the availability of large crystals need no longer be a limiting factor. Here, we illustrate the use of the automated MeshAndCollect protocol, which first identifies the positions of many small crystals mounted on the same sample holder and then directs the collection from the crystals of a series of partial diffraction data sets for subsequent merging and use in structure determination. MeshAndCollect can be applied to any type of micro-crystals, even if weakly diffracting. As an example, we present here the use of the technique to solve the crystal structure of the Cyan Fluorescent Protein (CFP) Cerulean.

We present the use of the MeshAndCollect protocol to obtain a complete diffraction data set, for use in subsequent structure determination, composed of partial diffraction data sets collected from many small crystals of the fluorescent protein Cerulean.

Solución de la estructura de la proteína fluorescente Cerulean con MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally identified by harnessing the competitions between amino acids and their analogs. However, this analog-based method is of low accuracy, and proper analogs for specific amino acids are limited. Here, we present an alternative strategy that enables an accurate, sensitive, and high-throughput screening of amino acid overproducers using rare-codon-rich markers. This strategy is inspired by the phenomenon of codon usage bias in protein translation, for which codons are categorized into common or rare ones based on their frequencies of occurrence in the coding DNA. The translation of rare codons depends on their corresponding rare transfer RNAs (tRNAs), which cannot be fully charged by the cognate amino acids under starvation. Theoretically, the rare tRNAs can be charged if there is a surplus of the amino acids after charging the synonymous common isoacceptors. Therefore, retarded translations caused by rare codons could be restored by feeding or intracellular overproductions of the corresponding amino acids. Under this assumption, a selection or screening system for identifying amino acid overproducers is established by replacing the common codons of the targeted amino acids with their synonymous rare alternatives in the antibiotic resistance genes or the genes encoding fluorescent or chromogenic proteins. We show that the protein expressions can be greatly hindered by the incorporation of rare codons and that the levels of proteins correlate positively with the amino acid concentrations. Using this system, overproducers of multiple amino acids can be readily screened out from mutation libraries. This rare-codon-based strategy only requires a single modified gene, and the host is less likely to escape the selection than in other methods. It offers an alternative approach for obtaining amino acid overproducers.

This study presents an alternative strategy to the conventional toxic analog-based method in identifying amino acid overproducers by using rare-codon-rich markers to achieve accuracy, sensitivity, and high-throughput simultaneously.

Identificación de los sobreproductores de aminoácidos utilizando marcadores ricos en codón raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Examen cinético de la actividad de nucleasa utilizando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...