Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
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PAnap fue un regalo amable del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigaciones en Salud Subvenciones MOP-102689 y MOP-136894 (a RB) y la Fundación Canadiense para la Innovación Subvención 950-225005.

Las manipulaciones de las ranas se realizaron de acuerdo con las directrices canadienses y han sido aprobadas por el comité de ética (CDEA, protocolo # 15-042) de la Universidad de Montreal. 1. Preparación de mRNA para la incorporación de fUAA <ol><li> Elija un sitio de interés en la proteína donde se esperan cambios conformacionales. Seleccione un aminoácido en esta región para sustituir a la fUAA. NOTA: La elección de la posición se basa en los reordenamientos estructurales que se esperan. Si existe una estructura de alta resolución y una hipótesis de los movimientos esperados, el anap debe colocarse de tal manera que el ambiente químico se altere; Esto podría ser un cambio en la constante dieléctrica (ambiente hidrófobo frente a medio hidrófilo) o, más probablemente, extinción por otro aminoácido. Los mejores extinguidores son los triptófanos. Anap debe estar en contacto con el extintor en un estado (superposición de los radios van-der-Waals) y libre de él enel otro. Si no existen estructuras o modelos de alta resolución, habría que escanear la región de interés. En cualquier caso, es aconsejable seleccionar varias localizaciones cercanas para aumentar la probabilidad de obtener expresión y señal de fluorescencia. Con el fin de minimizar los efectos estéricos durante la maduración y / o función de la proteína, se puede optar por reemplazar los aminoácidos grandes y aromáticos (Phe, Trp, Tyr). Los autores, sin embargo, han experimentado que escanear una región de interés para la inserción de fUAA independientemente del aminoácido sustituido, es más productivo. </li><li> Insertar un codón de parada ámbar (TAG) en el sitio seleccionado utilizando mutagénesis dirigida al sitio 15 . Asegúrese de que la proteína de interés no termina en un codón de parada ámbar (TAG). Si es así, mutar a otro (codón de parada ocre o ópalo). Amplificar, aislar y secuenciar el ADN. Obtener ARNm de proteína con transcripción in vitro 16 y almacenar el mRNA a 20 ° C o 80 ° C. </li> &lt;Ol 2. Preparación y inyección de ovocitos <ol><li> Obtención quirúrgica de ovocitos en estadio V o VI de ranas Xenopus laevis y defolliculate con colagenasa como se describió previamente 17 . <ol><li> Anestesiar las ranas con un anestésico apropiado según el protocolo animal aprobado (aquí: éster etílico del ácido 3-aminobenzoico). Cuando no responden a un pellizco suave a una punta del pie (pérdida del reflejo de la retirada), entonces se anestesian adecuadamente para la cirugía. </li><li> Retire inmediatamente las ranas de la solución anestésica y enjuague bien su piel con agua fresca. Este enjuague impedirá que el animal caiga en niveles más profundos de anestesia al eliminar el producto químico no absorbido de la superficie de la piel. </li><li> Quitar los ganglios ováricos de un lado quirúrgicamente y cuidadosamente abrir los nodos con dos pinzas. Incubar y agitar los ovocitos en &quot;solución estándar de oocitos&quot; (SOS) que contiene 1% (p / v) de colagenasa durante 20-30 minPara defolliculate. Lavar tres veces con solución SOS. </li><li> Seleccionar ovocitos grandes y sanos individualmente e incubarlos en una solución de Barth suplementada con antibióticos (100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 10 mg / 100 mL de kanamicina) y 5% de suero de caballo a 18 ºC durante al menos 4 horas antes de la inyección . NOTA: Después de 2 a 4 cirugías con un retraso de 4 meses, Xenopus laevis se eutanasia por incubación prolongada (&gt; 1 h) con éster etílico del ácido 3-aminobenzoico. </li></ol></li><li> Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para poder alcanzar el núcleo y evitar dañar el ovocito. Llene la punta de la inyección con aceite y monte en el dispositivo nanoinjetor. <ol><li> Instale el nano-inyector bajo un microscopio estéreo y utilice una pinza para romper el extremo de la punta. Expulse el aceite hasta que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del extremo de la punta. </li></ol></li><li> Coloque 1 μl de 0,1 μg /# 181; L pAnap en agua libre de nucleasa que contenga NaOH (1% de NaOH 1 N) sobre un trozo de parafilm bajo un estereoscopio y llene la punta de inyección con el ADN. </li><li> Transferir 40 oocitos a un plato de inyección revestido con malla que contenga solución de Barth suplementada con antibióticos. NOTA: Para hacer el plato de inyección revestido con malla, corte una pieza de tamaño adecuado de malla de nylon de 800 μm para llenar una placa de Petri de poliestireno. Añadir cloroformo al centro y luego colocar la malla en la parte superior. Mantenga la malla plana hasta que el plástico se pone. </li><li> A medida que el núcleo del oocito se encuentra en el polo animal (oscuro), apunte la punta de la inyección en el centro del polo animal y empale de modo que la punta llegue cerca del centro del hemisferio animal (o 2-3x la profundidad comparada con la inyección de ARN ). Inyectar 9,2 nL de pAnap en el núcleo de cada ovocito. La punta fina y el volumen pequeño de inyección pueden resultar en una inyección irregular o una punta bloqueada. De vez en cuando, compruebe si la inyección funciona inyectándose en el aire. NOTA: Si el ADN se inyecta correctamente en el núcleo es incierto. Espere por lo tanto 10 - 40% de los ovocitos a no expresar el par tRNA / sintetasa. Véase Discusión para mayor elaboración. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustración de la inyección de ADN y ARN en los ovocitos de Xenopus para la incorporación de Anap. En primer lugar, pAnap se inyecta en el núcleo del ovocito de Xenopus ( 1 ). Después de 6-24 h, Anap y el canal ARN se coinjected en el polo vegetal ( 2 ). Anap será ortogonalmente aminoacilado con el tRNA que lleva un anti-codón de bloqueo ámbar, por la aminoacil-ARNt sintetasa que está codificada por pAnap. De esta manera, los Anap-tRNAs aminoacilados son reconocidos por el ribosoma en el codón de parada ámbar insertado en el canalL de ARN, dando como resultado la supresión del codón de parada y la inserción de Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="6"><li> Incubar los ovocitos en 2 ml de solución de Barth suplementada con antibióticos y 5% de suero de caballo (HS) a 18 ° C durante 6-24 h para permitir la expresión robusta de Anap tRNAs específicos y tRNA-sintetasas. NOTA: El tiempo de incubación del ADN puede durar varios días antes de la inyección de ARN, pero no aumenta la expresión. </li><li> Preparar el nano-inyector para la inyección de ARN (igual que el paso 2.2, pero la punta de inyección no necesita ser tan delgada como para la inyección de ADN). Trabajar sólo bajo luz roja desde este punto para evitar el fotoblanqueo del Anap. </li><li> Mezclar 1 μl de Anap 1 mM con 1 μl de mRNA de 1-2 μg / μL directamente sobre un trozo de parafilm y llenar la punta de inyección con la solución mezclada. Impala justo debajo de la membrana en el(Brillante) e inyectar 46 nL en cada ovocito inyectado con pAnap. NOTA: La concentración de mRNA requerida depende de la proteína de interés. </li><li> Incubar los ovocitos protegidos de la luz en una caja o envueltos en papel de aluminio, en antibióticos suplementados con solución de Barth y suero de caballo al 5% a 18 ° C durante 2-3 días. Intercambiar con la solución fresca de Barth todos los días y eliminar los ovocitos muertos para evitar la contaminación. </li></ol> 3. Configuración VCF <ol><li> Instale el equipo de sujeción de voltaje de oocitos abierto como se describe anteriormente 18 . </li><li> Montar el sistema de registro electrofisiológico en un microscopio de fluorescencia vertical mediante la instalación de la cámara de grabación en un deslizador que permite moverlo entre el estereoscopio estándar para colocar el ovocito y el microscopio para realizar las mediciones de fluorescencia ( Figura 2c ). NOTA: La geometría de la cámara para los ovocitos cortados no es adecuada para usar la tra normalNsmitted la luz para la iluminación durante la manipulación. Por lo tanto, una lámpara halógena &quot;cuello de cisne&quot; con filtro rojo se utiliza para iluminar lateralmente desde la parte superior. El condensador del microscopio puede ser removido hacer espacio para bajar la etapa de la cámara de electrofisiología. </li><li> Conecte un sistema de detección de fotodiodos al puerto de salida de montaje en C del microscopio de fluorescencia ( Figura 2a ). Conecte la lectura de la fotocorriente a un segundo canal de entrada en el procesador digital de señales (DSP, analógico / digital - digital / analógico). </li><li> Utilice una lámpara halógena de 100 W, 12 V como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. NOTA: Alternativamente, pueden utilizarse quemadores de Hg, pero deben reducirse en intensidad para evitar un fotoblanqueo demasiado rápido durante las grabaciones. La iluminación LED sólo se recomienda si los respectivos LEDs muestran una intensidad significativa en el rango de excitación ( por ejemplo, ~ 350 nm para Anap). La mayoría de los LEDs blancos no llegan lejos en el espectro UV. </li><li> InsErt un obturador controlado eléctricamente entre la fuente de luz de excitación y el microscopio y conectar su control (típicamente TTL-pulso) a una salida digital del DSP. Tiempo de TTL-pulso en el software de grabación (véase la documentación del fabricante), de tal manera que el obturador se abre ~ 100 ms antes del comienzo de la grabación. De esta manera, cualquier vibración durante el proceso de apertura no interfiere con la grabación. El tiempo depende de la velocidad y vibración del obturador. Termine el pulso 5ms antes del final de la grabación como se muestra en la Figura 4 . De esta manera, también se registra el valor para la fluorescencia total. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Para Anap, utilice el paso de banda Ex: 377/50 nm, el paso largo dicroico 409 nm y el paso banda Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : Configuración de VCF. ( A ) Vista lateral de la configuración VCF que muestra el trayecto de la luz dentro del microscopio. El cubo del filtro contiene un filtro de excitación, un espejo dicroico y un filtro de emisión. ( B ) Las dimensiones seleccionadas de la cámara de ovocitos son de 3,4 cm para el radio de la cámara superior (1), 5,5 cm para la cámara inferior (2), 1,4 cm para la anchura de la cámara inferior (3) y 1,7 cm para la anchura de la cámara intermedia (4). ( C ) Vista frontal de la configuración VCF. El primer ocular de la izquierda es para montar el ovocito en la cámara de abrazadera de tensión cortada y para la permeabilización. Entonces, la cámara se desliza bajo el microscopio en el segundo ocular a la derecha. Aquí, el electrodo V1 se inserta en el ovocito usando el objetivo 4X, y la fluorescencia se registra usando el objetivo 40X de inmersión en agua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Grabación VCF <ol><li> Seguir los pasos de preparación para la abrazadera de voltaje de ovocitos abierta como se describió anteriormente y visualizar 18 (preparación del puente de agar, montaje del ovocito, permeabilización de la saponina). Sin embargo, trabaje bajo luz roja en todo momento para evitar blanquear el fluoróforo antes de las grabaciones. Al colocar el ovocito, asegúrese de que el polo animal esté orientado hacia arriba. La pigmentación bajo la membrana del polo animal protege contra la autofluorescencia procedente del citosol y por lo tanto reduce la fluorescencia de fondo. </li><li> Deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque con un objetivo de 4X. </li><li> Empalar el ovocito con el electrodo V1 de detección de voltaje (3 M KCl), cambiar al objetivo 40X de inmersión en agua (NA 0.8 - 0.9). Concéntrese en el polo animal que está mirando hacia arriba. </li><li> Apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro correcto girando la torreta de cubo de filtro y el puerto de salida óptica conectado al fotodiodo. Encienda el halEn la lámpara en la intensidad más alta y en breve cambiar el obturador abierto durante 2-5 s para leer la intensidad de fluorescencia de fondo procedente del ovocito. Con la configuración descrita el valor debe ser alrededor de 50-200 pA para Anap. </li><li> Encienda la abrazadera, vuelva a activar el interruptor de baño / protector y ajuste el potencial de membrana (V1 - V2) al potencial de mando girando el mando en la posición I. </li><li> Seleccione el potencial de retención, el protocolo de paso, el número y la longitud de los impulsos, etc. en el software de grabación. Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia Anap. </li></ol> 5. VCF bicolor <ol><li> Para monitorizar simultáneamente dos localizaciones en la misma proteína, mute un aminoácido extracelular y accesible en cisteína, y elimine otras cisteínas para asegurar un etiquetado específico con química tiol. </li><li> Realice el paso 2.1-2.5. </li><li> Antes de las grabaciones de VCF, incube los oocitos en TMR-maleimida 5 μM en solución de marcado durante 15 min (u otro coloranteCon un espectro no superpuesto comparado con Anap). </li><li> Lave los ovocitos con solución de etiquetado tres veces para eliminar el exceso de colorante. </li><li> Realice el paso 4.1-4.6. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado para TMR (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Cambie al cubo del filtro TMR girando la torreta del filtro. </li><li> Lea la fluorescencia de fondo para TMR como se describe para Anap en el paso 4.4. NOTA: El etiquetado con la química tiol produce una alta fluorescencia de fondo debido al etiquetado inespecífico en la membrana. Por lo tanto, la fluorescencia de fondo TMR puede saturar el amplificador (&gt; 2000 pA). En ese caso, no disminuya la intensidad de la luz, sino que simplemente resta la fluorescencia de fondo añadiendo una corriente de desplazamiento al fotodiodo. En sistemas comercialmente disponibles, utilice la función de &quot;muestreo y retención&quot; en el sistema detector. Observe el valor de fluorescencia de fondo (utilizando un filtro de densidad neutra 10X) en un laboratorio jYa que este valor no será registrado (saturación). </li><li> Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia TMR simultáneamente como en el paso 4.6. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La aminoacilación in vivo de tRNAs que se transcriben continuamente junto con la tRNA-sintetasa, hace posible obtener altos niveles de expresión para mediciones de fluorescencia. Para una eficaz incorporación de fUAA, es fundamental que pAnap se inyecte correctamente en el núcleo. Debido a la incertidumbre de la ubicación exacta del núcleo, 10-40% de las inyecciones de ADN se espera que fallen, dando lugar a no expresar (o expresar fugas) ovocitos. Por lo tanto, es importante verificar la expresión en au...

Más de 200 aminoácidos naturales de diversas propiedades químicas y físicas han sido incorporados genéticamente en proteínas en células de E. coli , levaduras y mamíferos [ 3] . El aminoácido no natural se incorpora en respuesta a un codón de parada específico a través de un par ortogonal de tRNA / sintetasa. El enfoque genético para modificar las proteínas ha proporcionado información valiosa sobre la estructura y función de la proteína. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de Voltaje-Clamp Fluorometría (VCF) en combinación con un fluorescente SAU. En VCF, la observación simultánea de datos funcionales y reordenamientos estructurales localizados alrededor de la sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obtener información dinámica con una resolución de milisegundos 1 . Las sondas fluorescentes alteran su estado de extinción tras el movimiento localizado de la proteína. Un movimiento de sólo 1-2 Å es suficiente para conducir a cambios significativos en la fluorescenciaIntensidad 4 . Después de la identificación del sitio de interés en la proteína diana, el sitio es mutado por mutación puntual. Clásicamente, el residuo se había mutado a una cisteína, mientras que ahora, se introduce un codón de detención ámbar (TAG) para la incorporación genética de fUAA. La proteína se transcribe entonces in vitro . Mientras que otros sistemas de expresión ( p. Ej., Células de mamíferos) pueden usarse 5 , 6 , 7 , los oocitos de Xenopus son preferibles para estudios de estructura-función debido a su mayor tamaño, lo que conduce a una manipulación más fácil ya una mayor intensidad de fluorescencia (más fluoróforos) Ruido. Además, los ovocitos de Xenopus tienen un bajo trasfondo de las proteínas endógenas 2 , 8 , y la pigmentación oscura en el polo animal se escuda contra la fluorescencia de fondo de tEl citosol. Los ovocitos de Xenopus se eliminan quirúrgicamente y el ADN que codifica el par ortogonal tRNA / tRNA-sintetasa específico para la fUAA se inyecta en el núcleo de los oocitos. Después de un tiempo de incubación de 6-24 h, la proteína ARN se co-inyecta con la fUAA en el citosol de los ovocitos, seguido por un período de incubación de 2-3 días. Con el fin de evitar cualquier daño a la fUAA (fotoblanqueo), los procedimientos que incluyen Anap tienen que llevarse a cabo bajo luz roja para evitar la excitación del fluoróforo. Se estudian los ovocitos en una configuración de tensión-abrazadera de ovocitos abierta, que se monta en un microscopio de fluorescencia vertical, y se registran simultáneamente cambios de corriente eléctrica y fluorescencia 9 , 10 . Alternativamente, pueden usarse una abrazadera de tensión de dos electrodos 1 o configuraciones de abrazadera de parche 11 . La fluorescencia se excita mediante longitudes de onda apropiadas con bajo ruido RMS y<html> Emisión registrada usando un fotodiodo ligado a un amplificador con alta amplificación. Hay varias ventajas del uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAAs) en fluorometría de tensión-abrazadera. Una es el acceso al lado citosólico de las proteínas de la membrana; Aquí se encuentran muchos procesos reguladores ( por ejemplo, sitios de unión a Ca2 + o nucleótidos, inactivación rápida y cerrada de canales iónicos con voltaje, apertura de poros, acoplamiento de módulos). Todos estos procesos ahora son accesibles para el etiquetado fluorescente. Otra ventaja es el tamaño pequeño de la sonda que conduce a menos alteración de la proteína. Hasta ahora, se han diseñado dos pares ortogonales tRNA / ARNt sintetasa para fUAA 12 , 13 , donde el ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) es el único fUAA que se ha utilizado en ovocitos de Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap es un fluoróforo ambientalmente sensible con un peso molecular de 272,3 g / mol y es sólo ligeramente mayor que el triptófano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Debido a su pequeño tamaño, es probable que se introduzcan menos efectos estéricos por el fluoróforo en comparación con los fluoróforos convencionales unidos a través de un engarce (típicamente más de 500 g / mol). Por otra parte, en el caso de Anap, el fluoróforo se encuentra más cerca de la cadena principal de proteínas que los vinculados a las cisteínas, y, en consecuencia, Anap está probando más localizados reordenamientos. Por último, la eliminación de las cisteínas endógenas en el VCF convencional con el fin de asegurar el etiquetado específico del sitio ya no es un requisito en el UAA-VCF y por lo tanto (i) deja las proteínas en (casi) su estado nativo y (ii) permite aplicar VCF Para estudiar una gama más amplia de proteínas en las que la función puede ser alterada por la sustitución de cisteína. <img alt="Figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Anap y espectros de fluorescencia. ( A ) Estructura química de Anap. ( B ) Espectro de absorción normalizado y espectros de emisión para Anap 1 nM, demostrando la sensibilidad de la fluorescencia de Anap a la hidrofobicidad del disolvente. Los espectros de emisión se obtuvieron por excitación a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Una desventaja del uso de UAA fluorescentes es que una población heterogénea de proteínas puede resultar de la lectura de codón de terminación, reiniciación traslacional, proteínas C-terminales truncadas o diafonía con aminoacilación endógena si la cantidad de ARNt aminoacilados es escasa. Tal expresión de fugas siempre debe comprobarse en ausencia de la fUAA y el tRNA / tRNA synthetase par. Abordamos la cuestión de la transReinicialización lacional y cómo evitarlo para los sitios de inserción N-terminal anteriormente 14 . Sin embargo, cuando la fUAA, tRNA y tRNA sintetasa están presentes en cantidades saturadas, sólo queda una baja probabilidad de expresión de fugas. La principal diferencia de procedimiento entre fUAA-VCF y VCF convencional es la inyección y manipulación de los ovocitos; La inyección de ADN que codifica el tRNA y la ARNt sintetasa (pAnap) es seguida por la introducción de Anap, que se co-inyecta con el ARNm de la proteína o se añade alternativamente a la solución de incubación como un éster de acetoximetilo (AM).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Fluorometría de tensión-abrazadera (VCF) ha sido la técnica de elección para investigar la estructura y función de las proteínas de membrana electrogenic donde las mediciones en tiempo real de la fluorescencia y las corrientes informan simultáneamente sobre los reordenamientos locales y la función global, respectivamente 1 . Mientras que las técnicas estructurales de alta resolución como la microscopía cryoelectrónica o la cristalografía de rayos X proporcionan imágenes estáticas de las proteínas de interés, el VCF proporciona datos estructurales dinámicos que nos permiten vincular los reordenamientos estructurales (fluorescencia) a datos funcionales dinámicos (electrofisiología). Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido a las plantas de las proteínas restringía el alcance del enfoque porque todas las cisteínas accesibles, incluidas las endógenas, estarían etiquetadas. De este modo se requirió la construcción de proteínas libres de cisteínas endógenas. El etiquetado también se restringió a los sitios accesibles desde el extracelularlado. Esto cambió con el uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAA) para incorporar específicamente una pequeña sonda fluorescente en respuesta a la supresión del codón de parada utilizando un par ortogonal tRNA y tRNA sintetasa par 2 . La mejora de VCF sólo requiere un procedimiento de inyección de dos etapas de inyección de ADN (par tRNA / sintetasa) seguido de co-inyección de ARN / fUAA. Ahora, el etiquetado tanto intracelular y sitios enterrados es posible, y el uso de VCF se ha expandido significativamente. La técnica VCF se convierte así en atractiva para estudiar una amplia gama de proteínas y, lo que es más importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

La Figura 4 muestra un ejemplo de grabaciones de VCF obtenidas a partir de un ovocito que expresa canales de Shaker con inactivación rápida eliminada (IR), L382stop-W434F en presencia de pAnap y Anap. La mutación W434F bloquea las corrientes de potasio iónico, lo que permite medir los desplazamientos transitorios de la carga de giro (corrientes de gating). Las grabaciones simultáneas de las corrientes de gating (traza superior) y Anap cambios de intensidad de fluore...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K vistas.  University of Montréal.  Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas. 

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Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Investigación

Biología

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Neurociencias

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Biología del Desarrollo

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Bioingeniería

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

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