Name: voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

PAnap, Dr. Peter Schultz (Scripps Araştırma Enstitüsü) &#39;nin kibar bir hediyesiydi. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırma Grants Enstitüleri MOP-102689 ve MOP-136894 (RB&#39;ye) ve Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005 tarafından finanse edildi.

Kurbağa manipülasyonları Kanadalı yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Montréal Üniversitesi etik komitesince (CDEA, protokol # 15-042) onaylandı. 1. fAAA Kuruluşu için mRNA Hazırlığı <ol><li> Konformasyonel değişikliklerin meydana gelmesi beklenen proteinde ilgi alanı seçin. Bu bölgede fUAA&#39;nın yerini alacak bir amino asit seçin. NOT: Konum seçimi, beklenen yapısal yeniden düzenlenmelere dayanmaktadır. Yüksek çözünürlüklü bir yapı ve beklenen hareketlerin bir hipotezi varsa, anap, kimyasal ortamın değişeceği şekilde yerleştirilmelidir; Bu dielektrik sabitindeki (hidrofobik veya hidrofilik ortamda) bir değişiklik olabilir veya muhtemelen başka bir amino asitle söndürülebilir. En iyi söndürücüler triptofanlardır. Anap bir devlette söndürücü ile temas halinde olmalıdır (van-der Waals yarıçapının örtüşmesi) ve bunun dışında serbest bırakılmalıdır.Diğeri. Yüksek çözünürlüklü yapılar veya modeller mevcut değilse, ilgilenilen bölgeyi taramak zorunda kalacaklar. Her iki durumda da, ekspresyon ve floresan sinyali alma ihtimalini artırmak için yakınlardaki birkaç yeri seçmeniz önerilir. Protein olgunlaşması ve / veya fonksiyonu sırasında sterik etkileri en aza indirgemek için büyük ve aromatik amino asitlerin (Phe, Trp, Tyr) yerini alabilir. Bununla birlikte, yazarlar, yer değiştirmiş amino asitten bağımsız olarak fUAA yerleştirilmesi için bir ilgi alanının taranmasının daha verimli olduğunu deneyimlediler. </li><li> Seçilen siteye, bölgeye yönlendirilmiş mutagenez 15&#39;i kullanarak sarı bir stop kodonu (TAG) yerleştirin. İlgili proteinin kehribar stop kodonunda (TAG) bitmediğinden emin olun. Eğer öyleyse, farklı bir mutasyona (ohcher veya opal stop kodonu) mutasyon yapın. DNA&#39;yı çoğaltın, izole edin ve dizileyin. Protein mRNA&#39;sını in vitro transkripsiyon 16 ile elde edin ve mRNA&#39;yı 20 ° C veya 80 ° C&#39;de saklayın. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Oosit Hazırlama ve Enjeksiyon <ol><li> Xenopus laevis kurbağalarından Cerrahi olarak Evre V veya VI oositleri elde edin ve daha önce tarif edildiği gibi 17 kolajenaz ile defolipüler hale getirin. <ol><li> Kurbağaları onaylanmış hayvan protokolüne (burada: 3-aminobenzoik asit etil ester) göre uygun bir anestezi ile anestezi uygulayın. Parmak uçlarına nazik bir çimdiklik yapmadığında (geri çekilme refleksi kaybı) ameliyat için uygun şekilde anestezi altındadırlar. </li><li> Kurbağaları anestetik çözeltiden derhal çıkarın ve cildini temiz su ile iyice yıkayın. Bu durulama, hayvanın deri yüzeyinden emilmemiş kimyasalları çıkararak anestezinin daha derin seviyelerine düşmesini önleyecektir. </li><li> Bir taraftan yumurtalık düğümlerini ameliyatla çıkarın ve iki forseps kullanarak düğümleri dikkatle açın. 20-30 dakika boyunca% 1 (w / v) kollajenaz içeren &quot;standart oosit çözeltisi&quot; (SOS) içinde oositleri inkübe edin ve çırpınKusmak için SOS çözeltisiyle üç kez yıkayın. </li><li> Büyük ve sağlıklı oositleri ayrı ayrı seçin ve enjeksiyondan en az 4 saat önce 18 ° C&#39;de, antibiyotikler (100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 10 mg / 100 mL kanamisin) ve% 5 at serumu takviyeli Barth solüsyonunda inkübe edin . NOT: Aralarında 4 ay gecikmeli olarak 2-4 ameliyattan sonra, Xenopus laevis , 3-aminobenzoik asit etil ester ile uzun süre (&gt; 1 saat) kuluçka yapılarak ötenazi yapılır. </li></ol></li><li> DNA&#39;nın nükleer enjeksiyonu için, çekirdeğe erişebilmek ve oositin zarar görmesini önlemek için uzun ve ince bir enjeksiyon ucu hazırlayın. Enjeksiyon ucu yağla doldurun ve nano-enjektör cihazına monte edin. <ol><li> Nano enjektörü bir stereo mikroskop altında kurun ve ucun ucunu kırmak için forseps kullanın. Ucun ucunda hava kabarcığı kalmayana kadar yağı çıkarın. </li></ol></li><li> 1 μL, 0.1 μg /# 181; L Parafilmin bir stereoskop altında NaOH (% 1 N NaOH) ihtiva eden nükleaz içermeyen suyun içine yerleştirin ve enjeksiyon ucunu DNA ile doldurun. </li><li> 40 oosit Barth&#39;s solüsyonu antibiyotikler takviyeli mesh kaplı bir enjeksiyon kabına aktarılır. NOT: Örgü kaplı enjeksiyon tabağını yapmak için, bir polistren Petri kabını doldurmak için uygun boyutta bir 800 μm naylon örgü parçasını kesin. Merkeze kloroform ekleyin ve daha sonra kafesin üzerine yerleştirin. Örgüyü plastik ayarlanıncaya kadar düz tutun. </li><li> Oosit çekirdeği hayvanda (karanlık) kutuda bulunduğundan, hayvan kutupunun ortasındaki enjeksiyon ucunu hedefleyin ve ucun hayvan yarı küresinin merkezine (veya RNA enjeksiyonuna kıyasla 2-3x derinliğe) ulaşacağı şekilde takozlayın. ). Her bir oositin çekirdeğine 9.2 nL pAnap enjekte edin. İnce uç ve küçük enjeksiyon hacmi, düzensiz enjeksiyon veya tıkanık uçla sonuçlanabilir. Enjeksiyonun havaya enjekte edip etmediğini zaman zaman kontrol edin. NOT: DNA&#39;nın çekirdeğe düzgün şekilde enjekte edilip edilmediği belirsizdir. Bu nedenle, oositlerin% 10-40&#39;ının tRNA / sentetaz çiftini ekspres etmemesini bekleyin. Ayrıntılı bilgi için Tartışma&#39;ya bakınız. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Şekil 2 : Anap Kuruluşu için Xenopus Oositlerine DNA ve RNA Enjeksiyonunun İllüstrasyonu. Önce, pAnap Xenopus oositinin çekirdeğine enjekte edilir ( 1 ). 6-24 saat sonra, Anap ve kanal RNA, bitki sütununa ( 2 ) birlikte dökülür. Anap, pAnap tarafından kodlanan aminoasil-tRNA sentetazı tarafından bir amber stop anti-kodonu taşıyan tRNA ile ortogonal olarak aminoasillenmiş olacaktır. Bu şekilde, aminoasillenmiş Anap-tRNA&#39;lar, şanlın içerisine yerleştirilen amber stop kodonundaki ribozom tarafından tanınırlarL RNA, durdurma kodonunun bastırılması ve Anap sokulması ile sonuçlanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <ol start="6"><li> Anap spesifik tRNA&#39;lar ve tRNA sentetazlarının sağlam ekspresyonunu sağlamak için, oositleri antibiyotikler ve% 5 At serumu (HS) ile desteklenmiş 2 mL Barth solüsyonunda 6-24 saat boyunca 18 ° C&#39;de inkübe edin. NOT: DNA inkübasyon süresi RNA enjeksiyonundan birkaç gün sürebilir, ancak ekspresyonu arttırmaz. </li><li> Nano enjektörü RNA enjeksiyonu için hazırlayın (adım 2.2 ile aynıdır, ancak enjeksiyon ucunun DNA enjeksiyonu kadar ince olması gerekmez). Anap&#39;taki fotoğrafların ağartılmasını önlemek için bu noktadan itibaren yalnızca kırmızı ışık altında çalışın. </li><li> Doğrudan bir parafilm parçası üzerinde 1-2 μg / μL mRNA&#39;nın 1 μL&#39;si ile 1 μL&#39;lik 1 mM Anap&#39;ı karıştırın ve enjeksiyon ucunu karışık solüsyon ile doldurun. Vejetalin hemen altında membran(Parlak) kutba yerleştirin ve pAnap enjekte edilen her oositte 46 nL enjeksiyon yapın. NOT: Gerekli mRNA konsantrasyonu, ilgili proteine ​​bağlıdır. </li><li> Işıktan korunan oositleri bir kutuya koyun veya Barth&#39;s solüsyonu ile desteklenmiş antibiyotikler ve% 5 at serumu içinde 18 ° C&#39;de 2-3 gün alüminyum folyo ile sarın. Her gün yeni Barth&#39;ın çözeltisiyle değiştirin ve kontaminasyonu önlemek için ölü oositleri çıkarın. </li></ol> 3. VCF Kurulumu <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi kesik açık oosit voltaj sıkıştırma aletini takın 18 . </li><li> Floresan ölçümlerini ( Şekil 2c ) gerçekleştirmek için oosit ve mikroskop yerleştirmek için standart stereoskop arasında hareket etmesini sağlayan bir kaydırıcı üzerine kayıt odasını yerleştirerek elektrofizyoloji kayıt sistemini dik bir floresans mikroskopu üzerine monte edin. NOT: Kesit açık oositlerin odacığının geometrisi, normal traManipülasyon esnasında aydınlatma lambası. Bu nedenle, kırmızı filtreli bir &quot;gooseneck&quot; halojen lamba, yanlamasına üstten aydınlatmak için kullanılır. Mikroskopun kondansatörü, elektrofizyoloji odası için aşamayı düşürmek için boşluk bırakılabilir. </li><li> Floresan mikroskobun C-mount çıkış portuna bir fotodiyot tespit sistemi bağlayın ( Şekil 2a ). Fotokupl okumasını dijital sinyal işlemcisinde (DSP, analog / dijital - dijital / analog dönüştürücü) ikinci bir giriş kanalına bağlayın. </li><li> Floresan uyarma için ışık kaynağı olarak 100 W, 12 V halojen lamba kullanın. NOT: Alternatif olarak, Hg-brülörleri kullanılabilir, ancak kayıtlar sırasında çok hızlı foto-ağartmayı önlemek için yoğunluk azaltılmalıdır. LED aydınlatması, ilgili LED&#39;ler uyarı aralığında önemli bir yoğunluk gösteriyorsa önerilir ( örn., Anap için ~ 350 nm). Çoğu beyaz LED, UV spektrumuna kadar uzanmaz. </li><li> insUyarım ışık kaynağı ile mikroskop arasında elektrikle kontrol edilen bir perde ve kontrolünü (tipik olarak TTL palsı) DSP&#39;nin bir dijital çıkışına bağlayın. Kayıt yazılımında (üretici belgelerine bakın) TTL darbesini bekleyin, böylece deklanşör kayıt başlamadan ~ 100 ms önce açılır. Bu şekilde, açma işlemi sırasında herhangi bir titreşim kayıtta engel oluşturmaz. Zaman, deklanşörün hızına ve titreşimine bağlıdır. Şekil 4&#39;te gösterildiği gibi, kayıt bitmeden önce darbeyi 5 ms sonlandırın. Bu şekilde toplam flüoresan için de değer kaydedilir. </li><li> Filtre küpü taretine uygun bir filtre küpü (uyarma filtresi, dikroik ayna ve emisyon filtresi) takın. Anap için Örneği: 377/50 nm band pass, dikroik 409 nm longpass ve Em: 470/40 nm bant geçiren kullanın. </li></ol><img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Şekil 3 &lt;<html> / Strong &gt; : VCF kurulumu. ( A ) Mikroskop içindeki ışık yolunu gösteren VCF kurulumunun yandan görünüşü. Filtre küpü bir uyarma filtresi, dikroik ayna ve bir emisyon filtresi içerir. ( B ) Seçilen oosit odası boyutları, üst oda yarıçapı (1) için 3.4 cm, alt oda uzunluğu (2) için 5.5 cm, alt oda genişliği için (3) 1.4 cm ve orta oda genişliği (4) için 1.7 cm&#39;dir. ( C ) VCF kurulumunun ön görünüşü. Soldaki ilk oküler, oositin kesik açık gerilim sıkıştırma bölmesine monte edilmesi ve permeabilizasyon için. Sonra, oda sağdaki ikinci oküler mikroskop altında kaydırılır. Burada, V1 elektrot 4X objektif kullanarak oosit içine yerleştirilir ve flüoresan suya daldırılmış 40X objektif kullanılarak kaydedilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Itle &quot;&gt; 4. VCF Kaydı <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi kesilmiş açık oosit voltaj kelepçesi için hazırlama adımlarını izleyin ve 18 (agar köprüsü hazırlığı, oositin monte edilmesi, saponin permeabilization) görünür hale getirin. Bununla birlikte, kayıtlardan önce flüoroforun ağartılmasını önlemek için her zaman kırmızı ışık altında çalışın. Oosit yerleştirirken hayvan kutuplarının yukarı baktığından emin olun. Hayvan kutbu zarının altındaki pigmentasyon, sitoplaziden kaynaklanan otofloresansa karşı koruma sağlar ve dolayısıyla arka plan floresanını azaltır. </li><li> Odayı mikroskop üzerine kaydırın ve 4X&#39;lik bir objektif kullanarak odaklayın. </li><li> Vücudun voltajını algılayan V1 elektroduyla (3 M KCl) implante edin, 40X suda daldırma (NA 0.8 - 0.9) objektifine geçin. Yukarı bakan hayvan direğine odaklanın. </li><li> Kırmızı ışığı kapatın. Filtre küpü taretini ve fotodiyotöre bağlı optik çıkış portunu çevirerek doğru filtre küpünü seçin. Sersem açınEn lambayı en yüksek yoğunluğa getirin ve oositten çıkan arka plan flüoresan yoğunluğunu okumak için kısa süre 2-5 saniye açık tutun. Tarif edilen kurulum ile değer Anap için yaklaşık 50-200 pA olmalıdır. </li><li> Kelepçeyi açın, banyo / koruma şalterini aktif konuma getirin ve ben sahne üstündeki topuzu çevirerek membran potansiyelini (V1 - V2) komut potansiyeline ayarlayın. </li><li> Kayıt yazılımında tutma potansiyeli, adım protokolü, sayı ve darbe uzunluğu vb. Değerlerini seçin. Gerilime bağlı akıntıları ve Anap floresan yoğunluklarını kaydedin. </li></ol> 5. İki renkli VCF <ol><li> Aynı proteindeki iki lokasyonu aynı anda izlemek için, ekstraselüler ve erişilebilir bir amino asidi sisteyin haline getirin ve tiol kimyasıyla spesifik etiketlemeyi sağlamak için diğer sisteinleri çıkarın. </li><li> Adım 2.1-2.5&#39;i uygulayın. </li><li> VCF kayıtlarından önce, oositleri 15 dakika boyunca etiketleme solüsyonunda 5 μM TMR-maleimid içinde inkübe edin (veya diğer boyaÖrtüşmeyen spektrumlarla Anap&#39;a kıyasla). </li><li> Aşırı boya çıkarmak için oositleri etiketleme çözeltisi ile üç kez yıkayın. </li><li> Adım 4.1-4.6 uygulayın. </li><li> Filtre küpü taretinde TMR için uygun bir filtre küpü (uyarma filtresi, dikroik ayna ve emisyon filtresi) yerleştirin. Filtre taretini çevirerek TMR filtre küpüne geçin. </li><li> 4.4. Adımda Anap için açıklandığı üzere TMR&#39;nin arka plan flüoresansını okuyun. NOT: Tiyol kimyası ile etiketleme, zarda spesifik olmayan etiketleme nedeniyle yüksek arka plan flüoresanına neden olur. Bu nedenle TMR arka plan floresan amplifikatöre doymuş olabilir (&gt; 2.000 pA). Bu durumda, ışık yoğunluğunu azaltmayın, ancak foto diyoda bir ofset akımı ekleyerek arka plan flüoresanını çıkarın. Piyasada bulunan sistemlerde dedektör sistemindeki &quot;örnek tutma&quot; özelliğini kullanın. Bir laboratuvarda j fonundaki flüoresan değerini (10X nötr yoğunluk filtresi kullanarak) not edin.Bu değer kaydedilmez (doygunluk). </li><li> Adım 4.6&#39;daki gibi aynı anda voltaja bağlı akımları ve TMR floresan yoğunluklarını kaydedin. </li></ol>

<ol>
	<li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Xiao, H., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=At+the+Interface+of+Chemical+and+Biological+Synthesis:+An+Expanded+Genetic+Code.">At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).</li><li>Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+9.">Chapter 9.</a> Handbook of Ion Channels. , 113-133 (2015).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Energetics+of+Allosteric+Regulation+of+HCN2+Ion+Channels+by+Cyclic+Nucleotides.">Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides.</a> J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).</li><li>Shen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoding+unnatural+amino+acids+in+neural+stem+cells+and+optically+reporting+voltage-sensitive+domain+changes+in+differentiated+neurons.">Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons.</a> Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).</li><li>Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CNGA1+Channel+Gating+by+Interactions+with+the+Membrane.">Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane.</a> J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).</li><li>Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mode+shift+of+the+voltage+sensors+in+Shaker+K++channels+is+caused+by+energetic+coupling+to+the+pore+domain.">Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain.</a> J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).</li><li>Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intersubunit+interaction+between+S4-S5+linker+and+S6+is+responsible+for+the+slow+off-gating+component+in+Shaker+K++channels.">An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels.</a> J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+subunits+cooperate+in+cAMP-induced+activation+of+homotetrameric+HCN2+channels.">How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels.</a> Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).</li><li>Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+incorporation+of+a+small,+environmentally+sensitive,+fluorescent+probe+into+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).</li><li>Summerer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+amino+acid.">A genetically encoded fluorescent amino acid.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinitiation+at+non-canonical+start+codons+leads+to+leak+expression+when+incorporating+unnatural+amino+acids.">Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids.</a> Sci Rep. 5, 11866 (2015).</li><li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+one-step+site-directed+deletion,+insertion,+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol.">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).</li><li>Beckert, B., Masquida, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+RNA+by+in+vitro+transcription.">Synthesis of RNA by in vitro transcription.</a> Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).</li><li>Goldin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+Xenopus+laevis+and+oocyte+injection.">Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection.</a> Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).</li><li>Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte+cut-open+vaseline+gap+voltage-clamp+technique+with+fluorometry.">The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Zhao, J., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolated+voltage+sensing+domain+of+the+Shaker+potassium+channel+forms+a+voltage-gated+cation+channel.">The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+vertical+movement+of+a+K++channel+voltage+sensor+measured+with+luminescence+energy+transfer.">Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer.</a> Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).</li><li>Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+charge+displacement+in+voltage-gated+ion+channels+involves+limited+transmembrane+movement.">Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement.</a> Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).</li><li>Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-distance+probes+for+protein+backbone+structure+based+on+energy+transfer+between+bimane+and+transition+metal+ions.">Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).</li><li>Baker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+sensors+of+membrane+potential.">Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential.</a> Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).</li><li>Miranda, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+FRET+reports+calcium-+and+voltage-dependent+gating-ring+motions+in+BK+channels.">State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).</li><li>Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-base+codon/anticodon+strategy+and+non-enzymatic+aminoacylation+for+protein+engineering+with+non-natural+amino+acids.">Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids.</a> Methods. 36 (3), 270-278 (2005).</li><li>Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-base+codons+for+incorporation+of+nonnatural+amino+acids+into+proteins.">Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sürekli olarak tRNA sentetaz ile transkribe edilen tRNA&#39;ların in vivo aminoasilasyonu, floresan ölçümleri için yüksek ekspresyon seviyeleri elde etmeyi mümkün kılar. Etkin fUAA birleşimi için pAnap&#39;ın çekirdeğe doğru enjekte edilmesi önemlidir. Çekirdeğin tam yerinin belirsizliği nedeniyle, DNA enjeksiyonlarının% 10-40&#39;ında başarısız olması ve bunun da ifade edilmeyen (veya sızıntı ifade eden) oositlerin ortaya çıkması beklenir. Bu nedenle, sızıntı kanallarında m...

Çeşitli kimyasal ve fiziksel özelliklerin 200&#39;den fazla doğal olmayan amino asitleri genetik olarak E. coli , maya ve memeli hücrelerindeki proteinlere dahil edilmiştir 3 . Doğal olmayan amino asit, ortogonal olarak tasarlanmış bir tRNA / sentetaz çiftiyle belirli bir durdurma kodonuna tepki olarak dahil edilir. Proteinleri değiştirmek için genetik yaklaşım, protein yapısına ve işlevine değerli bilgiler sağlamıştır. Burada, Gerilim-Kelepçe Florometrini (VCF) floresan bir UAA ile kombine etmek için bir protokol sunuyoruz. VCF&#39;de, flüoresan prob etrafında lokalize olan fonksiyonel verilerin ve yapısal yeniden düzenlemelerin aynı anda gözlemlenmesi (~ 5 Å), milisaniye çözünürlük 1 ile dinamik bilgi elde etmemize izin verir. Flüoresan problar, lokalize protein hareketi üzerine söndürme durumunu değiştirir. Sadece 1-2 A&#39;lık bir hareket, flüoresanda önemli değişiklikler yaratmaya yeterlidirYoğunluk 4 . Hedef proteindeki ilgi alanının belirlenmesinden sonra, site nokta mutasyonu ile mutasyona uğratılmıştır. Klasik olarak, tortu bir sisteine ​​dönüştürüldü, oysa şimdi, amber stop kodonu (TAG) genetik fUAA&#39;nın birleşmesi için eklendi. Protein daha sonra in vitro olarak kopyalanır. Xenopus oositleri, daha büyük manipülasyona ve daha yüksek floresans yoğunluğuna (daha fazla florofor) yol açan, yapı fonksiyonu çalışmaları için tercih edilirken , diğer ifade sistemleri ( örneğin, memeli hücreleri) 5 , 6 , 7 kullanılabilirken, Gürültü oranı. Üstelik, Xenopus oositleri, 2 , 8 nolu endojen proteinlerden düşük arka plana ve hayvan kutbu kalkanlarında karanlık pigmentasyona karşı tSitosol. Xenopus oositleri cerrahi olarak çıkarılır ve fUAA için spesifik olan ortogonal tRNA / tRNA sentetaz çiftini kodlayan DNA, oositlerin çekirdeğine enjekte edilir. 6-24 saatlik inkübasyon süresinden sonra, protein RNA, oositlerin sitozolüne fUAA ile birlikte enjekte edilir, bunu 2-3 gün inkübasyon periyodu takip eder. FUAA&#39;ya herhangi bir hasar vermemek için (foto-ağartma), florofor uyarımını önlemek için Anap dahil prosedürler kırmızı ışık altında gerçekleştirilmelidir. Oositler dik bir flüoresan mikroskopta monte edilmiş kesilmiş açık oosit gerilim-kelepçe düzeneği üzerinde incelenir ve elektrik akımı ve floresans değişiklikleri aynı anda 9 , 10 olarak kaydedilir. Alternatif olarak, iki elektrotlu voltaj kelepçesi 1 veya yama-kelepçe konfigürasyonları 11 kullanılabilir. Floresans, düşük RMS gürültüsü olan uygun dalga boyları tarafından uyarılır ve<html> Yüksek amplifikasyonlu bir amplifikatöre bağlı bir fotodiyot kullanılarak kaydedilen emisyon. Gerilim-kelepçe florometride flüoresan doğal olmayan amino asitler (fUAAs) kullanmanın çeşitli avantajları vardır. Bir tanesi membran proteinlerinin sitosolik tarafına erişimdir; ( Örneğin, Ca 2+ - veya nükleotid bağlanma bölgeleri, voltaj kapılı iyon kanallarının hızlı ve kapalı halde inaktivasyonu, gözenek açma, modül bağlantısı). Tüm bu süreçlere flüoresan etiketleme için artık erişilebilir. Bir diğer avantaj ise, proteinin daha az bozulmasına yol açan probun küçük boyutu olmasıdır. Şimdiye kadar, fUAAs için iki ortogonal tRNA / tRNA sentetaz çiftleri, Xenopus oositlerinde kullanılan tek fUAA olan 3- (6-asetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoik asitin (Anap) 12,13 olduğu düşünülmüştür 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap, 272.3 g / mol molekül ağırlığına sahip ve sadece triptofan 12&#39;den biraz daha büyük olan çevreye duyarlı bir florofordur ( Şekiller 1A, 1B ). Küçük boyundan ötürü, bir bağlayıcı vasıtasıyla bağlanan konvansiyonel fluoroforlara kıyasla (genelde 500 g / mol&#39;den fazla) florofor tarafından daha az sterik etkinin ortaya çıkması muhtemeldir. Dahası, Anapa durumunda, flüorofor, sisteinlerle bağlantılı olanlardan daha protein omurgasına yakın konumda bulunur ve sonuç olarak, Anap daha fazla lokalize yeniden düzenleme istemektedir. Son olarak, bölgeye özgü etiketlemeyi sağlamak için konvansiyonel VCF&#39;deki endojen sisteinlerin uzaklaştırılması, UAA-VCF&#39;de artık gerekli değildir ve bu nedenle (i) proteinleri neredeyse kendi doğal hallerinde bırakır ve (ii) VCF&#39;nin uygulanmasına izin verir Fonksiyonun sistein ikamesi ile değiştirilebildiği daha geniş bir protein aralığını incelemek. <img alt="Şekil 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Şekil 1 : Anap ve Floresans Spektrumu. ( A ) Anapın kimyasal yapısı. ( B ) Anap floresanının solventin hidrofobikliğine duyarlılığını gösteren 1 nM Anap için normalleştirilmiş absorpsiyon spektrumu ve emisyon spektrumu. Emisyon spektrumu, 350 nm&#39;de heyecan verici şekilde elde edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Floresan UAAs&#39;ın bir dezavantajı, aminoasillenmiş tRNA&#39;ların miktarı azsa, durma kodonu okunması, translasyonel yeniden başlatma, C-terminali kesilmiş proteinler veya endojen aminoasilasyona sahip çapraz geçişten heterojen bir protein popülasyonunun oluşabilmesidir. Bu sızıntı ekspresyonu daima fUAA&#39;nın ve tRNA / tRNA sentetaz çifti yokluğunda kontrol edilmelidir. Trans sorununu ele aldık.Lasyonel yeniden başlatma ve daha önce N-terminal ekleme siteleri için nasıl önüne geçileceği 14 . Bununla birlikte, fUAA, tRNA ve tRNA sentetaz doymuş miktarda mevcut olduğunda, sızıntı ekspresyonu olasılığı düşüktür. FUAA-VCF ve konvansiyonel VCF arasındaki temel usul farkı, oositlerin enjeksiyonu ve taşınmasıdır; TRNA ve tRNA sentetazı (pAnap) kodlayan DNA&#39;nın enjeksiyonu ya protein mRNA&#39;yla birlikte enjekte edilen veya alternatif olarak bir asetoksimetil (AM) ester olarak inkübasyon solüsyonuna eklenen Anap&#39;ın sokulması ile devam eder.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Barth&#039;s solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hydrate</td><td>BDH</td><td>BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Horse Serum (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;SOS Standard Oocyte Solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;External recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Internal recording solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Labeling solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Calcium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7.2</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TMR stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td><td>Molcular Probes by Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM in DMSO</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Anap stock solution&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Custom synthesis TCRS-170</td><td>1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Material/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>High Performance Oocyte Clamp</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Acquisition software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Recording Chamber</td><td>Custom machined</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photo diode detection system</td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Electrical shutter driver</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

Gerilim-Kelepçe Fluorometri (VCF), gerçek zamanlı floresan ve akım ölçümlerinin sırasıyla lokal düzenlenmeler ve küresel işlev üzerine rapor verdiği elektrojenik membran proteinlerinin yapısını ve fonksiyonunu araştırmak için tercih edilen bir tekniktir. Kriyo elektron mikroskopisi veya X-ışını kristalografisi gibi yüksek çözünürlüklü yapısal teknikler ilgi proteinlerin statik görüntülerini sağlarken, VCF yapısal yeniden düzenlenmeleri (flüoresan) dinamik fonksiyonel verilere (elektrofizyoloji) bağlamamızı sağlayan dinamik yapısal veriler sağlar. Yakın zamana kadar, proteinlerin yer yönünde flüoresan etiketlemesi için kullanılan tiyol reaktif kimyası, yaklaşımın kapsamını kısıtladı, çünkü endojen olanlar da dahil erişilebilir sisteinler etiketlenecek. Dolayısıyla, endojen sisteinlerden bağımsız proteinler oluşturmak gerekiyordu. Etiketleme ayrıca, hücre dışıyan. Bu, ortogonal bir tRNA ve tRNA sentetaz çifti 2 kullanılarak durdurma kodonunun bastırılmasına yanıt olarak küçük bir fluoresan probu özel olarak dahil etmek için Floresan Doğal Olmayan Amino Asitler (fUAA) kullanılarak değiştirildi. VCF gelişimi sadece DNA enjeksiyonunun (tRNA / sentetaz çifti) iki aşamalı enjeksiyon prosedürüne ve ardından RNA / fUAA ko-enjeksiyonuna ihtiyaç duyar. Şimdi hem hücre içi hem de gömülü alanları etiketlemek mümkündür ve VCF kullanımı önemli ölçüde genişlemiştir. Bu nedenle, VCF tekniği geniş bir protein yelpazesinin incelenmesi için çekici hale gelir ve daha da önemlisi, çok sayıda sitosolik düzenleyici mekanizmanın araştırılmasına izin verir.

Şekil 4 , pAnap ve Anap&#39;ın varlığında hızlı inaktivasyon (IR), L382stop-W434F bulunan Shaker kanallarını ifade eden bir oositten elde edilen VCF kayıtlarının bir örneğini göstermektedir. W434F mutasyonu iyonik potasyum akımlarını bloke eder, bu da geçiş kapısı şarjı yer değiştirmelerini (geçiş akımları) ölçmeyi mümkün kılar. Depolarizasyon üzerine kapı akımlarının (üst iz) ve Anap floresans yoğunluğu değişikliklerinin (alt...

Watch this Scientific Journal Video about Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids at JoVE.com

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir.

Voltaj kelepçesi florometrisi<em&gt; Xenopus</emFloresan Doğal Olmayan Amino Asitler Kullanan Oositler

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K Görüntüleme.  University of Montréal.  Bu makale, iyon kanallarındaki yapısal yeniden düzenlenmeleri araştırmak için maleimid boyaları yerine Floresan Doğal olmayan Amino Asitlerin (fUAA) kullanıldığı klasik Voltaj-Kelepçe Florometrisinin (VCF) geliştirilmesini anlatıyor. Prosedür, Xenopus oosit DNA enjeksiyonu, RNA / fUAA koinjeksiyon ve eşzamanlı akım ve flüoresans ölçümlerini içerir. 

Video: Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Biyoloji

Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation of the guidance receptors is the first step of the signaling mechanisms allowing axon tips, the growth cones, to respond to the ligands. As such, the modulation of their availability at the cell surface is one of the mechanisms that participate in setting the growth cone sensitivity. We describe here a method to precisely visualize the spatio-temporal cell surface dynamics of an axon guidance receptor both in vitro and in vivo in the developing chick spinal cord. We took advantage of the pH-dependent fluorescence property of a green fluorescent protein (GFP) variant to specifically detect the fraction of the axon guidance receptor that is addressed to the plasma membrane. We first describe the in vitro validation of such pH-dependent constructs and we further detail their use in vivo, in the chick spinal chord, to assess the spatio-temporal dynamics of the axon guidance receptor of interest.

We describe here the use of a pH-sensitive green fluorescent protein variant, pHluorin, to study the spatio-temporal dynamics of axon guidance receptors trafficking at the cell surface.&#160;The pHluorin-tagged receptor is expressed both in cell culture and in vivo, using electroporation of the chick embryo.

Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı

During development, axon guidance receptors play a crucial role in regulating axons sensitivity to both attractive and repulsive cues. Indeed, activation ...

Nörobilim

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Gelişim Biyolojisi

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

Genetik Kodlanmış Floresan Gerilim Sensörleri İki Türleri ile Potansiyel görüntüleme Membran

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Biyomühendislik

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Fonksiyonel yaşam Xenopus kurbağa yavrularını koku yollar değerlendirilmesi

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase is more difficult to investigate. Many transport assays utilize radioisotopes to achieve a sufficient signal-to-noise ratio, however, the necessary security measures impose severe restrictions regarding human exposure or assay design. Furthermore, ion transport across cell membranes is critically influenced by the membrane potential, which is not straightforwardly controlled in cell culture or in proteoliposome preparations. Here, we make use of the outstanding sensitivity of atomic absorption spectrophotometry (AAS) towards trace amounts of chemical elements to measure Rb+ or Li+ transport by Na+,K+- or gastric H+,K+-ATPase in single cells. Using Xenopus oocytes as expression system, we determine the amount of Rb+ (Li+) transported into the cells by measuring samples of single-oocyte homogenates in an AAS device equipped with a transversely heated graphite atomizer (THGA) furnace, which is loaded from an autosampler. Since the background of unspecific Rb+ uptake into control oocytes or during application of ATPase-specific inhibitors is very small, it is possible to implement complex kinetic assay schemes involving a large number of experimental conditions simultaneously, or to compare the transport capacity and kinetics of site-specifically mutated transporters with high precision. Furthermore, since cation uptake is determined on single cells, the flux experiments can be carried out in combination with two-electrode voltage-clamping (TEVC) to achieve accurate control of the membrane potential and current. This allowed e.g. to quantitatively determine the 3Na+/2K+ transport stoichiometry of the Na+,K+-ATPase and enabled for the first time to investigate the voltage dependence of cation transport by the electroneutrally operating gastric H+,K+-ATPase. In principle, the assay is not limited to K+-transporting membrane proteins, but it may work equally well to address the activity of heavy or transition metal transporters, or uptake of chemical elements by endocytotic processes.

Measuring Cation Transport by Na,K- and H,K-ATPase in Xenopus Oocytes by Atomic Absorption Spectrophotometry: An Alternative to Radioisotope Assays

We describe a method to quantify the activity of K+-countertransporting P-type ATPases by heterologous expression of the enzymes in Xenopus oocytes and measuring Rb+ or Li+ uptake into individual cells by atomic absorption spectrophotometry. The method is a sensitive and safe alternative to radioisotope flux experiments facilitating complex kinetic studies.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Whereas cation transport by the electrogenic membrane transporter Na+,K+-ATPase can be measured by electrophysiology, the electroneutrally operating ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

<em&gt; Xenopus</emFluorometri ile&gt; Yumurta Kes-açık Vazelin Gap Gerilim-kelepçe Tekniği

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Real-Time Fluorescent Measurement of Synaptic Functions in Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe dementia (FTLD) is dysfunction of communication between neurons and motor neurons and muscle. The underlying process of synaptic transmission involves membrane depolarization-dependent synaptic vesicle fusion and the release of neurotransmitters into the synapse. This process occurs through localized calcium influx into the presynaptic terminals where synaptic vesicles reside. Here, the protocol describes fluorescence-based live-imaging methodologies that reliably report depolarization-mediated synaptic vesicle exocytosis and presynaptic terminal calcium influx dynamics in cultured neurons.
Using a styryl dye that is incorporated into synaptic vesicle membranes, the synaptic vesicle release is elucidated. On the other hand, to study calcium entry, Gcamp6m is used, a genetically encoded fluorescent reporter. We employ high potassium chloride-mediated depolarization to mimic neuronal activity. To quantify synaptic vesicle exocytosis unambiguously, we measure the loss of normalized styryl dye fluorescence as a function of time. Under similar stimulation conditions, in the case of calcium influx, Gcamp6m fluorescence increases. Normalization and quantification of this fluorescence change are performed in a similar manner to the styryl dye protocol. These methods can be multiplexed with transfection-based overexpression of fluorescently tagged mutant proteins. These protocols have been extensively used to study synaptic dysfunction in models of FUS-ALS and C9ORF72-ALS, utilizing primary rodent cortical and motor neurons. These protocols easily allow for rapid screening of compounds that may improve neuronal communication. As such, these methods are valuable not only for the study of ALS but for all areas of neurodegenerative and developmental neuroscience research.

Two related methods are described to visualize subcellular events required for synaptic transmission. These protocols enable the real-time monitoring of the dynamics of presynaptic calcium influx and synaptic vesicle membrane fusion using live-cell imaging of in vitro cultured neurons.

Amiyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Sinaptik Fonksiyonların Gerçek Zamanlı Floresan Ölçümü

Before neuronal degeneration, the cause of motor and cognitive deficits in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and/or frontotemporal lobe ...

Voltaj kelepçesi florometrisi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler