PAnap foi um presente amável do Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabalho foi financiado pelos Institutos Canadenses de Subsídios de Pesquisa de Saúde MOP-102689 e MOP-136894 (para RB) e Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.

As manipulações de rãs foram realizadas de acordo com as diretrizes canadenses e foram aprovadas pelo comitê de ética (CDEA, protocolo # 15-042) da Universidade de Montréal. 1. Preparação de mRNA para incorporação de fUAA <ol><li> Escolha um local de interesse na proteína onde mudanças conformacionais são esperadas para ocorrer. Selecione um aminoácido nesta região para substituir o fUAA. NOTA: A escolha da posição baseia-se nos rearranjos estruturais esperados. Se existir uma estrutura de alta resolução e uma hipótese dos movimentos esperados, o anap deve ser colocado de modo que o ambiente químico altere; Isto pode ser uma mudança na constante dieléctrica (ambiente hidrofóbico versus hidrofílico) ou, mais provavelmente, extinção por outro aminoácido. Os melhores quenchers são triptofanos. Anap deve estar em contato com o extintor em um estado (sobreposição do raio van-der-Waals) e livre deo outro. Se não existirem estruturas ou modelos de alta resolução, seria necessário verificar a região de interesse. Em ambos os casos, é aconselhável selecionar várias localizações próximas para aumentar a probabilidade de obter expressão e sinal de fluorescência. De modo a minimizar os efeitos estéricos durante a maturação e / ou a função da proteína, pode-se escolher substituir aminoácidos grandes e aromáticos (Phe, Trp, Tyr). Os autores, no entanto, experimentaram que a exploração de uma região de interesse para a inserção de fUAA independentemente do aminoácido substituído, é mais produtiva. </li><li> Inserir um codão de paragem âmbar (TAG) no local seleccionado utilizando a mutagénese dirigida ao local 15 . Certifique-se de que a proteína de interesse não termina num codão de paragem âmbar (TAG). Se assim for, mutar para um diferente (ocre ou opal stop codon). Amplificar, isolar e sequenciar o DNA. Obter ARNm de proteína com transcrição in vitro 16 e armazenar o mRNA a 20 ° C ou 80 ° C. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Preparação e Injecção de Oócitos <ol><li> Proceder à cirurgia para obtenção de oócitos da Fase V ou VI de rãs de Xenopus laevis e defolliculate com colagenase como descrito anteriormente 17 . <ol><li> Anestesiar sapos com um anestésico apropriado de acordo com o protocolo animal aprovado (aqui: éster etílico do ácido 3-aminobenzóico). Quando eles não conseguem responder a uma pitada suave para uma ponta do pé (perda de reflexo de retirada), então eles são adequadamente anestesiados para a cirurgia. </li><li> Remova imediatamente as râs da solução anestésica e lave bem a pele com água fresca. Este enxaguamento impedirá que o animal caia em níveis mais profundos de anestesia removendo o produto químico não absorvido da superfície da pele. </li><li> Remova os nós do ovário de um lado cirurgicamente e cuidadosamente abra os nós usando dois fórceps. Incubar e agitar os oócitos em &quot;solução padrão de oócito&quot; (SOS) contendo colagenase a 1% (p / v) durante 20-30 minPara defolliculate. Lavar três vezes com solução SOS. </li><li> Selecionar ovócitos grandes e saudáveis ​​individualmente e incubá-los em solução de Barth suplementada com antibióticos (100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 10 mg / 100 mL de canamicina) e 5% de soro de cavalo a 18 ºC por pelo menos 4 h antes da injeção . NOTA: Após 2 a 4 cirurgias com um atraso de 4 meses entre as fases, Xenopus laevis é eutanizado por incubação prolongada (&gt; 1 h) com éster etílico do ácido 3-aminobenzóico. </li></ol></li><li> Para a injeção nuclear de DNA, prepare uma ponta de injeção longa e fina para poder alcançar o núcleo e evitar danificar o oócito. Encha a ponta da injeção com óleo e monte-a no dispositivo nanoinjetor. <ol><li> Instale o nano-injector sob um microscópio estéreo e use fórceps para quebrar a extremidade da ponta. Ejetar o óleo até que não haja bolhas de ar presas dentro da extremidade da ponta. </li></ol></li><li> Colocar 1 μL de 0,1 μg /# 181; L pAnap em água livre de nuclease contendo NaOH (1% de NaOH 1 N) em um pedaço de parafilme sob um estereoscópio e encher a ponta de injeção com o DNA. </li><li> Transferir 40 oócitos para uma placa de injecção revestida com malha contendo solução de Barth suplementada com antibióticos. NOTA: Para fazer o prato de injecção revestido com malha, corte uma peça de tamanho apropriado de malha de nylon de 800 μm para encher uma placa de Petri de poliestireno. Adicionar clorofórmio para o centro e, em seguida, coloque a malha na parte superior. Segure a malha plana até que o plástico conjuntos. </li><li> Como o núcleo do oócito está localizado no pólo animal (escuro), aponte a ponta da injeção no centro do pólo animal e empalar de forma que a ponta se aproxime do centro do hemisfério animal (ou 2-3x a profundidade em relação à injeção de RNA ). Injectar 9,2 nL de pAnap no núcleo de cada oócito. A ponta fina e o pequeno volume de injeção podem resultar em injeção irregular ou ponta bloqueada. Ocasionalmente verifique se a injeção funciona injetando no ar. NOTA: Se o DNA é devidamente injetado no núcleo é incerto. Esperar, portanto, 10 - 40% dos oócitos para não expressar o par tRNA / sintetase. Ver Discussão para mais detalhes. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustraï¿½o da injecï¿½o de ADN e ARN em Oï¿½itos de Xenopus para Anap Incorporation. Primeiro, pAnap é injetado no núcleo do oócito Xenopus ( 1 ). Após 6-24 h, Anap e canal RNA são coinjected no pólo vegetal ( 2 ). O Anap será ortogonalmente aminoacilado com o ARNt portador de um anti-codão de bloqueio âmbar, pela aminoacil-ARNt-sintetase que é codificada por pAnap. Deste modo, os Anap-ARNt aminoacilados são reconhecidos pelo ribossoma no codão de paragem âmbar inserido no canalL de ARN, resultando na supressão do codão de paragem e inserção de Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="6"><li> Incubar os oócitos em 2 mL de solução de Barth suplementada com antibióticos e 5% de soro de cavalo (HS) a 18 ° C durante 6-24 h para permitir a expressão robusta de Anap tRNAs específicos e tRNA-sintetases. NOTA: O tempo de incubação do DNA pode durar vários dias antes da injeção de RNA, mas não aumenta a expressão. </li><li> Prepare o nano-injetor para injeção de RNA (o mesmo que o passo 2.2, mas a ponta da injeção não precisa ser tão fina quanto para a injeção de DNA). Trabalhe apenas sob luz vermelha a partir deste ponto para evitar o fotoblanqueio do Anap. </li><li> Misture 1 μl de Anap 1 mM com 1 μL de mRNA 1-2 μg / μL diretamente em um pedaço de parafilme e encha a ponta da injeção com a solução mista. Impala logo abaixo da membrana no(Brilhante) e injectar 46 nL em cada ovocito injectado com pAnap. NOTA: A concentração de mRNA requerida depende da proteína de interesse. </li><li> Incubar os oócitos protegidos da luz em uma caixa ou envolto em folha de alumínio, em solução de Barth suplementado com antibióticos e 5% de soro de cavalo a 18 ° C por 2-3 dias. Troque com a solução fresca de Barth todos os dias e remova os oócitos mortos para evitar contaminação. </li></ol> 3. Configuração VCF <ol><li> Instale o equipamento de aperto de tensão de oócito cortado aberto como descrito anteriormente 18 . </li><li> Montar o sistema de registro eletrofisiológico em um microscópio de fluorescência vertical, instalando a câmara de gravação em um controle deslizante que permite movê-lo entre o estereoscópio padrão para colocar o oócito eo microscópio para realizar as medições de fluorescência ( Figura 2c ). NOTA: A geometria da câmara para os oócitos cortados não é adequada para usar a tra normalNsmitted luz para iluminação durante a manipulação. Portanto, uma lâmpada halógena &quot;gooseneck&quot; com filtro vermelho é usada para iluminar lateralmente a partir do topo. O condensador do microscópio pode ser removido fazer espaço para baixar o estágio para a câmara de eletrofisiologia. </li><li> Conectar um sistema de detecção de fotodiodo à porta de saída de montagem em C do microscópio de fluorescência ( Figura 2a ). Ligue a leitora de fotocorrente a um segundo canal de entrada no processador de sinal digital (DSP, conversor analógico / digital - digital / analógico). </li><li> Use uma lâmpada de halogéneo de 100 W, 12 V como fonte de luz para a excitação de fluorescência. NOTA: Em alternativa, podem ser utilizados queimadores de Hg, mas têm de ser reduzidos em intensidade para evitar um foto-branqueamento demasiado rápido durante as gravações. A iluminação por LED só é recomendada se os respectivos LEDs apresentarem uma intensidade significativa na gama de excitação ( por exemplo, ~ 350 nm para Anap). A maioria dos LEDs brancos não atinge muito no espectro UV. </li><li> InsErt um obturador controlado eletricamente entre a fonte de luz de excitação e microscópio e conectar seu controle (tipicamente TTL-pulso) a uma saída digital do DSP. Tempo o TTL-pulso no software de gravação (consulte a documentação do fabricante), de modo que o obturador abre ~ 100 ms antes do início da gravação. Desta forma, qualquer vibração durante o processo de abertura não interfere com a gravação. O tempo depende da velocidade e vibração do obturador. Termine o pulso 5ms antes do fim da gravação como mostrado na Figura 4 . Desta forma, o valor para a fluorescência total é também registado. </li><li> Insira um cubo de filtro apropriado (filtro de excitação, espelho dicróico e filtro de emissão) na torreta do cubo do filtro. Para Anap, utilizar Passo de banda Ex: 377/50 nm, passo largo 409 nm dicroico e passo de banda Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : configuração VCF. ( A ) Vista lateral da configuração VCF mostrando o caminho da luz dentro do microscópio. O cubo do filtro contém um filtro de excitação, um espelho dicróico e um filtro de emissão. ( B ) As dimensões da câmara de oócito são 3,4 cm para o raio superior da câmara (1), 5,5 cm para o comprimento da câmara inferior (2), 1,4 cm para a largura da câmara inferior (3) e 1,7 cm para a largura da câmara intermédia (4). ( C ) Vista frontal da configuração VCF. O primeiro ocular à esquerda é para montar o oócito na câmara de aperto de tensão aberta e para permeabilização. Em seguida, a câmara é deslizada sob o microscópio no segundo olho para a direita. Aqui, o eléctrodo V1 é inserido no oócito utilizando o objectivo 4X, e a fluorescência é registada utilizando o objectivo 40X de imersão em água. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Gravação VCF <ol><li> Seguir os passos de preparação para a tensão de bloqueio de oócito cortada como anteriormente descrito e visualizado 18 (preparação da ponte de ágar, montagem do oócito, permeabilização da saponina). No entanto, trabalhar sob luz vermelha em todos os tempos para evitar o branqueamento do fluoróforo antes de gravações. Ao colocar o oócito, certifique-se de que o pólo animal está voltado para cima. A pigmentação sob a membrana polar animal protege contra a autofluorescência originária do citosol e, portanto, reduz a fluorescência de fundo. </li><li> Deslize a câmara para o microscópio e foco usando um objetivo 4X. </li><li> Empale o oócito com o eletrodo V1 (3 M KCl), mude para o objetivo 40X de imersão em água (NA 0,8 - 0,9). Foco no pólo animal que está enfrentando para cima. </li><li> Desligue a luz vermelha. Selecione o cubo do filtro direito girando a torre do cubo do filtro e a porta de saída óptica conectada ao fotodiodo. Ligue o halogéneoEn lâmpada na maior intensidade e em breve mudar o obturador aberto por 2-5 s para ler a intensidade de fluorescência de fundo originário do oócito. Com a configuração descrita o valor deve ser de cerca de 50-200 pA para Anap. </li><li> Ligue o grampo, rode o interruptor de banho / guarda para ativo e ajuste o potencial de membrana (V1 - V2) ao potencial de comando, rodando o botão na cabeça. </li><li> Selecione o potencial de retenção, o protocolo de passo, o número eo comprimento de pulsos, etc. no software de gravação. Registre as correntes dependentes da tensão e as intensidades de fluorescência Anap. </li></ol> 5. Duas cores VCF <ol><li> Para monitorizar simultaneamente duas localizações na mesma proteína, muta um aminoácido extracelular e acessível em cisteína, e remove outras cisteínas para garantir rotulagem específica com tiol-química. </li><li> Execute a etapa 2.1-2.5. </li><li> Antes das gravações VCF, incubar oócitos em TMR-maleimida 5 μM em solução de rotulagem durante 15 min (ou outro coranteCom espectros não sobrepostos comparados com Anap). </li><li> Lave os oócitos com solução de rotulagem três vezes para remover o excesso de corante. </li><li> Execute a etapa 4.1-4.6. </li><li> Insira um cubo de filtro apropriado para TMR (filtro de excitação, espelho dicróico e filtro de emissão) na torreta do cubo do filtro. Mude para o cubo do filtro TMR girando a torre do filtro. </li><li> Leia a fluorescência de fundo para TMR como descrito para Anap no passo 4.4. NOTA: O rótulo com a química tiol resulta em alta fluorescência de fundo devido à marcação inespecífica na membrana. Portanto, a fluorescência de fundo TMR pode saturar o amplificador (&gt; 2000 pA). Nesse caso, não diminua a intensidade da luz, mas simplesmente subtraia a fluorescência de fundo adicionando uma corrente de deslocamento ao fotodiodo. Em sistemas comercialmente disponíveis, use o recurso &quot;sample-and-hold&quot; no sistema detector. Observe o valor de fluorescência de fundo (usando um filtro de densidade neutra 10X) em um laboratório jComo este valor não será registrado (saturação). </li><li> Registre as correntes dependentes da tensão e as intensidades de fluorescência TMR simultaneamente, como no passo 4.6. </li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

A aminoacilação in vivo de tRNAs que estão continuamente a ser transcritos em conjunto com a tRNA-sintetase, torna possível obter níveis de expressão elevados para medições de fluorescência. Para a incorporação eficiente de fUAA, é crítico que o pAnap seja corretamente injetado no núcleo. Devido à incerteza da localização exacta do núcleo, espera-se que 10-40% das injecções de ADN falhem, resultando em oócitos que não expressam (ou que expressam fugas). Portanto, é importante verificar a ...

Mais de 200 aminoácidos não naturais de várias propriedades químicas e físicas foram geneticamente incorporados em proteínas em células de E. coli , leveduras e mamíferos 3 . O aminoácido não natural é incorporado em resposta a um codão de paragem específico através de um par tRNA / sintetase engendrado ortogonalmente. A abordagem genética para modificar proteínas forneceu insights valiosos sobre a estrutura ea função da proteína. Aqui, apresentamos um protocolo para o uso de Fluorometria de Voltagem-Clamp (VCF) em combinação com uma UAA fluorescente. No VCF, a observação simultânea de dados funcionais e rearranjos estruturais localizados ao redor da sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obter informações dinâmicas com resolução milissegundo 1 . As sondas fluorescentes alteram o seu estado de extinção ao movimento localizado da proteína. Um movimento de apenas 1-2 Å é suficiente para levar a alterações significativas na fluorescênciaIntensidade 4 . Após a identificação do local de interesse na proteína alvo, o local é mutado por mutação pontual. Classicamente, o resíduo tinha sido mutado para uma cisteína enquanto que agora, um codão de paragem âmbar (TAG) é introduzido para a incorporação genética de fUAA. A proteína é então transcrita in vitro . Enquanto outros sistemas de expressão ( por exemplo, células de mamíferos) podem ser utilizados 5 , 6 , 7 , os oócitos de Xenopus são preferíveis para estudos de estrutura-função devido ao seu maior tamanho, levando a manipulação mais fácil e maior intensidade de fluorescência (mais fluoróforos) Ruído. Além disso, os oócitos de Xenopus têm baixa formação de proteínas endógenas 2 , 8 , ea pigmentação escura no pólo animal protege contra a fluorescência de fundo de tEle citosol. Os oócitos de Xenopus são removidos cirurgicamente e o ADN que codifica o par tRNA / tRNA-sintetase ortogonal específico para a fUAA é injectado no núcleo dos oócitos. Após um período de incubação de 6-24 h, a proteína ARN é co-injectada com a fUAA no citosol dos oócitos, seguido por um período de incubação de 2-3 dias. A fim de evitar qualquer dano ao fUAA (foto-branqueamento), os procedimentos incluindo Anap têm de ser levados a cabo sob luz vermelha para evitar a excitação do fluoróforo. Os oócitos são estudados em uma configuração de braçadeira de tensão de oócito cortada aberta, que é montada em um microscópio de fluorescência vertical, e mudanças de corrente elétrica e fluorescência são registradas simultaneamente 9 , 10 . Em alternativa, podem ser utilizadas as configurações de tensão de dois eléctrodos 1 ou de grampo-grampo 11 . A fluorescência é excitada por comprimentos de onda apropriados com baixo<html> Emissão gravada usando um fotodíodo ligado a um amplificador com alta amplificação. Existem várias vantagens do uso de aminoácidos fluorescentes não naturais (fUAAs) na fluorometria de tensão-braçadeira. Um deles é o acesso ao lado citosólico das proteínas da membrana; Muitos processos reguladores estão localizados aqui ( por exemplo, Ca2 + - ou sítios de ligação de nucleotídeos, inativação rápida e fechada de canais iónicos com voltagem, abertura de poros, acoplamento de módulo). Todos estes processos estão agora acessíveis para rotulagem fluorescente. Outra vantagem é o pequeno tamanho da sonda levando a menos perturbação da proteína. Até agora, dois pares de tRNA / tRNA sintetase ortogonais para fUAAs foram desenvolvidos 12 , 13 , onde o ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanóico (Anap) é o único fUAA que tem sido utilizado em oócitos de Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap é um fluoróforo ambientalmente sensível com um peso molecular de 272,3 g / mol e é apenas ligeiramente maior do que o triptofano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Devido ao seu pequeno tamanho, é provável que sejam introduzidos menos efeitos estéricos pelo fluoróforo em comparação com os fluoróforos convencionais ligados através de um ligante (tipicamente mais do que 500 g / mol). Além disso, no caso de Anap, o fluoróforo está localizado mais próximo do esqueleto da proteína do que os ligados às cisteínas e, consequentemente, Anap está a testar rearranjos mais localizados. Finalmente, a remoção de cisteínas endógenas em VCF convencional para assegurar a marcação específica de sítio não é mais uma exigência em UAA-VCF e portanto (i) deixa as proteínas em (quase) o seu estado nativo e (ii) permite a aplicação de VCF Para estudar uma gama mais ampla de proteínas em que a função pode ser alterada pela substituição de cisteína. <img alt="figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Espectro de Anap e Fluorescência. ( A ) Estrutura química de Anap. ( B ) Espectro de absorção normalizado e espectros de emissão para Anap 1 nM, demonstrando a sensibilidade da fluorescência de Anap à hidrofobicidade do solvente. Os espectros de emissão foram obtidos por excitação a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Uma desvantagem do uso de UAAs fluorescentes é que uma população heterogénea de proteínas pode resultar de leitura de codão de terminação, reiniciação de tradução, proteínas truncadas de terminal C ou crosstalk com aminoacilação endógena se a quantidade de tRNAs aminoacilados for escassa. Tal expressão de vazamento deve ser sempre verificada na ausência do par de ARNt / tRNA sintetase. A questão da transReinicialização lacional e como evitá-la para locais de inserção N-terminais anteriormente 14 . No entanto, quando a fUAA, tRNA e tRNA sintetase estão presentes em quantidades saturadas, só permanece uma baixa probabilidade de expressão de vazamento. A principal diferença processual entre fUAA-VCF e VCF convencional é a injecção e manuseamento dos oócitos; A injecção de ADN que codifica o ARNt e a ARNt-sintetase (pAnap) é seguida pela introdução de Anap, que é co-injectado com o ARNm da proteína ou, alternativamente, adicionado à solução de incubação como um éster de acetoximetilo (AM).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="567">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:199px;">Solutions</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:96px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barth&#39;s solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>90mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP366-500</td>
			<td>3mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M-9397</td>
			<td>0.82mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-7902</td>
			<td>0.41mM</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ca(NO3)2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-1396</td>
			<td>0.33mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaOH hydrate</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH7225-4</td>
			<td>pH 7.6</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicilin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140122</td>
			<td>100&#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Kanamycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15160054</td>
			<td>10mg/100mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Horse serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16050122</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SOS Standard Oocyte Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td>102 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td>3 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">External recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Internal recording solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L14282</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>E478-500</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labeling solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P250-1</td>
			<td>115mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>10mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239232</td>
			<td>2mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258105</td>
			<td>pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMR stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR)</td>
			<td>Molcular Probes by Life Technologies</td>
			<td>T6027</td>
			<td>5mM in DMSO</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anap stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">Anap</td>
			<td>ABZENA (TCRS)</td>
			<td>Custom synthesis TCRS-170</td>
			<td style="width:96px;">1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Material/Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pAnap</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Performance Oocyte Clamp</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>CA-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gpatch Acquisition software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis software</td>
			<td colspan="3">Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recording Chamber</td>
			<td colspan="2">Custom machined</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photo diode detection system</td>
			<td>Dagan Corporation</td>
			<td>PhotoMax-200/PIN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrical shutter driver</td>
			<td>UNIBLITZ</td>
			<td>VCM-D1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

voltage-clamp fluorometry in xenopus oocytes using fluorescent unnatural amino acids

A Fluorometria de Voltage-Clamp (VCF) tem sido a técnica de escolha para investigar a estrutura e função das proteínas de membrana eletrogênicas, onde as medidas em tempo real de fluorescência e correntes relatam simultaneamente rearranjos locais e função global, respectivamente. Enquanto que as técnicas estruturais de alta resolução, como a microscopia de crio-elétrons ou a cristalografia de raios-X, fornecem imagens estáticas das proteínas de interesse, o VCF fornece dados estruturais dinâmicos que nos permitem relacionar os rearranjos estruturais (fluorescência) com dados funcionais dinâmicos (eletrofisiologia). Até recentemente, a química tiol-reactiva utilizada para a marcação fluorescente dirigida ao local das proteínas restringia o âmbito da abordagem porque todas as cisteínas acessíveis, incluindo as endógenas, seriam rotuladas. Foi assim necessário construir proteínas isentas de cisteínas endógenas. A rotulagem também se restringiu a locais acessíveis a partir dolado. Isto mudou com o uso de Aminoácidos Não-naturais Fluorescentes (fUAA) para incorporar especificamente uma pequena sonda fluorescente em resposta à supressão do codão de paragem utilizando um par ortogonal de tRNA e tRNA sintetase 2 . A melhoria do VCF requer apenas um procedimento de injeção de dois passos de injeção de DNA (par tRNA / sintetase) seguido por co-injeção de ARN / fUAA. Agora, a rotulagem tanto intracelular e locais enterrados é possível, eo uso de VCF se expandiu significativamente. A técnica VCF torna-se assim atraente para o estudo de uma vasta gama de proteínas e, mais importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

A Figura 4 mostra um exemplo de gravações de VCF obtidas a partir de um ovócito que expressa canais de Shaker com inactivação rápida removida (IR), L382stop-W434F na presença de pAnap e Anap. A mutação W434F bloqueia as correntes iônicas de potássio, o que torna possível medir os deslocamentos transitórios de carga de gating (correntes de gating). As gravações simultâneas das correntes de passagem (traçado superior) e das alterações de intensidade de f...

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Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência.

Braçadeira de tensão Fluorometria em<em&gt; Xenopus</em&gt; Oócitos Usando Aminoácidos Fluorescentes Não-naturais

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

voltage-clamp-fluorometry-xenopus-oocytes-using-fluorescent-unnatural

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

10.4K visualizações.  University of Montréal.  Este artigo descreve um aumento da Fluorometria Voltagem-Clamp convencional (VCF) onde Fluorescente Aminoácidos Não-naturais (fUAA) são usados ​​em vez de corantes maleimida, para sondar rearranjos estruturais em canais iônicos. O procedimento inclui injeção de DNA de oócito de Xenopus , coinjeção de ARN / fUAA e medições simultâneas de corrente e fluorescência. 

Vídeo: Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Um sensor baseado em Polianilina de Ácidos Nucleicos

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies ...

Bioquímica

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. Radioactivity has been the predominant method of DNA labeling in EMSAs. However, recent advances in fluorescent dyes and scanning methods have prompted the use of fluorescent tagging of DNA as an alternative to radioactivity for the advantages of easy handling, saving time, reducing cost, and improving safety. We have recently used fluorescent EMSA (fEMSA) to successfully address an important biological question. Our fEMSA analysis provides mechanistic insight into the effect of a missense mutation, G73E, in the highly conserved HMG transcription factor SOX-2 on olfactory neuron type diversification. We found that mutant SOX-2G73E protein alters specific DNA binding activity, thereby causing olfactory neuron identity transformation. Here, we present an optimized and cost-effective step-by-step protocol for fEMSA using infrared fluorescent dye-labeled oligonucleotides containing the LIM-4/SOX-2 adjacent target sites and purified SOX-2 proteins (WT and mutant SOX-2G73E proteins) as a biological example.

We describe here an optimized protocol of fluorescent Electrophoretic Mobility Shift Assays (fEMSA) using purified SOX-2 proteins together with infrared fluorescent dye-labeled DNA probes as a case study to tackle an important biological question.

Um protocolo otimizado para a mobilidade eletroforética ensaio de desvio usando oligonucleotídeos Infrared corante fluorescente-etiquetados

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the double bond. Changes in FA composition play a crucial role in the adaptation of bacteria to their environment. These modifications entail a change in the ratio of iso versus anteiso branched FAs, and in the proportion of unsaturated FAs relative to saturated FAs, with double bonds created at specific positions. Precise identification of the FA profile is necessary to understand the adaptation mechanisms of Bacillus species.
Many of the FAs from Bacillus are not commercially available. The strategy proposed herein identifies FAs by combining information on the retention time (by calculation of the equivalent chain length (ECL)) with the mass spectra of three types of FA derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). This method can identify the FAs without the need to purify the unknown FAs.
Comparing chromatographic profiles of FAME prepared from Bacillus cereus with a commercial mixture of standards allows for the identification of straight-chain saturated FAs, the calculation of the ECL, and hypotheses on the identity of the other FAs. FAMEs of branched saturated FAs, iso or anteiso, display a constant negative shift in the ECL, compared to linear saturated FAs with the same number of carbons. FAMEs of unsaturated FAs can be detected by the mass of their molecular ions, and result in a positive shift in the ECL compared to the corresponding saturated FAs.
The branching position of FAs and the double bond position of unsaturated FAs can be identified by the electron ionization mass spectra of picolinyl and DMOX derivatives, respectively. This approach identifies all the unknown saturated branched FAs, unsaturated straight-chain FAs and unsaturated branched FAs from the B. cereus extract.

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).

Identificação de ácidos graxos no<em&gt; Bacillus cereus</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts prepared from Xenopus laevis eggs have been powerful in dissecting biochemical networks underlying the cell-cycle progression, their ensemble average measurement typically leads to a damped oscillation, despite each individual oscillator being sustained. This is due to the difficulty of perfect synchronization among individual oscillators in noisy biological systems. To retrieve the single-cell dynamics of the oscillator, we developed a droplet-based artificial cell system that can reconstitute mitotic cycles in cell-like compartments encapsulating cycling cytoplasmic extracts of Xenopus laevis eggs. These simple cytoplasmic-only cells exhibit sustained oscillations for over 30 cycles. To build more complicated cells with nuclei, we added demembranated sperm chromatin to trigger nuclei self-assembly in the system. We observed a periodic progression of chromosome condensation/decondensation and nuclei envelop breakdown/reformation, like in real cells. This indicates that the mitotic oscillator functions faithfully to drive multiple downstream mitotic events. We simultaneously tracked the dynamics of the mitotic oscillator and downstream processes in individual droplets using multi-channel time-lapse fluorescence microscopy. The artificial cell-cycle system provides a high-throughput framework for quantitative manipulation and analysis of mitotic oscillations with single-cell resolution, which likely provides important insights into the regulatory machinery and functions of the clock.

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

We present a method for the generation of in vitro self-sustained mitotic oscillations at the single-cell level by encapsulating egg extracts of Xenopus laevis in water-in-oil microemulsions.

Reconstituição das oscilações do ciclo celular em microemulsões dos extratos de ovo sem célula Xenopus

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Structure Solution of the Fluorescent Protein Cerulean Using MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological macromolecules. Until recently, a major requirement has been the availability of relatively large, well diffracting crystals, which are often challenging to obtain. However, the advent of serial crystallography and a renaissance in multi-crystal data collection methods has meant that the availability of large crystals need no longer be a limiting factor. Here, we illustrate the use of the automated MeshAndCollect protocol, which first identifies the positions of many small crystals mounted on the same sample holder and then directs the collection from the crystals of a series of partial diffraction data sets for subsequent merging and use in structure determination. MeshAndCollect can be applied to any type of micro-crystals, even if weakly diffracting. As an example, we present here the use of the technique to solve the crystal structure of the Cyan Fluorescent Protein (CFP) Cerulean.

We present the use of the MeshAndCollect protocol to obtain a complete diffraction data set, for use in subsequent structure determination, composed of partial diffraction data sets collected from many small crystals of the fluorescent protein Cerulean.

Solução de estrutura da proteína fluorescente Cerulean usando MeshAndCollect

X-ray crystallography is the major technique used to obtain high resolution information concerning the 3-dimensional structures of biological ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identifying Amino Acid Overproducers Using Rare-Codon-Rich Markers

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally identified by harnessing the competitions between amino acids and their analogs. However, this analog-based method is of low accuracy, and proper analogs for specific amino acids are limited. Here, we present an alternative strategy that enables an accurate, sensitive, and high-throughput screening of amino acid overproducers using rare-codon-rich markers. This strategy is inspired by the phenomenon of codon usage bias in protein translation, for which codons are categorized into common or rare ones based on their frequencies of occurrence in the coding DNA. The translation of rare codons depends on their corresponding rare transfer RNAs (tRNAs), which cannot be fully charged by the cognate amino acids under starvation. Theoretically, the rare tRNAs can be charged if there is a surplus of the amino acids after charging the synonymous common isoacceptors. Therefore, retarded translations caused by rare codons could be restored by feeding or intracellular overproductions of the corresponding amino acids. Under this assumption, a selection or screening system for identifying amino acid overproducers is established by replacing the common codons of the targeted amino acids with their synonymous rare alternatives in the antibiotic resistance genes or the genes encoding fluorescent or chromogenic proteins. We show that the protein expressions can be greatly hindered by the incorporation of rare codons and that the levels of proteins correlate positively with the amino acid concentrations. Using this system, overproducers of multiple amino acids can be readily screened out from mutation libraries. This rare-codon-based strategy only requires a single modified gene, and the host is less likely to escape the selection than in other methods. It offers an alternative approach for obtaining amino acid overproducers.

This study presents an alternative strategy to the conventional toxic analog-based method in identifying amino acid overproducers by using rare-codon-rich markers to achieve accuracy, sensitivity, and high-throughput simultaneously.

Identificando os produtores de aminoácidos com marcadores ricos em Codon raros

To satisfy the ever-growing market for amino acids, high-performance production strains are needed. The amino acid overproducers are conventionally ...

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. This method utilizes a recombinant modified SUMO-trapping protein fragment, kmUTAG, derived from the Ulp1 SUMO protease of the stress-tolerant budding yeast Kluyveromyces marxianus. We have adapted the properties of the kmUTAG for the purpose of studying sumoylation in a variety of model systems without the use of antibodies. For the study of SUMO, KmUTAG has several advantages when compared to antibody-based approaches. This stress-tolerant SUMO-trapping reagent is produced recombinantly, it recognizes native SUMO isoforms from many species, and unlike commercially available antibodies it shows reduced affinity for free, unconjugated SUMO. Representative results shown here include the localization of SUMO conjugates in mammalian tissue culture cells and nematode oocytes.

SUMO is an essential and highly conserved, small ubiquitin-like modifier protein. In this protocol we are describing the use of a stress-tolerant recombinant SUMO-trapping protein (kmUTAG) to visualize native, untagged SUMO conjugates and their localization in a variety of cell types.

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. Nucleases display a variety of vital physiological roles in prokaryotic and eukaryotic organisms, ranging from maintaining genome stability to providing protection against pathogens. Altered nuclease activity has been associated with several pathological conditions including bacterial infections and cancer. To this end, nuclease activity has shown great potential to be exploited as a specific biomarker. However, a robust and reproducible screening method based on this activity remains highly desirable.
Herein, we introduce a method that enables screening for nuclease activity using nucleic acid probes as substrates, with the scope of differentiating between pathological and healthy conditions. This method offers the possibility of designing new probe libraries, with increasing specificity, in an iterative manner. Thus, multiple rounds of screening are necessary to refine the probes&#39; design with enhanced features, taking advantage of the availability of chemically modified nucleic acids. The considerable potential of the proposed technology lies in its flexibility, high reproducibility, and versatility for the screening of nuclease activity associated with disease conditions. It is expected that this technology will allow the development of promising diagnostic tools with a great potential in the clinic.

Altered nuclease activity has been associated with different human conditions, underlying its potential as a biomarker. The modular and easy to implement screening methodology presented in this paper allows the selection of specific nucleic acid probes for harnessing nuclease activity as a biomarker of disease.

Triagem cinética da atividade da nuclease usando sondas de ácido nucleico

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

Enriquecimento de Tecidos mamíferos e Oócitos xenopus com colesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...