Investigación apoyada por New Hampshire-INBRE a través de un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA), P20GM103506, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del NIH.

Nota: Las consideraciones de tiempo para cada ensayo deben realizarse ya que las preparaciones individuales de los medios requieren diferentes tiempos. Por ejemplo, los medios sólidos de placa de agar deben dejarse enfriar y secar suficientemente (1-2 días). Las consideraciones de tiempo adicionales ( es decir, la colonia única y el crecimiento de la noche a la mañana) se especifican en cada protocolo y se encuentran en la Tabla 2 . 1. Preparación de los medios <ol><li> 1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS) <ol><li> Se pesan 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na $ ₂ $ HPO $ ₄ $ y 0,12 g de KH $ ₂ $ PO $ ₄ $ . Se combinan los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, se ajusta el volumen a 500 ml con agua desionizada, se ajusta el pH a 7,2 usando un pHmetro y se añade HCl gota a gota a la solución y se esteriliza en autoclave o filtro con un filtro de 0,22 μm. 1x PBS se puede almacenar a temperatura ambiente indefinidamente. PRECAUCIÓN: El HCl es un ácido concentrado y se debe manipular deA regulaciones institucionales, locales, estatales y federales. Para instrucciones de manipulación adecuadas, consulte la hoja de datos de seguridad proporcionada por el fabricante. </li></ol></li><li> Caldo Luria-Bertani (LB) <ol><li> Se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl. Combine los componentes en una botella de 1 litro, ajuste el volumen a 500 ml con agua desionizada, autoclave y guarde a temperatura ambiente por hasta 6 meses. Para las condiciones clásicas de inducción de virulencia del biotipo, ajuste el pH a 6,5 ​​usando HCl antes del autoclavado. </li></ol></li><li> AKI que contiene 0,03% (p / v) de NaHCO $ ₃ $ <ol><li> Para el componente 1 (medio AKI): pesar 7,5 g de peptona, 2,0 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl. Combine los componentes en una botella de 1 l, ajuste el volumen a 450 ml con agua desionizada y autoclave. El medio AKI puede ser almacenado a temperatura ambiente por hasta 6 meses. </li><li> Para el componente 2 (NaHCO $ ₃ $ ): se pesan 1,5 g de NaHCO $ ₃ $ y se ajusta el volumenA 50 ml con agua desionizada en una vesícula estéril. El filtro esteriliza NaHCO3 usando un filtro de 0,22 μm. El NaHCO 3 debe prepararse inmediatamente antes de su uso. </li><li> Combine asépticamente los dos componentes creando una relación 1:10 filtrando el Componente 2 en el Componente 1 antes de usarlo. </li></ol></li><li> Placas de Agar Luria-Bertani (LB) <ol><li> Se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 7,5 g de agar. Se combinan los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, se ajusta el volumen a 500 ml con agua desionizada, se autoclave y se prepara en placas de Petri estériles de 100 mm x 15 mm estándar. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 6 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C. </li></ol></li><li> Placas de agar de LB suplementadas con polimixina B <ol><li> Para el componente 1 (agar LB): se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 7,5 g de agar. Combinar los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajustar el volumen a 500 ml wiAgua desionizada y autoclave. </li><li> Para el componente 2 (polimixina B): disolver la polimixina B en agua desionizada en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml hasta una concentración de 50.000 UI / μl y esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 μm. </li><li> Una vez que el Componente 1 se enfríe al tacto, pero no se solidifica todavía, agregue asépticamente 500 μl de Componente 2 al Componente 1 creando una concentración final de 50 UI / μl y mezcle bien. Preparar en placas de Petri estériles de tamaño estándar de 100 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 3 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C. </li></ol></li><li> Minimal Citrate Medium Agar Plates <ol><li> Para el componente 1 (agar con azul de bromotimol): pesar 7,5 g de agar y 0,02 g de azul de bromotimol. Combinar los constituyentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajustar el volumen a 450 ml con agua desionizada y autoclavar la mezcla. </li><li> Para el componente 2 (10x VBMM): pesa 1.0 g de MgSO $ ₄ $ 7H $ ₂ $ O, 10,0 g de ácido cítrico H $ ₂ $ O, 50,0 g de K $ ₂ $ HPO $ ₄ $ anhidro y 17,5 g de NaNH $ ₄ $ HPO $ ₄ $ 4H $ ₂ $ O. Combinar los constituyentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, Con agua desionizada y autoclave o filtro esterilizar usando un filtro de 0,22 μm. 10x VBMM se puede almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses. </li><li> Añadir 50 ml de Componente 2 al Componente 1 y preparar en placas de Petri estériles de 100 mm x 15 mm estándar vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 6 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C. </li></ol></li><li> Placas de agar de leche <ol><li> Para el Componente 1 (leche): pese 8,0 g de leche desnatada sin grasa instantánea en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajuste el volumen a 200 ml con agua desionizada y autoclave. </li><li> Para el componente 2 (agar con infusión corazón-cerebro): pesan 3,68 g de infusión corazón-cerebro y 6,0 g de agar. Combinar el conEn un matraz Erlenmeyer de 500 ml, ajustar el volumen a 200 ml con agua desionizada y autoclave. </li><li> Combine los dos componentes vertiendo el Componente 2 en el Componente 1, después de esterilizar en autoclave y mezcle bien. Preparar en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm. Las placas de leche se pueden almacenar hasta una semana envueltas en plástico, con la tapa hacia abajo a 4 ° C. Se preparan en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. </li></ol></li><li> Placas de Agitación de Motilidad <ol><li> Para el componente 1 (agar LB): se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 2,0 g de agar. Combinar los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, ajustar el volumen a 500 ml con agua desionizada y autoclave. </li><li> Para el componente 2 (cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (p / v), TTC): pesar 0,25 g de TTC. Ajustar el volumen a 25 ml con agua desionizada en una vesícula estéril y esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 μm. Almacenar hasta 6 meses a temperatura ambiente envueltoEn papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. </li><li> Añadir 2,5 ml de TTC estéril al 1% (p / v) a medios autoclavados. </li><li> Vierta medios tan gruesos como sea posible (≥50 mL / placa) en grandes placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta por una semana, con la tapa hacia arriba a 4 ° C. Se preparan en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Para el Componente 1 (Caldo de Metil Red-Voges-Proskauer, MR-VP): pesar 1,7 g de medio MR-VP en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar el volumen a 100 mL con agua desionizada y autoclave. El caldo estéril MR-VP se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 6 meses. </li><li> Para el componente 2 (alfa ( alpha) naftol al 5% (p / v)): pesar 1,0 g de alpha - naftol en una vesícula estéril y ajustar el volumen a 20 ml con etanol al 95%. Α-naftol se puede almacenar a temperatura ambiente por hasta 1 semana envuelto en papel de aluminio para minimizar la luz expOsure </li><li> Para el componente 3 (hidróxido de potasio al 40% (p / v): KOH): pesar 20,0 g de KOH en una vesícula estéril, ajustar el volumen a 50 ml con agua desionizada estéril. KOH se puede almacenar hasta 6 meses a temperatura ambiente en un recipiente de plástico. </li></ol></li></ol> 2. Mantenimiento y Crecimiento de V. Cepas de cholerae <ol><li> Preparación y Uso de Cultivos Almacenados Congelados <ol><li> Pellet 1,8 ml de líquido durante la noche de cultivo durante 2 min por centrifugación (≥ 8.600 xg) en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml, eliminar sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 900 μ l de caldo LB fresco pipeteado. </li><li> Añadir 900 μl de glicerol estéril al 60% (v / v) al cultivo y mezclar por vórtex. </li><li> Transferir la mezcla a un tubo criogénico estéril de 2 ml y almacenar indefinidamente a -80 ° C. </li><li> Para usar, eliminar una pequeña cantidad de material congelado usando un bucle de inoculación estéril y raya para colonias individuales en LB agAr placas. Inmediatamente devuelva el material congelado a -80 ° C después del uso para evitar que las culturas se descongelen completamente. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li></ol></li><li> Crecimiento de cultivos durante la noche en medio líquido <ol><li> Streak para colonias individuales (según la sección 2.1.4) a partir de material congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocular 4 mL de caldo LB líquido en un tubo de cultivo estéril de 10 mL con una sola colonia tocando la superficie de la colonia única con un palillo de aplicación estéril y transfiriendo la colonia al caldo líquido. </li><li> Incubar con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12 a 16 h a 37ºC. </li></ol></li><li> Curva de crecimiento <ol><li> Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2. </li><li> Hacer una dilución 1: 100 del cultivo durante la noche transfiriendo 250 μl de cultivo durante la noche a 25 mL de caldo LB fresco en un matraz erlenmeyer de 250 mL estéril. </li><li> Medir la densidad óptica de los cultivos líquidos a 600 nm (DO 600 ) cada hora comenzando en el momento de la inoculación (T 0 ). </li><li> Incubar una dilución de 1: 100 del cultivo durante la noche con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante hasta 30 h a 37 ° C, o hasta que el cultivo alcance la máxima densidad. </li><li> Gráfica de la DO 600 vs tiempo y el uso de regresión lineal para determinar el tiempo aproximado de duplicación de cada cepa. </li></ol></li><li> Condiciones de inducción de la Virulencia del Bitipo de El Tor <ol><li> Streak para colonias individuales de stock congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo, durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocular 10 ml de medio AKI que contiene NaHCO 3 al 0,03% (p / v) con una sola colonia. </li><li> Incubar el cultivo sin aireación a 37 ° C durante 3,5 h. </li><li> Quitar 7 ml de cultivo e incubar los 3 ml restantes de cultuCon aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 4 h adicionales. </li></ol></li><li> Condiciones de inducción de virulencia del biotipo clásico <ol><li> Streak para colonias individuales de stock congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C. </li><li> Inocular 4 ml de caldo LB líquido (pH 6,5) con una sola colonia. </li><li> Incubar con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12 a 16 h a 30 ° C. </li></ol></li><li> Pellet de celdas de lavado en 1x PBS <ol><li> Pellet 1,8 mL de cultivo durante la noche durante 2 min por centrifugación (≥8,600 xg) en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta. Re-suspender el sedimento celular en 1,8 mL 1x PBS por pipeteado. </li><li> Repita el procedimiento de lavado tres veces seguido de una resuspensión final en 1,8 ml 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Caracterización de V. Biótipos de cholerae <ol><li> PAGPantallas Genéticas basadas en CR usando ctxB y tcpA <ol><li> Diseñar un conjunto de cebadores, que recolectan aproximadamente 50-70 pb aguas arriba y aguas abajo de los sitios de inicio y de parada de traslación de ctxB y tcpA , respectivamente. </li><li> Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2. </li><li> Aísle el ADN cromosómico usando un kit disponible comercialmente diseñado para bacterias Gram-negativas. El ADN cromosómico purificado puede almacenarse indefinidamente a -20 ° C. El aislamiento de ADN cromosómico utilizando kits comercialmente disponibles tarda generalmente aproximadamente 4 h. </li><li> Utilice un espectrofotómetro de micro-volumen para asegurar que la muestra de ADN cromosómico sea de alta calidad (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Para cada aislamiento de ADN cromosómico, preparar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en hielo en tubo (s) de PCR de 200 μl estéril y amplificar regiones de ctxB y tcpA usando componentes de PCR estándar: Taq polimerasa y buFfer (o equivalentes), solución de dNTP, y cebadores directos / inversos. Utilizar parámetros estándar de PCR (~ 3 h). Por ejemplo, utilice el siguiente protocolo: <ol><li> Desnaturalización inicial a 95 ° C durante 120 s. </li><li> Desnaturalización a 95 ° C durante 60 s. </li><li> Primers de recocido a 60 ° C durante 45 s. </li><li> Extender a 72 ° C durante 90 s. </li><li> Repita los pasos 3.1.5.2 a 3.1.5.4 durante 34 ciclos. </li><li> Extensión final 72 ° C durante 600 s. </li><li> Mantenimiento infinito a 4 ° C. </li></ol></li><li> Se tiñe 5 μl de producto (s) de PCR respectivo utilizando un colorante de carga de gel de ADN 6x estándar y se carga aproximadamente 10 μl de escalera de 1 kb y 10 μl de producto de PCR en un gel de agarosa al 1% en 1x Tris-Borato-EDTA buffer. </li><li> Ejecutar electroforesis en gel a 130 V hasta que el colorante del frente llegue al final, pero no fuera, del gel (aproximadamente 90 minutos). Se recomienda una supervisión constante ya que el voltaje y los tiempos de funcionamiento pueden variar dependiendo del equipo. </li><li> Tras la verificación deCon una amplificación de PCR exitosa en el tamaño esperado, purificar los 45 μl de producto (s) PCR restantes utilizando un kit de limpieza y concentrado de ADN comercialmente disponible. </li><li> Secuencia de producto (s) de PCR limpiado utilizando los mismos cebadores utilizados para la amplificación por PCR, y preparar por directrices de instalación de secuenciación local. </li><li> Compare el formato FASTA de secuencias de genes de cada uno de los aislados a la secuencia publicada disponible en el sitio web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), buscando los siguientes números de acceso en el cuadro de búsqueda. </li><li> CtxB : región (clásica) entre VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (clásica) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Ensayos fenotípicos para la clasificación del biotipo mediante Spotting <ol><li> Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2. </li><li> Lave el (los) sedimento (s) de células tal como se especifica en el protocolo 2.6. </li><li> Utilice una pipeta paraColocar 1 μl de cultivo lavado en el respectivo medio. Para las especificaciones de selección e incubación medianas, consulte la Tabla 2. </li></ol></li><li> Ensayo de Motilidad <ol><li> Preparar el (los) cultivo (s) durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2. </li><li> Lave el (los) sedimento (s) de células tal como se especifica en el protocolo 2.6. </li><li> Inocular las placas de agar de motilidad insertando el punzón de inoculación en el cultivo líquido lavado y &quot;apuñalar&quot; verticalmente en el medio. Entre cada inoculación, esterilice la punzón de alambre con un quemador de Bunsen, y al apuñalar el agar, asegúrese de que la punzada de inoculación no se doble, ya que esto puede alterar los resultados. </li><li> Incubar las placas con la tapa hacia arriba durante 14 a 24 h a 37 ° C. Después de 14 h, monitorear las placas de motilidad de cerca para evitar el crecimiento excesivo de los cultivos. </li></ol></li><li> Ensayo Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Preparar el (los) cultivo (s) durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2. </li><li> Inocular 4Ml de Voges-Proskauer rojo de metilo, o caldo MR-VP, pipeteando 10 μl de cultivo de noche previamente preparado en 4 mL de caldo MR-VP en un tubo de cultivo estéril e incuba con aireación en un incubador agitador a 225 rpm durante 12 a 16 H a 37ºC. </li><li> Añadir 150 μl de α-naftol al 5% (p / v) y 50 μl de KOH al 40% (p / v) a 1 ml de alícuotas de MR-VP durante la noche en tubos de cultivo estéril, respectivamente. </li><li> Agitar brevemente y dejar reposar a temperatura ambiente durante un máximo de 4 h hasta que se produzca un cambio de color. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

De los más de 200 identificados V. Cholerae , sólo O1 y O139 tienen potencial epidémico. El serogrupo O1 se puede dividir en dos biotipos: clásicos y El Tor. Sin embargo, han surgido cepas híbridas, denominadas variantes El Tor 13 , 17 , que poseen el fondo del biotopo El Tor, y tienen características clásicas 8 , 9 , 10 , <sup class=...

El cólera es una enfermedad del intestino delgado distal causada por el consumo de alimentos o agua contaminados que contienen la bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae . Los síntomas del cólera incluyen vómitos y diarrea acuosa incontrolable, lo que lleva a la deshidratación severa, que si no se trata adecuadamente, dará lugar a la muerte. V. Los cólera se pueden dividir en más de 200 serogrupos basados ​​en la estructura del antígeno O del lipopolisacárido de la superficie celular. Sin embargo, sólo 2 serogrupos, O1 y O139, han mostrado potencial epidémico o pandémico 1 , 2 . Además, el serogrupo O139 se ha aislado principalmente en Asia sudoriental 3 , 4 , mientras que el serogrupo O1 se distribuye en todo el mundo. Además, el serogrupo O1 puede dividirse en 2 biotipos principales: clásico y El Tor. El biotipo clásico fue responsable de la primera 6 pandemia de cóleraS entre 1817 y 1923. La séptima pandemia en curso es el resultado del biotipo El Tor, que ha desplazado globalmente al biotipo clásico en el medio ambiente 5 , 6 , 7 . Recientemente han surgido cepas que contienen características distintivas de los biotipos clásicos y de El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 y han sido denominadas variantes de El Tor 13 , 17 . Algunas variantes de El Tor han demostrado una elevada capacidad de virulencia con una progresión de la enfermedad más rápida y severa que la observada anteriormente, enfatizandoLa necesidad de un enfoque más amplio para la identificación de agentes y la prevención y el tratamiento de enfermedades 8 , 9 , 18 . Mientras que la identificación del biotipo no determina inmediatamente el tratamiento, los avances adicionales en el desarrollo de la vacuna y los futuros agentes terapéuticos pueden beneficiarse de la distinción del biotipo. La primera serie de protocolos enumerados aquí permitirá a los investigadores mantener correctamente V. Cholerae en un laboratorio. La consistencia y el posterior análisis requieren la preparación de las poblaciones y el crecimiento de aislamientos, que no dependen del biotipo. Sin embargo, para inducir óptimamente la expresión de genes de virulencia, se requieren técnicas de cultivo específicas independientes del biotipo 19 . Además, la preparación para varios ensayos genéticos y bioquímicos se describen en este manuscrito. La toxina del cólera (CT) y la toxina co-rePilus gulado (TCP) son dos factores de virulencia principales controlados por el regulador maestro ToxT en ambos biotipos de la V. Cholerae O1 serogrupo 20 . La TC es una toxina bipartita compuesta por cinco CtxB Subunidades que rodean una única subunidad CtxA, y es responsable de la pérdida rápida de electrolitos asociada con el cólera. El TCP es un pilus tipo IV codificado por el operón tcp ( tcpABQCRDSTEF ), y está implicado en la unión y colonización del intestino delgado distal. TcpA es el primer gen del operón tcp que codifica las subunidades de pilina individuales esenciales para la construcción del pilus 8 . La secuencia génica para ctxA se conserva completamente entre biótipos clásicos y El Tor, mientras que ctxB y tcpA difieren a través de los dos biotipos pero se conservan dentro de cada biotipo 8 . CtxB se conserva completamente entre biotipos excepto en dos bases positivas(115 y 203). En el biotipo El Tor, la timina reside en las posiciones base 115 y 203, mientras que el biotipo clásico contiene citosina en estas bases. TcpA se conserva completamente dentro de cada biotipo, pero difieren en múltiples bases entre los biotipos. Estas distinciones genéticas sirven como marcadores de identificación de biotipos primarios y después de la secuenciación del producto de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye estos sitios, las secuencias aisladas pueden compararse con el O395 clásico de tipo salvaje (WT) o con el El Tor N16961 de WT para determinar el fondo del biotipo De CT y TCP, respectivamente, en un aislado de V. cholerae . Numerosos protocolos han sido desarrollados para caracterizar las distinciones fenotípicas entre los biotipos clásicos y El Tor 21 , 22 , 23 . La polimixina B es un antibiótico peptídico que compromete la integridad de la membrana celular externa en gram negativos bacY la resistencia a la polimixina B se pueden visualizar a través del ensayo de resistencia a la polimixina B 21 . El citrato es un sustrato primario del ciclo de Kreb, y la capacidad de metabolizar el citrato como fuente única de carbono se puede determinar usando el ensayo del metabolismo del citrato [ 22] . HapR codifica un regulador global y el quórum maestro de sensores de regulación en V. cholerae, HapR, que se une a diversas regiones promotoras y regula el gen y operón expresión [ 24] . Algunas cepas patógenas de V. cholerae tienen una mutación natural de cambio de marco en el gen hapR que ha causado que esta regulación dependiente de la densidad de la expresión del gen de la virulencia se pierde [ 24 , 25] . Medir la actividad de la proteasa regulada por HapR usando medios de agar de leche permite al investigador identificar si un aislado particular contiene un HapR 23 funcional. losEnsayos de hemólisis para determinar la capacidad de una cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisan los glóbulos rojos; El grado de hemólisis se puede visualizar en placas de agar sangre [ 23] . La motilidad se asocia a menudo con virulencia en V. cholerae y puede analizarse utilizando placas de agar de motilidad [ 23] . El ensayo de Voges-Proskauer prueba la capacidad de una cepa de fermentar la glucosa como única fuente de carbono y producir la acetoin del subproducto 21 . Con la aparición de las variantes de El Tor, es difícil predecir los resultados de cualquier ensayo fenotípico dado sin exámenes genotípicos extensivos, y antes de deducir el biotipo de fondo de V. Cholerae , se recomienda realizar este ensamblaje de los ensayos 23 y comparar los resultados con cepas de referencia como en la Tabla 2 . Aquí, hemos avanzado una serie de protocolos, utilizando colectivamente el citadoLos ensayos genotípicos y fenotípicos para un enfoque más completo de la caracterización de V. Biótipos de cholerae . Además, hemos descrito las distinciones genotípicas y fenotípicas de la V conocida. Cholerae El Tor variantes (MQ1795 y BAA-2163), en comparación con las cepas de referencia de biótipo de uso común (WT clásico O395, WT El Tor C6706, y WT El Tor N16961, Tabla 1 ). La aparición de las variantes de El Tor ha planteado retos a la fiabilidad de los protocolos de caracterización de biotipos de ensayos únicos empleados anteriormente; Sin embargo, este sistema de identificación de múltiples ensayos permitirá una caracterización más fiable de la V clínica y ambiental. Cólera aislados.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerol</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agar with brain-heart infusion</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;amp;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=en&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;amp;currentLanguage=en&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blood Agar Plates</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C;&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromothymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S311500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator&amp;trade; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosive;&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=M63500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Broth</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S374500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S27110&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S218500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Nonfat dry milk</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Store at 2-4 &amp;deg;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_pageLabel=search_page&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;amp;searchString=1840148&amp;amp;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazolium chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

La bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae es el agente etiológico de la enfermedad gastrointestinal infecciosa del cólera. Debido a la prevalencia global y severidad de esta enfermedad, V. Cholerae ha sido ampliamente estudiado tanto en el medio ambiente como en el laboratorio, requiriendo un mantenimiento adecuado y técnicas de cultivo. Classical y El Tor son dos biotipos principales que componen el V. Cholerae O1 serogrupo, cada uno con características genotípicas y fenotípicas únicas que proporcionan mecanismos confiables para la caracterización del biotipo y requieren condiciones de cultivo de inducción de virulencia distintas. Independientemente del biotipo de la cepa causante de cualquier infección o brote dado, el tratamiento estándar para la enfermedad incluye la terapia de rehidratación complementada con un régimen de antibióticos. Sin embargo, la clasificación del biotipo puede ser necesaria para los estudios de laboratorio y puede tener impactos más amplios en el campo biomédico.A principios de 2000 se identificaron aislamientos clínicos que muestran rasgos genotípicos y fenotípicos de los biotipos clásicos y de El Tor. Los híbridos recién identificados, denominados variantes de El Tor, han causado que la identificación del biotipo de aislamiento clínico y medioambiental se vuelva más compleja que los protocolos de identificación de ensayos únicos tradicionales anteriores. Además de describir V. Cholerae mantenimiento general y técnicas de cultivo, este manuscrito describe una serie de genes específicos ( ctxB y tcpA ) basada en la PCR pantallas genéticas y ensayos fenotípicos (polimixina B resistencia, el metabolismo de citrato, la actividad proteolítica, la actividad hemolítica, la motilidad y el metabolismo de la glucosa a través de Voges- Proskauer) usados ​​colectivamente para caracterizar y / o distinguir entre biotipos clásicos y de El Tor. En conjunto, estos ensayos proporcionan un enfoque sistemático eficiente para ser utilizado como una alternativa o, además, a costosos experimentos de trabajo intensivo en la caracterizaciónCión de V. Cholerae clínicos (y medioambientales) aislados.

Para el mantenimiento adecuado y el uso de cualquier cepa bacteriana, se recomienda conocer el tiempo de duplicación de la cepa (s) de interés. En este caso, las tasas de crecimiento variables de V comúnmente utilizado . Cholerae se demostraron a través de una curva de crecimiento, y los tiempos aproximados de duplicación se calcularon mediante regresión lineal. WT El Tor N16961 y El Tor variante MQ1795 demostraron tiempos de duplicación más cortos (~ 1...

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Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Aislados Clínicos y Ambientales

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.9K vistas.  Plymouth State University.  Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio. 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

I am Es.In MindUP, we study biology of human pathogens in non hosts environments. Many human pathogens after exiting their human host have to survive in the environment before infecting another host. So our goal is to better understand processes that control survival of human pathogens in the environment.And our goal is to then better understand transmission dynamics of infectious agents. So we are using Vibrio cholera, the cost of agent of diarrhea, disease, cholera as a model organism. Vibrio cholera is a facultative human pathogen and it has an aquatic lifecycle.Therefore, it provides us great opportunity to study the survival of human pathogen in a natural environment. There are many tools to study this organism. Its genome is completely sequenced and there are micro array representing every gene in the genome.And furthermore, there are many tools that we can manipulate the genome of this organism. My research program takes advantage of these tools and integrates them to study aquatic lifecycle of cholera. So in our experiments, we try to simulate the aquatic environments that organism lives in.And then we would like to know how does this organism so senses fluctuations in its environment with respect to nutrient load, temperature, salinity, or other biological stressors such as pages and tzo? So in aquatic environment, RIA cholera is found either in a free living form or in a surface attached form. And the surface attached forms are known as biofilms, which are simply composed of microorganisms and their extra polymeric substances, which can be exo polysaccharide and proteins and sometimes DNA.And this matrix acts as a glue and hold the organism together. And when grown in biofilm mode, these organisms are actually resistant to fluctuating parameters of their environments and they can be better protected from, for example, phage and proteasome probations. And these are factors that are controlling abundance of microorganisms in the environment.Some of the recent techno technological advance that helped us in our studies are the completion of the genome sequence of the organism and development of microray technology. Using these technologies, we can determine at the whole genome level how this organism responds to major fluctuations in its environment such as nutrient deprivation or changes in temperature. Or one of our major goal is to integrate our whole genome expression studies to a network analysis.So we would like to identify genetic regulatory network that controls response of to fluctuating environmental parameters. We would like to be able to model behavior of organism in the environment. And also we still do not know when in the environment with whom Vibra Cide interacts with.We do not know much about ecology of this organism, and we also do not know relevance of the genes and processes we identified to be important for survival of this organism in the laboratory to the real world. No are the genes that we identified express when Ria cholera is present in natural environment. We also would like to be able to identify and culture organisms that Vibrio Cora interacts with because in the environment, Vibrio Cora is a part of the complex microbial community.So I think understanding biology of Vibrio Cora in natural environment would be a, it's a challenging and it's critical for us to understand biology of the organism. Within the next five years, I hope that we would be able to better characterize op polysaccharide components of biofilms. For example, in Vibrio cholera, we still do not know structure of the op polysaccharide that is holding the cells together.We also do not know all the components of biofilm metrics. Eventually I think it be great to be able to quantify components of the biofilm metrics in natural biofilms of these organisms. I think another major challenge is to study, be OC in natural environment.And I hope that we would be able to take advantage of comparative genomic studies and combine whole genomic expression profiling comparative genomics to better understand evolution of IBR cholera as a pathogen.

Vibrio cholerae: organismo modelo para estudiar la patogénesis bacteriana - Entrevista

Investigación

Biología

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

El uso de un ensayo de microarrays Pan-viral (Virochip) a la pantalla de muestras clínicas de los patógenos virales

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Inmunología e Infección

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Un método para modificar genéticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Sobre la base de la transformación natural y la recombinación FLP

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

El cultivo y mantenimiento<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; En un ambiente anaeróbico

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Desarrollo de una más sensible y específica cromogénico medio de agar para la detección de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Y Otros<em&gt; Vibrio</em&gt; Especies

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Inducción de la diferenciación celular y de imágenes monocelulares de<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Células Swimmer y Swarmer

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Formación de biopelículas inducida por sales biliares en patógenos entéricos: técnicas para la identificación y cuantificación

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de

Resumen

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Ensayo de incubación de monedas para cuantificar las interacciones competitivas entre aislados de Vibrio fischeri

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes