Un protocolo proporciona un modelo sencillo para evaluar la integridad sináptica de una manera dependiente de la edad. Así podemos estudiar enfermedades neurodegenerativas en tejidos que son susceptibles tanto al análisis estructural como funcional. Esta técnica facilita la preservación del tejido neuronal y muscular de las uniones neuromusculares musculares longitudinales dorsales.
Investigar exhaustivamente la función sináptica a lo largo del tiempo y los tejidos con los que es difícil trabajar. Este método se puede aplicar al estudio de enfermedades neurodegenerativas como el ELA, el Parkinson, la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Alzheimer. Antes de comenzar la disección cortar aproximadamente 10 milímetros de la punta de una pipeta de 200 microlitro.
Después de administrar la anestesia, juega de seis a 10 moscas en un plato de Petri de seis centímetros que contenga 70%etanol y usa un pincel para beber suavemente fusionar cada mosca. Después de uno a dos minutos, utilice fórceps para transferir una mosca por las piernas o alas a un plato de disección recubierto de elastómero de silicona que contenga de siete a 10 mililitros de PBS bajo un microscopio de disección. Con la mosca sumergida en el PBS, utilice el contundente Dumont número cinco encontrar fórceps para quitar cuidadosamente las alas y utilizar a lo largo de una tijera de disección de resorte de borde recto para hacer una pequeña incisión en el lado ventral de la cutícula para eliminar las piernas.
Sosteniendo las tijeras de disección en una mano y fórceps contundentes en la otra, coloque el lado ventral de la mosca hacia arriba y sosteniendo el espécimen en su lugar con los fórceps, retire la cabeza y el abdomen con las tijeras. Utilice una pipeta de 200 microlitros en 40 microlitros y la punta de pipeta modificada para recoger las toraceas y colocar las muestras de tejido aislado en un tubo debidamente etiquetado que contenga 900 microlitros de PBS y 150 microlitros de 32% formaldehído. Después de 30 minutos a temperatura ambiente, utilice una pipeta Pasteur para retirar el fijador y enjuague los pliegues tres veces con 1,5 mililitros de PBS por lavado.
Antes de comenzar las bisecciónes Don criosonados guantes y gafas de seguridad y llenar un matraz de recorrido con nitrógeno líquido. Utilice un rompe cuchillas para agarrar una hoja de plumas en un ángulo y doblar la hoja para romper una pieza pequeña. Utilice el rompe cuchillas para bloquear la cuchilla en su posición y utilice una pipeta Pasteur de vidrio para retirar todo el PBS de los tubos de muestra.
Utilice pinzas criogénicas para sumergir los tubos en el matraz de nitrógeno líquido. Después de 10 segundos, usa una pipeta Pasteur para agregar aproximadamente 300 microlitros de PBS helado a cada tubo sobre hielo, y coloca un lado ventral de hacha pobre en un plato de disección recubierto de elastómero de silicona de 10 centímetros que contenga PBS frío. Usa un par de fórceps aburridos para colocar el tórax y encontrar un par de fórceps, para eliminar algunos de los ganglios torácicos para exponer la línea media del tórax.
Usando la línea media del tórax como guía, utilice el juego para hacer un corte superficial a través de un tercio del tórax y utilice los fórceps contundentes para colocar el tórax en un ángulo de 45 grados. Utilice la hoja para cortar directamente por la línea media del tórax para obtener dos hemithoraces y para cuidadosamente hacer uno o dos cortes para eliminar el exceso de tejido sin dañar los músculos longitudinales dorsales. A continuación, coloque las muestras de tejido muscular en un tubo adecuadamente etiquetado de PBS.
Cuando todas las muestras del tórax han sido bisectas permeabilizan los tejidos en el tampón de bloqueo durante al menos una hora a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, vórtice solución de tinción estructural recién preparada y añadir 150 microlitros de la mancha a cada muestra para una incubación de dos horas en un rotador a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la tinción, lave las muestras en PBST y coloque cinco etiquetas de refuerzo apiladas y cortadas en la mitad de 15 milímetros de separación en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
Utilice una punta de micro pipeta modificada para transferir los Thoraces a cada diapositiva y utilice una toallita de laboratorio para eliminar cualquier exceso de PBST. Utilice fórceps para organizar las muestras de tal manera que los Thoraces están mirando el músculo hacia arriba. Cuando las muestras estén correctamente orientadas, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para aplicar 70 microlitros de medio de montaje a cada diapositiva y cubra cada diapositiva con un resbalón de cubierta.
A continuación, utilice esmalte de uñas para recubrir generosamente los bordes exteriores de los resbalones de la cubierta para obtener un sello completo alrededor de cada tejido. Evaluar la integridad sináptica. Las uniones neuromusculares se pueden teñir con peroxidasa de rábano picante y las neuronas motoras de estaño de floe en proteína de unión alquitrán de 43 Mutanes De 43 Kilodalton tienen poca o ninguna tinción de peroxidasa de rábano picante para el día 21, mientras que la proteína de tipo salvaje permanece intacta.
No se observan diferencias visibles en la tinción muscular. Además de la tinción estructural del músculo longitudinal dorsal, el etiquetado de unión neuromuscular también puede proporcionar una evaluación de la integridad sináptica con marcadores sinápticos pre sinápticos y postsapticos. Tenga en cuenta que la congelación de flash de nitrógeno líquido facilita una utilización exitosa, ya que el tejido no inflamado congelado es más susceptible a daños durante la disección.
Siguiendo este procedimiento, las muestras de conservación pueden ser analizadas por microscopía confocal para medir un aspecto específico de la estructura sináptica.
