Name: a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration
Uploaded: 2017-07-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do Keller e Magie Labs na Quinnipiac University por sugestões úteis. Em particular, gostaríamos de agradecer Barron L. Lincoln II pelo desenvolvimento deste ensaio de lesões no Keller Lab. Também gostaríamos de agradecer a Quinnipiac University College of Arts and Science Grant-In-Aid concedida à LC Keller.

1. Preparação de Reagentes e Equipamento <ol><li> Prepare 1x tampão de dissecção (NaCl 70 mM, KCl 5 mM, CaCl2 0,02, MgCl2 20 mM, 10 mM de NaHCO3, 115 mM de sacarose, trealose a 5 mM, HEPES a 5 mM; pH 7,2). </li><li> Prepare 1x salina tamponada com fosfato (PBS). </li><li> Prepare 1x PBT usando 1x PBS com Triton X-100 a 0,01%. </li><li> Prepare placas de agar de suco de frutas. 14 Em resumo, misture 30 g de agar em 700 mL de H 2 O e autoclave. Dissolver 0,5 g de metilparabeno em 10 mL de etanol e adicionar solução a 300 mL de concentrado de suco de fruta (uva ou maçã). Misture o concentrado na solução de agar autoclavada e despeje nas tampas de placas de Petri de 10 mm x 35 mm. NOTA: A pré-mistura de agar de uva também pode ser comprada de várias empresas (consulte Tabelas de Materiais ). </li><li> Obtenha pinças de tamanho 5 que permitam ferir mecanicamente as larvas. </li><li> Use padrão Drosophila CO 2 </sAparelho de anestesia baseado em ub&gt;. </li></ol> 2. Seleção de Larvas de Drosophila <ol><li> Pegue um frasco ou frasco de Drosophila contendo larvas errantes do terceiro instar que foram cultivadas a 25 ° C. </li><li> Selecione dez larvas individuais de 2º ou 3º instar com base na aparência. As larvas do terceiro estádio podem ser identificadas pelo aparecimento de espirais ramificados anteriores, enquanto as larvas do segundo estádio são menores e possuem mais espirais anteriores do tipo clube. NOTA: Os estádios larvais também podem ser identificados por tempo. A 25 ° C, as larvas do segundo estágio aparecem aproximadamente 48 h após a eclosão, e as larvas do terceiro estádio são aproximadamente 24 horas depois. Se estiver interessado em examinar a neurodegeneração no NMJ, larvas de segundo estádio precisam se machucar. </li></ol> 3. Preparando Larvas de Drosophila para Ferimento Mecânico <ol><li> Escolha cuidadosamente larvas individuais por pinça ou pincel, sendo cautelosoPara não comprimi-lo de qualquer maneira. </li><li> Coloque diretamente dez larvas no prato de vidro contendo 1X PBS frio ou tampão de dissecação para remover quaisquer detritos alimentares e desacelerar a mobilidade larval. </li></ol> 4. Lesões mecânicas e tratamento de Larvas de Drosophila <ol><li> Coloque cada larva individual em um aparelho de anestesia com CO 2 . </li><li> Sob um microscópio de dissecação, rote cuidadosamente cada larva para o lado dorsal para visualizar os nervos segmentares através da cutícula. </li><li> Posicione o tamanho de 5 pinças aproximadamente 1/2 a 2/3 do comprimento da larva a partir dos ganchos da boca. Uma vez posicionado, aperte aproximadamente 1/3 da cutícula ventral contendo os nervos segmentares com pinça do tamanho 5. <ol><li> Para garantir que os nervos segmentares larvais estejam feridos, aplique força suficiente para esmagar os nervos segmentares, mas deixe a cutícula intacta. Para determinar a quantidade correta de força, esmague 10 larvas e assegureA taxa de mortalidade após 5 h é inferior a 50%. </li></ol></li><li> Após lesão, transferir cuidadosamente larvas para uma placa de agar de suco de fruta contendo aproximadamente 0,5 g de pasta de levedura. Coloque cada larva de modo que sua extremidade anterior esteja na pasta de fermento, para alimentação contínua, apesar da motilidade interrompida. NOTA: Para garantir que os nervos segmentares larvais tenham sofrido ferimento, a motilidade da larva interrompida pode ser observada após a transferência para a placa de ágar. A larva lesada é efetivamente paralisada posterior ao local da lesão, mas ainda pode mover os ganchos da boca e se alimentar. Uma taxa de mortalidade elevada de animais após lesão é comum por isso é melhor ferir 20-50% mais animais do que é necessário para uma experiência. </li><li> Coloque placas de agar contendo pasta de levedura e 10 larvas lesadas no fundo de uma placa de Petri vazia de 100 x 15 mm. Cubra esta placa de petri, agora contendo as larvas lesadas em uma placa de ágar com uma toalha de papel úmida, garantindo que a toalha de papel não toque as larvas ou as placas de ágar. Coloque issoPlaca de Petri em um recipiente maior, bem fechado, na RT. </li><li> Recuperar larvas para dissecção após períodos especificados (6, 12 ou 24 h) pós-lesão. NOTA: Para examinar os efeitos imediatos da lesão no citoesqueleto axonal, as larvas podem ser dissecadas diretamente após a lesão. Para examinar defeitos de transporte axonal, as larvas podem ser dissecadas aproximadamente 6 h após a lesão. Cerca de 12 h após a lesão, pode-se observar uma acumulação de proteínas ubiquitinadas e 24 h após a lesão, pode-se observar a degeneração de neurônios motores no NMJ. </li></ol> 5. Análise da Neurodegeneração no NMJ <ol><li> Disselar a larva NMJ de Drosophila como descrito anteriormente. 15 , 16 Em resumo, larvas de pin em uma placa de Sylgard, cortar a superfície dorsal e filé com pinos em uma gota de tampão de dissecação para expor a musculatura da parede do corpo. Fixar larvas em 4% paraformaldeído (PFA) ou solução de Bouin, dependendo do antiCorpos usados ​​para visualizar neurônios e músculos. NOTA: A fixação de PFA deve ser usada se as tags de proteínas fluorescentes, como Green Fluorescent Protein (GFP), devem ser visualizadas, pois o fixador de Bouin pode ser muito severo. </li><li> Execute a imunofluorescência, que foi descrita anteriormente 11 , 13 , 16 , para marcar simultaneamente neurônios motores pré-sinápticos e dobras pós-sinápticas adjacentes (SSR). Visualize membranas pré-sinápticas e axônios com peroxidase de rábano conjugada fluorescentemente (HRP) (1: 300) 17 e as zonas ativas podem ser coradas usando um anticorpo anti-Bruchpilot (Brp) (nc82; 1: 100; Developmental Studies Hybridoma Bank). Simultaneamente, rotine os músculos pós-sinápticos com um anticorpo anti-Dics Large (Dlg) (1: 10.000). 18 </li><li> Execute um ensaio estabelecido para quantificar a neurodegeneração no NMJ como descrito anteriormente. 8 </suP&gt; , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Em breve, visualize simultaneamente NMJs individuais para compartimentos pré e pós-sinápticos. Qualquer coisa marcada com marcadores pós-sinápticos, mas não marcadores pré-sinápticos, indica sites de neurodegeneração ( Figura 1 ). O número médio de boutons por NMJ, bem como o número médio de NMJs por animal pode ser quantificado. </li></ol>

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H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuronal+injury+follows+a+temporal+sequence+of+cellular+events+leading+to+degeneration+at+the+neuromuscular+junction.">Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction.</a> J Exp Neurosci. 9, 1-9 (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+apple+juice-agar+plates.">Drosophila apple juice-agar plates.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2011).</li><li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. 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(50), (2011).</li><li>Jan, L., Jan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+horseradish+peroxidase+as+specific+neuronal+markers+in+Drosophila+and+in+grasshopper+embryos.">Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).</li><li>Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+tumor+suppressor+gene+dlg+is+required+for+normal+synaptic+bouton+structure.">The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure.</a> Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).</li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

A lesão mecânica neuronal descrita anteriormente e demonstrada aqui pode ser utilizada para induzir lesão / estresse nos nervos segmentares das larvas de Drosophila . 4 , 5 , 6 , 14 Esta técnica experimental tem sido empregada anteriormente para dissecar a seqüência temporal de eventos que conduzem à neurodegeneração, bem como para examinar as alterações transcricionais nos corpos celulares do neurônio motor após a lesão. 5 , 14 Além disso, esta técnica foi descrita em conjunto com chips microfluídicos para observar e estudar degeneração axonal e regeneração em larvas de Drosophila . 7 As limitações desta técnica incluem a morte das larvas devido à punção da cutícula durante a introdução da lesão. No entanto, um grande número de larvas podem ser esmagadas em um shPeríodo de tempo para superar uma alta taxa de mortalidade larval. Uma modificação que incluímos é a lesão do 2º instar ou início da larva do 3º instar, o que é crítico para visualizar a degeneração do neurônio motor no NMJ, que ocorre 24 h após a lesão. Aqui, demonstramos que a lesão mecânica neuronal pode ser utilizada para estudar a degeneração do neurônio motor no NMJ. Utilizamos um método estabelecido para quantificar a neurodegeneração que aproveita o fato de que os neurônios e suas proteínas associadas degeneram mais rapidamente do que o músculo adjacente. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 Para observar e quantificar a neurodegeneração, é fundamental que o NMJ seja manchado simultaneamente tanto para marcadores pré e pós-sinápticos. Aqui, nós dDemonstre o uso do marcador de zona ativa Brp e do marcador de pós-sinápia Dlg, no entanto, há uma infinidade de outros marcadores pré e pós-sinápticos disponíveis que podem ser utilizados para estudar neurodegeneração no NMJ. Além disso, moléculas marcadas com fluorescência de acordo com a escolha podem ser empregadas para estudar seus efeitos durante o processo neurodegenerativo. Existem métodos mais complicados para estudar a degeneração após uma lesão axonal, como a microfluídica 7 , no entanto, nosso método possui várias vantagens: 1) é muito barato, 2) a maioria dos laboratórios da Drosophila já possui o equipamento necessário e 3) o tecido é fixado de modo que A microscopia convencional de fluorescência pode ser usada para quantificar eventos neurodegenerativos após lesão. Nós imaginamos que este protocolo pode ser adaptado para examinar uma ampla gama de mecanismos celulares e moleculares relacionados à neurodegeneração após lesão. Em particular, esses métodos poderiam ser usados ​​para examinar o behAvior de qualquer proteína com marcação fluorescente antes e depois da lesão neuronal e degeneração e regeneração do neurônio motor.

A degeneração neuronal ocorre durante o desenvolvimento normal e pode ser causada pelo processo de envelhecimento natural, lesão, estresse ou estados de doença. Drosophila melanogaster , a mosca comum da fruta, fornece um organismo modelo simples e poderoso para estudar a neurodegeneração devido às semelhanças notáveis ​​nos mecanismos moleculares que conduzem à degeneração dos neurônios. Essas semelhanças são destacadas pelo fato de que aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila . 1 Além disso, vários ensaios e ferramentas tecnológicas para estudar doenças neurodegenerativas humanas foram desenvolvidos e utilizados em Drosophila . 2 , 3 Dentro da Drosophila , a junção neuromuscular (NMJ) permite a análise de propriedades celulares e eletrofisiológicas e provou ser um sistema importante para estudar doença neuromuscular devido ao visível nConexões euron-músculo. 2 Neste estudo, descrevemos um ensaio de lesão de neurônio in vivo em larvas de Drosophila que permite a lesão reprodutível dos nervos segmentares. Esta lesão do motoneurão resulta em uma seqüência temporal de eventos celulares, resultando em neurodegeneração na lesão NMJ 24 h pós. A capacidade de reproduzir os motoneurônios lesionados resultando em neurodegeneração tem diversas aplicações, como a identificação de genes específicos necessários para o processo degenerativo, a dissecação de respostas transcripcionais à lesão neuronal e a análise de cascatas de sinalização protetora. 4 , 5 , 6 Este método também foi usado em combinação com microfluidics para estudar degeneração neuronal e regeneração em animais vivos. 7 Utilizamos um ensaio quantitativo estabelecido para examinar o degenerato do neurônio motorIon na Drosophila NMJ após lesão mecânica. Este ensaio baseia-se no facto de a perda de membrana pré-sináptica e as proteínas precedem a desmontagem do retículo subsináptico (SSR) caracterizada pelas dobras da membrana do músculo pós-sináptico. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Este ensaio permite a quantificação de &quot;pegadas sinápticas&quot; onde o neurônio pré-sináptico perdeu a conexão com o músculo pós-sináptico adjacente. O processo degenerativo mostrou ser progressivo em todo o desenvolvimento larval 12 e não pode ser explicado pelo desenvolvimento alterado de sinapse ou brotação. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 O anúncioA vantagem de usar lesões mecânicas em mutações preexistentes é que permite a dissecção da seqüência temporal de eventos celulares que conduzem à neurodegeneração no NMJ. 13

<table><tbody><tr><td>Micro-dissecting scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Some people prefer size 3, while others prefer size 5</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Air Tank</td><td>Tech Air</td><td>UN 1013</td><td>Various tank sizes can be purchased</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Anesthetizing Apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Stainless-steel pins, size 0.1</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>SylGard 184 Silicone Elastomer, Base and Curing Agent</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>To pour dissecting plates</td></tr><tr><td>Bouin&#039;s Solution</td><td>Sigma</td><td>HT 10132-1L</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde (PFA) in Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Affymetrix</td><td>FLY-8030-20</td><td>Antibodies should be tested for their efficiency in Bouin&#039;s and PFA</td></tr><tr><td>Dissecting Stereo MIcroscope</td><td>AmScope</td><td>SM-1BZ</td><td></td></tr><tr><td>Light Source</td><td>AmScope</td><td>HL150-AY-220V</td><td></td></tr><tr><td>anti- nc82 antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>nc82-s</td><td></td></tr><tr><td>anti-discs large antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>AF3</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor anti-horseradish peroxidase</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>123-545-021; 123-585-021; 123-605-021</td><td>One can you Alexa Fluor&amp;reg; 488, 594 or 647</td></tr><tr><td>Flystuff Grape Juice Agar Premix</td><td>Genesee Scientific</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-101</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-87</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Utility Box</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-484C</td><td>Used to create humid chamber for larval recovery</td></tr></tbody></table>

a simple neuronal mechanical injury methodology to study drosophila motor neuron degeneration

A degeneração dos neurônios ocorre durante o desenvolvimento normal e em resposta a lesões, estresse e doença. As características celulares da degeneração neuronal são notavelmente semelhantes em humanos e invertebrados, assim como os mecanismos moleculares que conduzem esses processos. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster , fornece um organismo modelo genético poderoso e simples para estudar as complexidades celulares das doenças neurodegenerativas. Na verdade, aproximadamente 70% dos genes humanos associados à doença possuem um homólogo de Drosophila e uma infinidade de ferramentas e ensaios foram descritos usando moscas para estudar doenças neurodegenerativas humanas. Mais especificamente, a junção neuromuscular (NMJ) em Drosophila provou ser um sistema eficaz para estudar doenças neuromusculares devido à capacidade de analisar as conexões estruturais entre o neurônio e o músculo. Aqui, relatamos um teste de lesão do neurônio motor in vivo em Drosophila , queInduz de forma reprodutiva neurodegeneração no NMJ por 24 h. Usando essa metodologia, descrevemos uma seqüência temporal de eventos celulares resultando em degeneração de neurônio motor. O método de lesão tem diversas aplicações e também foi utilizado para identificar genes específicos necessários para a neurodegeneração e para dissecar as respostas transcricionais à lesão neuronal.

Usando o procedimento apresentado aqui, demonstramos que a lesão neuronal mecânica permite a dissecção temporal de eventos neurodegenerativos. 14 , 18 A sequência de eventos foi previamente caracterizada e começa com uma ruptura imediata do citoesqueleto, seguida de defeitos de tráfico axonais, acumulação de proteínas ubiquitinadas e posterior neurodegeneração 24 h pós-lesão. Antes da lesão, WT NMJ mostra o marcador de zona activa pré-sináptica Brp na aposição no marcador pós-sináptico Dlg ao longo de todo o NMJ ( Figura 1A ). A lesão mecânica dos nervos segmentares pode induzir a neurodegeneração moderada a grave em que os boutons corados com Dlg agora não possuem a proteína da zona activa pré-sináptica Brp ( Figura 1B ). Qualquer botão que é manchado com Dlg mas que não possui coloração de Brp é considerado um &quot;synPegada aptica &quot;e pode ser contado e quantificado como um evento neurodegenerativo. Tanto a freqüência como a gravidade do fenótipo neurodegenerativo podem ser quantificadas como descrito anteriormente. 11 <img alt="figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56128/56128fig1.jpg" /> Figura 1: lesão neuronal mecânica induz a neurodegeneração no NMJ do músculo 6/7. ( A ) NMJ não lesionados mostram o marcador de zona ativa pré-sináptica, Brp (verde) na aposição com o marcador pós-sináptico, Dlg (vermelho) ao longo de todo o NMJ. ( B ) Lesões mecânicas neuronais induzem a neurodegeneração indicada por boutons sintadas com Dlg (vermelho) com a perda de Brp. Arrowheads indicam sites individuais de neurodegeneração. Barra de escala = 10 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56128/56128fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior de</a>esta figura.

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A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Aqui, descrevemos um método simples e amplamente acessível para ferir nervos segmentares em larvas de Drosophila para visualizar e quantificar neurodegeneração de neurônios motores na junção neuromuscular (NMJ) de larvas de terceiro estádio.

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneração do Neurônio do Motor

The degeneration of neurons occurs during normal development and in response to injury, stress, and disease. The cellular hallmarks of neuronal ...

a-simple-neuronal-mechanical-injury-methodology-to-study-drosophila

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

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Vídeo: A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Bioengenharia

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Neurociência

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an embryonic fillet preparation by a microinjector. Each motor neuron whose membrane is contacted by the droplet can then be rapidly labeled. Individual motor neurons are continuously labeled, enabling fine structural details to be clearly visualized. Given that lipophilic dyes come in various colors, the technique also provides a means to get adjacent neurons labeled in multicolor. This tracing technique is therefore useful for studying neuronal morphogenesis and synaptic connectivity in the motor neuron system of Drosophila.

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We describe a method for retrograde tracing of the Drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Biologia do Desenvolvimento

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health worldwide. Although mammalian models have provided important insights into the underlying mechanisms of pathogenicity, the complexity of mammalian systems together with their high costs are limiting their use. Therefore, the simple but well-established Drosophila model-system&#160;provides an alternative for investigating the molecular pathways that are affected in these diseases. Besides behavioral deficits, neurodegenerative diseases are characterized by histological phenotypes such as neuronal death and axonopathy. To quantify neuronal degeneration and to determine how it is affected by genetic and environmental factors, we use a histological approach that is based on measuring the vacuoles in adult fly brains. To minimize the effects of systematic error and to directly compare sections from control and experimental flies in one preparation, we use the &#39;collar&#39; method for paraffin sections. Neurodegeneration is then assessed by measuring the size and/or number of vacuoles that have developed in the fly brain. This can either be done by focusing on a specific region of interest or by analyzing the entire brain by obtaining serial sections that span the complete head. Therefore, this method allows one to measure not only severe degeneration but also relatively mild phenotypes that are only detectable in a few sections, as occurs during normal aging.

Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila

Drosophila is widely used as a model system to study neurodegeneration. This protocol describes a method by which degeneration, as determined by vacuole formation in the brain, can be quantified. It also minimizes effects due to the experimental procedure by processing and sectioning control and experimental flies as one sample.

Mass Histologia para quantificar neurodegeneração em<em&gt; Drosophila</em

Progressive neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease (AD) or Parkinson&#39;s disease (PD) are an increasing threat to human health ...

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Avaliação morfológica e funcional de Axons e suas sinapses durante a morte de Axon em Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused on neuromuscular junctions (NMJs) in Drosophila larvae, assessing synaptic integrity in adult Drosophila has received much less attention. Here we provide a straightforward method for dissection of the dorsal longitudinal muscles (DLMs), which are required for flight ability. In addition to flight as a behavioral readout, this dissection allows for the both DLM synapses and muscle tissue to be amenable to structural analysis using fluorescently labeled antibodies for synaptic markers or proteins of interest. This protocol allows for the evaluation of the structural integrity of synapses in adult Drosophila during aging to model the progressive, age-dependent nature of most neurodegenerative diseases.

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

The goal of this procedure is to dissect the dorsal longitudinal muscle (DLM) tissue to assess the structural integrity of DLM neuromuscular junctions (NMJs) in neurodegenerative disease models using Drosophila melanogaster.

Visualização da Degeneração Sináptica em Drosophila Adulta em Associação com Neurodegeneração

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

Assessing the Structural Integrity of the Dorsal Longitudinal Muscle Neuromuscular Junctions in Drosophila

Source: Sidisky, J. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/61363">Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a protocol for assessing the structural integrity of neuromuscular junctions in the dorsal longitudinal muscles of Drosophila. The procedure involves staining neurons and muscles with two distinct antibodies and comparing fluorescence patterns between mutant and wild-type flies. A reduction in neuronal staining in mutant flies indicates neurodegeneration, while the muscle structure remains intact.

Avaliação da integridade estrutural das junções neuromusculares do músculo longitudinal dorsal em Drosophila

1. Flash freezing and thorax bisection

	Before beginning the bisections, fill a Dewar flask with liquid nitrogen wearing proper cryo-protective gloves ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neuromuscular Disorders

Two-Photon Laser-Induced Neural Injury: A Method to Observe Axon Degeneration and Regeneration in Drosophila Larvae

Source: Li, D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/57557/" target="_blank">A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System</a>. J. Vis. Exp. (2018).
This video describes two-photon laser ablation of axons in a Drosophila melanogaster larva and an example protocol to induce injury and image the injury site.

Lesão neural induzida por laser de dois fótons: um método para observar a degeneração e regeneração do axônio em larvas de Drosophila

Source: Li, D., et al. A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System. J. Vis. Exp. 
...

Biologia

Drosophila melanogaster (mosca da fruta)

Larva

Mechanically Injuring Drosophila Larvae Segmental Nerves to Induce Neurodegeneration

Source: Danella, E. B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56128">A Simple Neuronal Mechanical Injury Methodology to Study Drosophila Motor Neuron Degeneration.</a> J. Vis. Exp. (2017).
The video demonstrates inducing neurodegeneration in Drosophila larva segmental nerves via mechanical injury. The ventral cuticle of anesthetized larvae is pinched using forceps to cause injury to the segmental nerves. The injured larvae are maintained with food, allowing the injury to cause degeneration of the motor neurons in the nerves, causing disruption of their neuromuscular junctions (NMJs).

Lesão mecânica de nervos segmentares de larvas de Drosophila para induzir neurodegeneração

1. Preparation of Reagents and Equipment 

	Prepare 1x Dissection Buffer (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0.02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM sucrose, ...

Uma Metodologia de Lesão Mecânica Neuronal Simples para Estudar

Resumo

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Capítulos neste vídeo

O uso de chips microfluídicos para Imagens ao vivo e estudo das respostas Lesão em

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em