Los autores desean agradecer a los miembros del grupo de genómica traslacional y Kathryn J Hanson para el feed-back y las mejoras de este protocolo. Este proyecto fue realizado con la beca de investigación SAF2015-64500-R, que incluye fondos europeos de Desarrollo Regional, otorgado a R.A por el Ministerio de Economia y Competitividad.

1. fijación y embebido de resina
<ol><li>Anestesiar las moscas con dióxido de carbono (CO2) o a través de hipotermia usando un bloque de hielo. Utilice un microscopio de disección (con ampliación baja para ver la marcha entera) y las tijeras para quitar las patas, alas, cabeza y la parte terminal del abdomen para facilitar la penetración del fijador. El tratamiento cuidadoso de los cadáveres es necesario en este paso para evitar la deformación del tórax. Nota: Comience con al menos 12 moscas por genotipo para asegurar un número suficiente de individuos correctamente procesados al final del procedimiento.</li>
	<li>Traslado de los cadáveres a un tubo de 1,5 mL en hielo (colocación de un máximo de 6 personas por tubo) que contiene 200 μL de solución 1. Nota: Las canales no pueden permanecer en la solución 1 durante más de 20 minutos.<ol>
<li>Solución 1, mezclar los componentes en las proporciones de volumen: ¼ paraformaldehído al 4%, glutaraldehído 8% ¼, ¼ 0,2 M de Na2HPO4 y ¼ 0,2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 30 minutos.<ol>
<li>Solución 2: Solución de mezcla 1 y OsO4 en una proporción de 1:1 (v/v). PRECAUCIÓN: OsO4 es extremadamente tóxico. Manipular en una campana de humos con medidas adecuadas de seguridad y disposición.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar todo el líquido. Añadir 200 μL de solución 2 e incubar en hielo durante 1-2 h.</li>
	<li>Retirar la solución y deshidratan las muestras a través de una serie gradual de etanol como sigue: una vez en 30%, 50%, 70%, 90% y dos veces en etanol absoluto; 5 minutos cada uno. Añadir 1 mL de etanol para cubrir las muestras. Nota: Una vez que el tejido se coloca en etanol al 90%, los pasos posteriores pueden realizarse a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar las muestras dos veces en óxido de propileno por 10 min cada incubación. PRECAUCIÓN: El óxido de propileno es tóxico, utilizarlo en una campana de humos.</li>
	<li>Sustituir el óxido de propileno por una mezcla de 1:1 (v/v) de epoxy resina y propileno óxido e incubar a temperatura ambiente durante la noche. PRECAUCIÓN: La resina es extremadamente tóxica en estado líquido. La resina está disponible como un conjunto de cuatro componentes (A, B, C y D).<ol>
<li>Para la resina de epoxy, agregue en un vaso desechable de 54 g de resina (A), 44,5 g de catalizador (B), 2,5 g de acelerador (C) y 10 g de plastificante (D). Combinar todos los componentes de la resina en una campana de humos. Almacenar la resina en alícuotas a-20 ° C (hasta 6 meses) o a-80 ° C (varios años).</li>
		<li>Para descartar la resina, la Hornee a 70 ° C por 24 h porque resina sólida no es tóxica. Deseche todas las soluciones anteriores en el grupo de los metales pesados según los procedimientos internacionales apropiados, porque las soluciones pueden contener rastros de OsO4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a colocar la mezcla anterior con resina 100% e incubar las muestras durante 4 horas.</li>
	<li>Traslado de los cadáveres para moldes de plástico conteniendo resina nuevo (un canal en cada pozo del molde). Utilizar un palo de madera afilado o una aguja de transferencia y orientar los cadáveres en los pozos y dejar la resina para polimerizar durante la noche en un horno de Pasteur a 70 ° C. Nota: Para asegurar la orientación apropiada de los cadáveres para el posterior corte y seccionamiento, los cadáveres deben estar acostado sobre su lado largo, con la parte anterior de la canal muy cerca del borde del pozo.</li>
</ol>2. corte y seccionamiento de bloques
<ol><li>Retire los bloques de resina polimerizada de los moldes. Utilice hojas de afeitar recorte la resina, una forma trapezoidal que rodean el cadáver y dar orientación apropiada en el micrótomo. Inicio secciones todos los cadáveres después de la sutura transversal para obtener resultados comparables. Nota: La sección debe ser perpendicular al eje anteroposterior de las DLMs para cortar correctamente la muestra ( figura 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Figura 3 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina de la distrofia Myotonic modelo moscas. En (A), el ajuste de la muestra no era correcto que la sección en la parte dorsal derecha de la imagen no era totalmente transversal a los músculos. Como consecuencia, los paquetes de tres del músculo en la parte superior derecha parecen más grandes que los de la izquierda. Este error daría lugar a una sobreestimación de la zona muscular. (B) sección de un bloque de resina correctamente ajustado. Barra de escala: 200 μm.
<ol><li>Corte 1.5 μm secciones gruesas con un ultramicrótomo y transferir las secciones en gotas de agua sobre diapositivas gelatinizados.<ol>
<li>Obtener las secciones del segmento mesothorax para todas las muestras obtener resultados comparables.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las diapositivas que contienen las secciones de un bloque de calentamiento a 70-80 ° C hasta que se evapore el H2O. En este punto, se observan las muestras con el OsO4 contraste (Figura 4A).</li>
</ol>3. tinción de secciones IFM
<ol><li>Cubrir las secciones con suficiente toluidina azul de aproximadamente 30 s en el bloque de calefacción.<ol>
<li>Solución de azul de toluidina, disolver el 1% de azul de toluidina y el 1% de borax en H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjuague con H2O y deja el portaobjetos sobre una placa caliente para evaporar el agua. Repetir la tinción con toluidina azul si el contraste debe ser mejorada (Figura 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Figura 4 . Secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina con diferente contraste los stainings. Ambos paneles muestran imágenes de DM1 modelo moscas alimentados con Abp1 como en la Figura 2D. (A) imagen de una sección del OsO4 contraste. (B) corte teñido con toluidina azul permite mejor visualización de los haces musculares. Barra de escala: 200 μm.
4. montaje de secciones IFM
<ol><li>Seque el portaobjetos con el bloque calefactor hasta que se evapore el H2O.</li>
	<li>Poner 1 o 2 gotas de medio de montaje en las secciones y poner en un cubreobjetos. PRECAUCIÓN: Realizar este paso en una campana de humos porque el medio de montaje es tóxico.</li>
</ol>5. adquisición de imágenes y la cuantificación del área del músculo del
<ol><li>Tomar las imágenes en baja magnificación para que todo el conjunto de músculos DLM está en foco. Normalmente usamos 10 X.<ol>
<li>Para el análisis estadístico de al menos 5 imágenes seriales por mosca y analizar por lo menos 5 moscas por grupo experimental.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione la imagen que contiene los músculos enteros (figura 5A). Revise el eje o la orientación de la sección y deseche las muestras con orientación inadecuada, lo que distorsionaría los resultados (Comparar figuras 3A / 3B distinguir entre mal y bien orientada, respectivamente).</li>
	<li>Utilice el software ImageJ para seleccionar un área (en píxeles) que contiene sólo el DLMs (figura 5A/5B). Para la comparación entre los diferentes grupos experimentales, el área de referencia a utilizarse sería siempre la mosca con los músculos más grandes. En todas las imágenes de los diferentes genotipos para comparar, seleccione un área que contiene DLMs de iguales dimensiones a la zona de referencia (figura 5B).</li>
	<li>Binarize las imágenes con el comando Image-J: Proceso/binario/hace binario y eliminar las áreas o píxeles que no corresponden a los músculos de interés (figura 5).<ol>
<li>En el caso que artefactual puntos negros aparecen en áreas distintas de músculo, borrar con el comando herramientas de dibujo y seleccione el símbolo de la goma de borrar.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Figura 5 . Procedimiento de análisis para la determinación de área muscular de la imagen. (A) sección transversal del modelo de la distrofia miotónica tipo 1 volar el tórax con un rectángulo que contiene el DLM. (B) área seleccionada con sólo los músculos de vuelo indirectos y el intestino (*). (C) Binarized imagen. Las áreas negras corresponden a los músculos de interés. El intestino ha sido borrado para una cuantificación exacta del área del músculo. Barra de escala: 200 μm.
<ol start="5"><li>Cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) con el comando total: Análisis y medición y seleccione la opción fracción de área. Este porcentaje de la superficie es una estimación de la masa muscular de DLM de cada mosca.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Se ha demostrado que la Drosophila melanogaster es un modelo útil para estudiar enfermedades neuromusculares humanas7,10,11, incluyendo distrofias miotónica, que se caracterizan por la aparición de atrofia muscular. El protocolo presentado aquí es una herramienta útil para la cuantificación de la degeneración muscular causada por la aparición o progresión de una enfermedad particular en un modelo de mosca. Por ...

El tórax de la mosca de la fruta contiene dos clases diferentes de los músculos de vuelo, que son funcionalmente, fisiológicamente y anatómicamente distintas. Estos músculos son: controlan de los músculos de vuelo indirectos (IFM), que se componen de dorso-longitudinales (DLM) y los músculos dorso-ventral (DVM) (figura 1) y el vuelo síncrono músculos1,2. Juntos, estos músculos generan la elevada potencia mecánica requerida para el vuelo. El tamaño, distribución y disposición rostro caudal de las IFMs permiten una fácil orientación para seccionamiento transversal3 (figura 2A). Por esta razón, hemos seleccionado estos músculos para el estudio de la atrofia muscular en Drosophila melanogaster.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Figura 1. Diagrama del tórax de la mosca de la fruta que muestra los músculos de vuelo indirectos (IFMs) arreglo. (Izquierda) representa una visión lateral y (derecha) representa un corte transversal del tórax. El IFMs se componen de los músculos Dorso-longitudinales (DLM) (en rojo) y Dorso-ventral (DVM) de los músculos (en verde).
Preservación de la estructura del tejido y el control sobre la orientación del eje dorso-ventral de las secciones histológicas son críticos para garantizar la correcta evaluación de área transversal del músculo. Para preservar la estructura muscular se utilizó una mezcla de fijación modificada de Tomlinson et al. 4 . Por otra parte, porque los músculos son los tejidos internos, la impermeabilidad del exoesqueleto de Drosophilaes un problema como fijación mezclas no pueden penetrar a los tejidos de destino. Para evitar este problema, hemos eliminado la cabeza volar, patas, alas y los dos últimos segmentos del abdomen para crear agujeros que permiten la mezcla de fijación entrar. Como parte del Protocolo de fijación que se incluyeron tratamiento con tetróxido de osmio (OsO4)5, que utiliza extensivamente debido a su capacidad para fijar las grasas, incluyendo triglicéridos. OsO4 conserva la mayoría de las estructuras muy bien, especialmente a nivel citológico y al mismo tiempo proporciona contraste a la imagen. Después de la fijación, Drosophila toracico fueron embebida en resina para transversal semi-delgadas seccionamiento (1,5 μm). Para mejor contraste, tejido puede ser además teñido con toluidina azul. Imágenes de toracico completo se tomaron 10 X y área del músculo se cuantificó por binarizing imágenes (de dimensiones iguales) y cuantificar el porcentaje de píxeles correspondiente a tejido muscular (pixeles negros) de total, con el software ImageJ.
Modificaciones en las mezclas de preparación y fijación de tejidos, como el aumento de la concentración de OsO4 glutaraldehído solución, en este protocolo, permitieron la única preservación del tejido muscular. Esto es porque el protocolo evita la degradación y deformación del tejido, haciendo el análisis posterior de las muestras más confiable incluso en condiciones altamente atróficas asociadas a enfermedades degenerativas NEUROMUSCULARES como la distrofia miotónica (DM). En su forma más común, DM tipo 1, este trastorno genético poco común es provocada por repeticiones CUG ampliadas en las transcripciones de la proteína quinasa de distrofia miotónica (DMPK). Agregados de ARN mutante de DMPK focos de ribonuclear de forma que secuestran las proteínas de unión a RNA nucleares Muscleblind-como (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) en Drosophila)6. Hemos generado un modelo de Drosophila de la distrofia Myotonic expresando 250 repeticiones CTG en el promotor de la cadena pesada de miosina muscular (Mhc-Gal4). Moscas modelo eran incapaces de volar con un fenotipo típico 'celebró hasta las alas' y tenían graves musculares atrofia en sus IFMs (figura 2B). Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la determinación de la zona muscular de IFMs es un método fiable para cuantificar los efectos de diferentes modificadores químicos o genéticos de la atrofia muscular en estas moscas modelo del7. Por ejemplo, la sobreexpresión de la isoforma de la Mbl C en moscas expresando la CTG 250 repeticiones en el músculo, consigue un rescate del área del músculo, como agotamiento de Mbl por secuestro es el factor desencadenante en la patogenesia de DM18 (figura 2). Área del músculo también fue rescatado después de alimentar el modelo DM vuela con Abp1, un hexapéptido con anti-DM1 probada actividad9 (Figura 2D).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Figura 2. Cuantificación de secciones dorsoventral de toracico adulto embebido en resina. Los músculos de vuelo indirectos (A-d) de Drosophila melanogaster con los genotipos correspondientes indicados. (A) control de moscas (PA). (B) expresión de 250 CTG no codificante se repite en el músculo (UAS-CTG(250)x) provocó una reducción del área del músculo en el DLMs en comparación con el control de moscas. (C) este fenotipo de atrofia muscular fue rescatado por la sobreexpresión de Muscleblind (MblC) (UAS-CTG (250) x UAS MblC) y (D) alimentación las moscas modelo con hexapéptido Abp1 (UAS-CTG (250) x Abp1). En todas las imágenes el lado dorsal es en la parte superior. Los transgenes fueron conducidos a los músculos mediante un promotor de la cadena pesada de miosina (Mhc)-Gal4. E cuantificación del porcentaje de área muscular en relación con las moscas de control confirma que las diferencias fueron significativas. El histograma muestra los medios ± SEM **p< 0.01 y * p < 0.05 (prueba de t de Student´s). Barra de escala: 200 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El método aquí registrado serán de interés a los investigadores centrarse en desarrollo muscular, mantenimiento y envejecimiento, patología de la enfermedad y las pruebas de drogas ya que proporciona información confiable sobre cómo el tejido muscular responde a factores endógenos y externos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image-J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ6</td>
			<td>Bright field technique.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision World</td>
			<td>14003</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka (Sigma)</td>
			<td>49624</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>0972A</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resin (Durcupan)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44611-44614</td>
			<td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>251176</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant Medium (DPX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44581</td>
			<td>Dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122507</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>121677</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>3052</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

Masa muscular atrofia, atrofia muscular, es un fenotipo común en modelos de Drosophila de enfermedades neuromusculares. Hemos utilizado los músculos de vuelo indirectos (IFMs) de las moscas, específicamente los músculos dorso-longitudinales (DLM), como el experimental sujeto a medida el fenotipo atrófico provocado por diferentes causas genéticas. En este protocolo, se describe cómo incrustar los músculos tórax mosca para seccionar fino semi, cómo obtener un buen contraste entre el músculo y el tejido circundante y cómo procesar imágenes de microscopio óptico para semiautomática adquisición de datos cuantificables y Análisis. Se describen tres aplicaciones específicas de la tubería metodológica. En primer lugar, mostramos cómo se puede aplicar el método para cuantificar la degeneración del músculo en un modelo de mosca de la distrofia miotónica; en segundo lugar, la medición del área transversal del músculo puede ayudar a identificar genes que promoverán o evitar la atrofia muscular o degeneración muscular; en tercer lugar, este protocolo puede ser aplicado para determinar si un compuesto candidato es capaz de modificar de manera significativa un determinado fenotipo atrófico inducido por una mutación enfermedad-que causano por un disparador ambiental.

Cuantificar si la sobreexpresión de MblC o la administración de Abp1 tenía cualquier efecto en el fenotipo atrófico del modelo mosca distrofia miotónica que nos centramos en el DLMs, que forman parte de IFMs (figura 1). Se determinó que el modelo vuela, que expresan 250 repeticiones CTG no codificante en toda la musculatura por el promotor de la miosina de cadena pesada (Mhc)-Gal4, tuvieron una reducción del 50% del área del músculo en compa...

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Determinación de zona óptica transversal muscular de los músculos de vuelo indirectos adultos de Drosophila Melanogaster

Se presenta un método para cuantificar el área del músculo, que es un método indirecto para determinar la masa muscular en adultos del Drosophila . Demostramos la aplicación de nuestra metodología, analizando el vuelo indirecto los músculos en un modelo de Drosophila de la enfermedad de la distrofia miotónica.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K vistas.  University of Valencia. Se presenta un método para cuantificar el área del músculo, que es un método indirecto para determinar la masa muscular en adultos del Drosophila . Demostramos la aplicación de nuestra metodología, analizando el vuelo indirecto los músculos en un modelo de Drosophila de la enfermedad de la distrofia miotónica.

Video: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Investigación

Biología

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

Vídeo de alta resolución de Seguimiento de la locomoción en adultos de Drosophila melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

Seguimiento visual mediada olor durante el vuelo en Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

La disección de Oenocytes de Adultos Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

El aislamiento de Drosophila melanogaster Testículos

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

Inyección de insulina y extracción hemolinfa para medir la sensibilidad a la insulina en adultos Drosophila melanogaster</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Evaluación ex vivo de la contractilidad, fatigabilidad y alternancia en aislados músculos esqueléticos

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Medición de la esperanza de vida en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

El mantenimiento de una<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Jaula Población

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...