著者は、このプロトコルのフィードバックと改善の並進のゲノム グループとキャスリン J ハンソンのメンバーに感謝したいと思います。このプロジェクトは研究助成金 SAF2015-64500-R、ヨーロッパ地域開発資金、Ministerio デ エコノミア y Competitividad R.A に授与を含むとを行った。

1. 固定と樹脂埋め込み
<ol><li>二酸化炭素 (CO2) もしくは氷ブロックを使用して低体温症ハエを麻酔します。(全体の飛行を参照する低倍率) と管の内径とはさみを使って、足、翼、頭、固定液の浸透を促進する腹部の末端部を外します。死体の処理は、胸郭の変形を避けるためにこのステップで必要な注意してください。 注意: 手順の最後で適切に処理された個人の十分な数を確保する遺伝子型あたりの少なくとも 12 のハエから始まります。</li>
	<li>ソリューション 1 の氷 (チューブあたり 6 人の最大を置く) 含む 200 μ L に 1.5 mL チューブに死体を転送します。 注: 死体は、20 分以上解決策 1 で残ることができません。<ol>
<li>解決策 1、これらのボリュームの割合でコンポーネントを混在させる: ¼ 0.2 M NaH2PO4¼ 0.2 M Na2HPO4 8% グルタルアルデヒドの ¼ ¼ 4% パラホルムアルデヒド。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューション 2 の 200 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。<ol>
<li>解決策 2: は、解決策 1 と 1:1 (v/v) の割合で OsO4を混ぜます。 注意: OsO4は非常に有毒です。適切な安全対策と発煙のフードを操作します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての液体を削除します。解決策 2 を 200 μ l 添加し、1-2 時間の氷の上を孵化させなさい。</li>
	<li>ソリューションを削除して、傾斜エタノール シリーズを通してサンプルを次のように脱水: 一度で 30%、50%、70%、90%、2 回で絶対エタノール;5 分ごと。サンプルをカバーするエタノール 1 mL を追加します。 注: 組織は 90% エタノールで配置されると、後続の手順は室温で実行できます。</li>
	<li>各インキュベーション 2 回 10 分のプロピレンの酸化物のサンプルをインキュベートします。 注意: プロピレンの酸化物は有毒、発煙のフードで使用します。</li>
	<li>1:1 (v/v) エポキシ樹脂及びプロピレンの酸化物の混合物で酸化プロピレンを交換し、一晩室温で孵化させなさい。 注意: 樹脂は、液体状態非常に有毒です。樹脂 (A、B、C、D) の 4 つのコンポーネントのセットとして提供されます。<ol>
<li>エポキシ樹脂、追加使い捨てビーカーの樹脂 (A)、硬化剤の 44.5 g 54 g で 2.5 g 加速器の (C) と 10 g の可塑剤の (B) (D)。発煙のフードのすべての樹脂部品を組み合わせます。(6 ヶ月) のための-20 ° c または-80 ° c (数年) の因数で樹脂を格納します。</li>
		<li>樹脂を破棄するには、固体樹脂は有害ではないので 24 h 70 ° C で焼きます。ソリューションは、OsO の痕跡を含めることができますので、適切な国際手続に従って重金属グループのすべての以前のソリューションを破棄4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 樹脂で以前の混合物を交換し、4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>新しい樹脂 (金型の各ウェルで 1 つ死体) を含むプラスチック金型に死体を転送します。削った木の棒や針を使用して転送、井戸に死体を方向づけるし、一晩パスツール オーブン 70 ° C で重合する樹脂のまま 注: 臼歯トリミングとセクショニングの死体の適切な向きを確保するため、死体で横たわるべき彼らの長い側に井戸の端に近い非常に枝肉の前部で。</li>
</ol>2. トリミングとブロックの断面
<ol><li>金型から重合樹脂ブロックを削除します。かみそりの刃を使用して、樹脂をトリムし、死体を取り巻く台形形状を形成するミクロトームで適切な方向を与えます。匹敵する結果を得るため横縫合後すべての死体をセクショニングを開始します。 注: セクションは、サンプルを正しくトリムする DLMs の前後軸に垂直でなければなりません (図 3)。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> 図 3.筋強直性ジストロフィーの大人 thoraces を樹脂包埋の卵割セクション モデル ハエ。(A) 試料のトリミングは画像右背側部のセクションは完全に筋肉に横なかった正しいでした。結果として、上部右側にある 3 つの筋束は左サイドのものよりも大きく見えます。この間違いは、筋面積の過大評価になります。(B) 正しくトリム樹脂ブロックの断面。スケール バー: 200 μ m。
<ol><li>1.5 μ m、ウルトラミクロトームと分厚い部分をカットし、糊のスライドにわたって水滴にセクションを転送します。<ol>
<li>匹敵する結果を取得するすべてのサンプルの mesothorax セグメントからセクションを取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O が蒸発するまでに 70-80 ° C で加熱ブロックのセクションを含むスライドを配置します。この時点で、サンプルは、OsO4コントラスト (図 4 a) で観察できます。</li>
</ol>3. IFM セクションを汚す
<ol><li>十分なトルイジン ブルー約 30 のセクションをカバー暖房のブロックの s。<ol>
<li>トルイジン ブルー ソリューション、トルイジン ブルーの 1%、H2o. のホウ砂の 1% を解散します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O で洗浄し、水を蒸発する暖かいプレートにスライドを残します。染色トルイジン ブルー コントラストをする必要がある場合を繰り返します (図 4 b) を強化します。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> 図 4.異なるコントラスト染色と大人の thoraces を樹脂包埋の卵割セクション。両方のパネルは、DM1 モデル ハエ Abp1図 2Dのようにうんざりの画像を表示します。(A) OsO4コントラストを持つセクションのイメージ。(B) セクションとトルイジン ブルー染色により筋の筋束のより良い視覚化できます。スケール バー: 200 μ m。
4. 取り付け IFM セクション
<ol><li>H2O が蒸発するまで加熱ブロック スライドを乾燥します。</li>
	<li>セクションにメディアをマウントの 1 または 2 滴を入れて、上を置きます。 注意: は、メディアをマウントは有毒であるため発煙のフードでこの手順を実行します。</li>
</ol>5. 画像と筋肉領域の定量化の取得
<ol><li>DLM 筋肉のセット全体がフォーカスになるよう低倍率で画像を撮影します。我々 は通常、10 X を使用します。<ol>
<li>統計分析のためフライあたり少なくとも 5 連続画像を撮影し、, 実験群あたり少なくとも 5 ハエを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全身の筋肉群 (図 5 a) を含むイメージを選択します。軸またはセクションの向きを確認し、結果を歪める不適切な方向にサンプルを破棄 (図 3 a を比較/ひどく区別する 3 b と配向のセクション、それぞれ)。</li>
	<li>DLMs (図 5 a/5B) のみを含むピクセル単位で領域を選択するのに ImageJ ソフトウェアを使用します。使用する参照領域には異なる実験群間比較のため最大筋肉とフライ常でしょう。比較する異なる遺伝子型のすべての画像では、参照領域 (図 5 b) に等しい大きさの DLMs を含む領域を選択します。</li>
	<li>画像 J コマンドで画像を 2 値化する:プロセス/バイナリ/作るバイナリ分野や関心 (図 5) の筋肉に対応しないピクセルを削除します。<ol>
<li>Artefactual 黒い斑点が筋以外の領域に表示される場合は、描画ツールのコマンドでそれらを削除し、消しゴムのシンボルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> 図 5.筋肉の領域を決定するための解析手順をイメージします。(A) 横断部筋強直性ジストロフィー 1 型モデルは、DLM を含む四角形で胸部を飛ぶ。(B) 選択したエリアだけ間接飛翔筋と腸 (*)。(C) Binarized 画像。黒の領域は、目的の筋肉に対応します。腸は、筋肉領域の正確な定量化のため消されています。スケール バー: 200 μ m。
<ol start="5"><li>コマンドの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を数値化:分析/計測・面積率オプションを選択します。この領域の割合は、それぞれのフライの DLM 筋肉量の推定です。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

キイロショウジョウバエが人間の神経筋疾患7,10,11の出現によって特徴付けられる筋強直性ジストロフィーの研究に有用なモデルであることが実証されています。筋肉の萎縮。ここで提示されたプロトコルは、発症やフライのモデルの特定の病気の進行による筋変性を定量化するための便利なツールです。たとえば?...

フルーツ フライの胸部には、飛翔筋は機能的、生理的、解剖学的に全く異なる 2 つの異なるクラスが含まれています。これらの筋肉: 間接飛翔筋 (IFM) 背縦 (DLM) や背腹 (DVM) の筋肉 (図 1) と同期のフライトから成る制御筋肉1,2。これらの筋肉は、一緒に飛行のために必要な昇格した機械力を生成します。サイズ、分布との間の吻尾処分横断面3 (図 2 a) の簡単なオリエンテーションを許可します。このため、ショウジョウバエ筋萎縮の研究にこれらの筋肉を選択しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> 図 1。間接飛翔筋 (間) の配置を示すショウジョウバエ胸部の図。(左) は、横方向のビューを表します、(右) は、胸部の断面を表します。(赤) で (DLM) の背の縦筋から成る、間と背腹 (DVM) 筋肉 (緑) で。
保全組織構造と組織学的セクションの背腹軸方向の制御は、筋断面積の適切な評価を確保するために重要です。筋肉の構造を維持するために我々 はトムリンソンらから変更固定混合物を使用4 。また、筋肉は内部組織であるために、混合物は、標的組織を突き通すことができない固定として、ショウジョウバエの外骨格の不浸透性は問題であるとします。この問題を回避するためには、フライの頭、脚、翼、入力する固定混合物を許可する穴を作成する腹部の最後の 2 つのセグメントを削除しました。四酸化オスミウム (OsO4)5脂肪を修正する能力のために広く使用される治療を含めました固定プロトコルの一部としてトリグリセリドを含みます。OsO4は特に細胞レベルで非常によく、ほとんどの構造体を保持、同時にイメージにコントラストを提供しています。固定後、ショウジョウバエの thoraces は、横半薄い断面 (1.5 μ m) 用樹脂に埋め込まれていた。改良されたコントラストの組織汚すことができるさらにトルイジン ブルー。完全な thoraces の画像は、10 X で撮影された、筋面積が (等しい寸法) の画像を二値化すると ImageJ ソフトウェアの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を定量化し, 定量化しました。
このプロトコルの導入、OsO4およびグルタールアルデヒド溶液の濃度の増加として組織化・固定化混合変更は、筋肉組織の独特な保存を許可しました。これは、プロトコルも神経筋変性疾患筋強直性ジストロフィー (DM) などに関連付けられている高度萎縮性条件で試料の事後分析の信頼性を高める、組織の変形と劣化を回避するためです。一般的な形式として、DM のタイプ 1、このまれな遺伝的疾患は、筋強直性ジストロフィー蛋白質キナーゼ(DMPK) 成績証明書の展開の CUG リピートによってもたらされます。突然変異体の DMPK RNA 集計隔離 muscleblind だったような核 RNA 結合蛋白質 (MBNL1-3; フォーム ribonuclear 巣ショウジョウバエの muscleblind だった (Mbl)) の6。筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc Gal4) 250 CTG の繰り返しを表現することにより筋強直性ジストロフィーのショウジョウバエモデルを生成されます。モデル ハエのアップ開催羽' 典型的な表現型と飛べないしていた深刻な筋萎縮の間 (図 2 b)。私たちの研究室で実行前の研究では、間の筋肉領域の決定は、これらモデル ハエ7筋萎縮のさまざまな化学物質や遺伝的修飾キーの効果を定量化する信頼性の高い方法を示しています。例として 250 CTG を表現するハエの C は筋肉で繰り返される Mbl アイソ フォームの発現は、隔離で Mbl 枯渇は DM1 病態8 (図 2) でトリガーの要因として筋地域の救助を達成しました。Abp1、実績のある反 DM1 活動9 (図 2 D) ヘキサペプチドとハエの DM モデルを供給した後が筋面積も助かった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> 図 2。大人の thoraces を樹脂包埋の卵割のセクションの定量化。関連遺伝子多型の指定されたショウジョウバエ(A ~ D) 間接飛翔筋。(A) 制御は飛ぶ (和田) です。(250 以外のコーディング CTG の式 B) を繰り返す筋肉で (UAS-CTG(250)x)コントロール ハエと比較して DLMs の筋面積の減少を引き起こした。(C) この筋萎縮の表現型は muscleblind だった (MblC) の過剰発現によって救出された (UA CTG (250) UAS MblC x) (D) を供給 (UA CTG (250) x Abp1) ヘキサペプチド Abp1 にモデル ハエ。すべての画像では、背側は上です。遺伝子が筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc) を使用してに追い込まれた-Gal4。(E) 定量制御ハエを基準として筋肉の割合の差が認められたことを確認しました。ヒストグラムを示しています意味 ± S.E.M. * *p< 0.01 と * p < 0.05 (Student´s t-テスト)。スケール バー: 200 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ここで報告する方法は、筋肉の発達、メンテナンスと高齢化、病の病理、薬物検査筋肉組織が内因性および外部要因に応答する方法についての信頼できる情報を提供に焦点を当て研究者に興味になります。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Image-J software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica UC6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica MZ6</td>
			<td>Bright field technique.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71970</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>World Precision World</td>
			<td>14003</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedding molds</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70900</td>
			<td>Several alternative providers exist.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Fluka (Sigma)</td>
			<td>49624</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsO4</td>
			<td>Polyscience</td>
			<td>0972A</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propylene oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>82320-250ML</td>
			<td>Extremely toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resin (Durcupan)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44611-44614</td>
			<td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine blue</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>251176</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mountant Medium (DPX)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44581</td>
			<td>Dangerous.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Harmful.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>122507</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>121677</td>
			<td>0.2 M dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borax</td>
			<td>Panreac</td>
			<td>3052</td>
			<td>Toxic.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

筋肉を無駄に、筋萎縮症として知られている神経筋症ショウジョウバエモデルの共通の表現型であります。我々 は異なった遺伝の原因によってもたらされる萎縮性表現型測定対象実験として背縦走筋 (DLM) では、具体的には、ハエの間接飛翔筋 (間) を使用しています。このプロトコルで半薄い断面のフライの胸部筋肉を埋め込む方法、筋と周囲の組織との間の良好なコントラストの入手方法、定量データの半自動獲得のための光学顕微鏡画像を処理する方法を述べると解析。方法論のパイプラインの 3 つの特定のアプリケーションについて述べる。まず、筋強直性ジストロフィー飛ぶモデルで筋変性を定量化する方法を適用する方法を示す第二に、筋断面積の測定を促進または筋萎縮や筋変性を防ぐ遺伝子を識別するために助けることができます。第三に、このプロトコルを適用して、候補化合物が病気を引き起こす突然変異による与えられた萎縮性表現型を大幅に変更することができるかどうかを判断できますまたは環境トリガーによって。

MblC の過剰発現または Abp1 の管理は筋強直性ジストロフィーのフライ モデルの萎縮性の表現型効果をもたらしたかどうかを定量化するには、間 (図 1) の一部である Dlm に着目。我々 はミオシン重鎖プロモーター (Mhc) によって駆動される筋肉全体で 250 以外のコーディング CTG の繰り返しを表現するモデルが飛ぶことを決定-Gal4、いたハエを...

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

キイロショウジョウバエ成虫の間接飛翔筋の光学断面筋決定

ショウジョウバエ大人の筋肉量を決定するための間接的な手法である筋面積を定量化する手法を報告する.筋筋強直性ジストロフィー症ショウジョウバエモデルの間接飛翔を分析することによって私たちの方法論の適用を示します。

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K ビュー.  University of Valencia. ショウジョウバエ大人の筋肉量を決定するための間接的な手法である筋面積を定量化する手法を報告する.筋筋強直性ジストロフィー症ショウジョウバエモデルの間接飛翔を分析することによって私たちの方法論の適用を示します。

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Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

キイロショウジョウバエの幼虫中枢神経系の解剖

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

生物学

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

アダルトキイロショウジョウバエのロコモーションの高解像度のビデオトラッキング

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual stabilization of upwind tracking directly aids in odor tracking. But do olfactory signals directly influence visual tracking behavior independently from wind cues? Additionally, recent advances in olfactory molecular genetics and neurophysiology have motivated novel quantitative behavioral analyses to assess the behavioral influence of (e.g.) genetically inactivating specific olfactory activation circuits. We modified a magnetic tether system originally devised for vision experiments by equipping the arena with narrow laminar flow odor plumes. Here we focus on experiments that can be performed after a fly is tethered and is able to navigate in the magnetic arena. We show how to acquire video images optimized for measuring body angle, how to judge stable odor tracking, and we illustrate two experiments to examine the influence of visual cues on odor tracking.

Here we describe how to optimize the acquired video image for an olfactory magnetic-tether (OMT) apparatus. We also describe two sample experimental protocols for studying visuo-olfactory fusion.

ショウジョウバエのフライトの間に視覚的に仲介臭気の追跡

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

大人からOenocytesの解剖キイロショウジョウバエ</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

の分離キイロショウジョウバエ精巣

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function to maintain glucose homeostasis during developmental larval stages 1,2. Studies on largely post-mitotic adult flies have revealed perturbation of glucose homeostasis as the result of genetic ablation of insulin-like peptide (ILP) producing cells (IPCs) 3. Thus, adult fruit flies hold great promise as a suitable genetic model system for metabolic disorders including type II diabetes. To further develop the fruit fly system, comparable physiological assays used to measure glucose tolerance and insulin sensitivity in mammals must be established. To this end, we have recently described a novel procedure for measuring oral glucose tolerance response in the adult fly and demonstrated the importance of adult IPCs in maintaining glucose homeostasis 4,5. Here, we have modified a previously described procedure for insulin injection 6 and combined it with a novel hemolymph extraction method to measure peripheral insulin sensitivity in the adult fly. Uniquely, our protocol allows direct physiological measurements of the adult fly's ability to dispose of a peripheral glucose load upon insulin injection, a methodology that makes it feasible to characterize insulin signaling mutants and potential interventions affecting glucose tolerance and insulin sensitivity in the adult fly.

Insulin Injection and Hemolymph Extraction to Measure Insulin Sensitivity in Adult Drosophila melanogaster

Conserved insulin signaling pathways found in the fruit fly Drosophila melanogaster make this organism a potential tool for modeling metabolic disorders including type II diabetes. To this end, it is critical to establish physiological assays to effectively measure systemic insulin action in peripheral glucose disposal in the adult fly.

インスリン注射と成人のインスリン感受性を測定する血リンパの抽出キイロショウジョウバエ</em

Conserved nutrient sensing mechanisms exist between mammal and fruit fly where peptides resembling mammalian insulin and glucagon, respectively function ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

のメンテナンス<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;人口ケージ

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...