著者は、このプロトコルのフィードバックと改善の並進のゲノム グループとキャスリン J ハンソンのメンバーに感謝したいと思います。このプロジェクトは研究助成金 SAF2015-64500-R、ヨーロッパ地域開発資金、Ministerio デ エコノミア y Competitividad R.A に授与を含むとを行った。

1. 固定と樹脂埋め込み
<ol><li>二酸化炭素 (CO2) もしくは氷ブロックを使用して低体温症ハエを麻酔します。(全体の飛行を参照する低倍率) と管の内径とはさみを使って、足、翼、頭、固定液の浸透を促進する腹部の末端部を外します。死体の処理は、胸郭の変形を避けるためにこのステップで必要な注意してください。 注意: 手順の最後で適切に処理された個人の十分な数を確保する遺伝子型あたりの少なくとも 12 のハエから始まります。</li>
	<li>ソリューション 1 の氷 (チューブあたり 6 人の最大を置く) 含む 200 μ L に 1.5 mL チューブに死体を転送します。 注: 死体は、20 分以上解決策 1 で残ることができません。<ol>
<li>解決策 1、これらのボリュームの割合でコンポーネントを混在させる: ¼ 0.2 M NaH2PO4¼ 0.2 M Na2HPO4 8% グルタルアルデヒドの ¼ ¼ 4% パラホルムアルデヒド。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ソリューション 2 の 200 μ L を追加し、氷上で 30 分間インキュベートします。<ol>
<li>解決策 2: は、解決策 1 と 1:1 (v/v) の割合で OsO4を混ぜます。 注意: OsO4は非常に有毒です。適切な安全対策と発煙のフードを操作します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>すべての液体を削除します。解決策 2 を 200 μ l 添加し、1-2 時間の氷の上を孵化させなさい。</li>
	<li>ソリューションを削除して、傾斜エタノール シリーズを通してサンプルを次のように脱水: 一度で 30%、50%、70%、90%、2 回で絶対エタノール;5 分ごと。サンプルをカバーするエタノール 1 mL を追加します。 注: 組織は 90% エタノールで配置されると、後続の手順は室温で実行できます。</li>
	<li>各インキュベーション 2 回 10 分のプロピレンの酸化物のサンプルをインキュベートします。 注意: プロピレンの酸化物は有毒、発煙のフードで使用します。</li>
	<li>1:1 (v/v) エポキシ樹脂及びプロピレンの酸化物の混合物で酸化プロピレンを交換し、一晩室温で孵化させなさい。 注意: 樹脂は、液体状態非常に有毒です。樹脂 (A、B、C、D) の 4 つのコンポーネントのセットとして提供されます。<ol>
<li>エポキシ樹脂、追加使い捨てビーカーの樹脂 (A)、硬化剤の 44.5 g 54 g で 2.5 g 加速器の (C) と 10 g の可塑剤の (B) (D)。発煙のフードのすべての樹脂部品を組み合わせます。(6 ヶ月) のための-20 ° c または-80 ° c (数年) の因数で樹脂を格納します。</li>
		<li>樹脂を破棄するには、固体樹脂は有害ではないので 24 h 70 ° C で焼きます。ソリューションは、OsO の痕跡を含めることができますので、適切な国際手続に従って重金属グループのすべての以前のソリューションを破棄4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 樹脂で以前の混合物を交換し、4 時間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>新しい樹脂 (金型の各ウェルで 1 つ死体) を含むプラスチック金型に死体を転送します。削った木の棒や針を使用して転送、井戸に死体を方向づけるし、一晩パスツール オーブン 70 ° C で重合する樹脂のまま 注: 臼歯トリミングとセクショニングの死体の適切な向きを確保するため、死体で横たわるべき彼らの長い側に井戸の端に近い非常に枝肉の前部で。</li>
</ol>2. トリミングとブロックの断面
<ol><li>金型から重合樹脂ブロックを削除します。かみそりの刃を使用して、樹脂をトリムし、死体を取り巻く台形形状を形成するミクロトームで適切な方向を与えます。匹敵する結果を得るため横縫合後すべての死体をセクショニングを開始します。 注: セクションは、サンプルを正しくトリムする DLMs の前後軸に垂直でなければなりません (図 3)。</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> 図 3.筋強直性ジストロフィーの大人 thoraces を樹脂包埋の卵割セクション モデル ハエ。(A) 試料のトリミングは画像右背側部のセクションは完全に筋肉に横なかった正しいでした。結果として、上部右側にある 3 つの筋束は左サイドのものよりも大きく見えます。この間違いは、筋面積の過大評価になります。(B) 正しくトリム樹脂ブロックの断面。スケール バー: 200 μ m。
<ol><li>1.5 μ m、ウルトラミクロトームと分厚い部分をカットし、糊のスライドにわたって水滴にセクションを転送します。<ol>
<li>匹敵する結果を取得するすべてのサンプルの mesothorax セグメントからセクションを取得します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O が蒸発するまでに 70-80 ° C で加熱ブロックのセクションを含むスライドを配置します。この時点で、サンプルは、OsO4コントラスト (図 4 a) で観察できます。</li>
</ol>3. IFM セクションを汚す
<ol><li>十分なトルイジン ブルー約 30 のセクションをカバー暖房のブロックの s。<ol>
<li>トルイジン ブルー ソリューション、トルイジン ブルーの 1%、H2o. のホウ砂の 1% を解散します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O で洗浄し、水を蒸発する暖かいプレートにスライドを残します。染色トルイジン ブルー コントラストをする必要がある場合を繰り返します (図 4 b) を強化します。</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> 図 4.異なるコントラスト染色と大人の thoraces を樹脂包埋の卵割セクション。両方のパネルは、DM1 モデル ハエ Abp1図 2Dのようにうんざりの画像を表示します。(A) OsO4コントラストを持つセクションのイメージ。(B) セクションとトルイジン ブルー染色により筋の筋束のより良い視覚化できます。スケール バー: 200 μ m。
4. 取り付け IFM セクション
<ol><li>H2O が蒸発するまで加熱ブロック スライドを乾燥します。</li>
	<li>セクションにメディアをマウントの 1 または 2 滴を入れて、上を置きます。 注意: は、メディアをマウントは有毒であるため発煙のフードでこの手順を実行します。</li>
</ol>5. 画像と筋肉領域の定量化の取得
<ol><li>DLM 筋肉のセット全体がフォーカスになるよう低倍率で画像を撮影します。我々 は通常、10 X を使用します。<ol>
<li>統計分析のためフライあたり少なくとも 5 連続画像を撮影し、, 実験群あたり少なくとも 5 ハエを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全身の筋肉群 (図 5 a) を含むイメージを選択します。軸またはセクションの向きを確認し、結果を歪める不適切な方向にサンプルを破棄 (図 3 a を比較/ひどく区別する 3 b と配向のセクション、それぞれ)。</li>
	<li>DLMs (図 5 a/5B) のみを含むピクセル単位で領域を選択するのに ImageJ ソフトウェアを使用します。使用する参照領域には異なる実験群間比較のため最大筋肉とフライ常でしょう。比較する異なる遺伝子型のすべての画像では、参照領域 (図 5 b) に等しい大きさの DLMs を含む領域を選択します。</li>
	<li>画像 J コマンドで画像を 2 値化する:プロセス/バイナリ/作るバイナリ分野や関心 (図 5) の筋肉に対応しないピクセルを削除します。<ol>
<li>Artefactual 黒い斑点が筋以外の領域に表示される場合は、描画ツールのコマンドでそれらを削除し、消しゴムのシンボルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> 図 5.筋肉の領域を決定するための解析手順をイメージします。(A) 横断部筋強直性ジストロフィー 1 型モデルは、DLM を含む四角形で胸部を飛ぶ。(B) 選択したエリアだけ間接飛翔筋と腸 (*)。(C) Binarized 画像。黒の領域は、目的の筋肉に対応します。腸は、筋肉領域の正確な定量化のため消されています。スケール バー: 200 μ m。
<ol start="5"><li>コマンドの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を数値化:分析/計測・面積率オプションを選択します。この領域の割合は、それぞれのフライの DLM 筋肉量の推定です。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

利害の対立が宣言されていません。

キイロショウジョウバエが人間の神経筋疾患7,10,11の出現によって特徴付けられる筋強直性ジストロフィーの研究に有用なモデルであることが実証されています。筋肉の萎縮。ここで提示されたプロトコルは、発症やフライのモデルの特定の病気の進行による筋変性を定量化するための便利なツールです。たとえば?...

フルーツ フライの胸部には、飛翔筋は機能的、生理的、解剖学的に全く異なる 2 つの異なるクラスが含まれています。これらの筋肉: 間接飛翔筋 (IFM) 背縦 (DLM) や背腹 (DVM) の筋肉 (図 1) と同期のフライトから成る制御筋肉1,2。これらの筋肉は、一緒に飛行のために必要な昇格した機械力を生成します。サイズ、分布との間の吻尾処分横断面3 (図 2 a) の簡単なオリエンテーションを許可します。このため、ショウジョウバエ筋萎縮の研究にこれらの筋肉を選択しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> 図 1。間接飛翔筋 (間) の配置を示すショウジョウバエ胸部の図。(左) は、横方向のビューを表します、(右) は、胸部の断面を表します。(赤) で (DLM) の背の縦筋から成る、間と背腹 (DVM) 筋肉 (緑) で。
保全組織構造と組織学的セクションの背腹軸方向の制御は、筋断面積の適切な評価を確保するために重要です。筋肉の構造を維持するために我々 はトムリンソンらから変更固定混合物を使用4 。また、筋肉は内部組織であるために、混合物は、標的組織を突き通すことができない固定として、ショウジョウバエの外骨格の不浸透性は問題であるとします。この問題を回避するためには、フライの頭、脚、翼、入力する固定混合物を許可する穴を作成する腹部の最後の 2 つのセグメントを削除しました。四酸化オスミウム (OsO4)5脂肪を修正する能力のために広く使用される治療を含めました固定プロトコルの一部としてトリグリセリドを含みます。OsO4は特に細胞レベルで非常によく、ほとんどの構造体を保持、同時にイメージにコントラストを提供しています。固定後、ショウジョウバエの thoraces は、横半薄い断面 (1.5 μ m) 用樹脂に埋め込まれていた。改良されたコントラストの組織汚すことができるさらにトルイジン ブルー。完全な thoraces の画像は、10 X で撮影された、筋面積が (等しい寸法) の画像を二値化すると ImageJ ソフトウェアの総数から筋肉組織 (黒のピクセル) に対応するピクセルの割合を定量化し, 定量化しました。
このプロトコルの導入、OsO4およびグルタールアルデヒド溶液の濃度の増加として組織化・固定化混合変更は、筋肉組織の独特な保存を許可しました。これは、プロトコルも神経筋変性疾患筋強直性ジストロフィー (DM) などに関連付けられている高度萎縮性条件で試料の事後分析の信頼性を高める、組織の変形と劣化を回避するためです。一般的な形式として、DM のタイプ 1、このまれな遺伝的疾患は、筋強直性ジストロフィー蛋白質キナーゼ(DMPK) 成績証明書の展開の CUG リピートによってもたらされます。突然変異体の DMPK RNA 集計隔離 muscleblind だったような核 RNA 結合蛋白質 (MBNL1-3; フォーム ribonuclear 巣ショウジョウバエの muscleblind だった (Mbl)) の6。筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc Gal4) 250 CTG の繰り返しを表現することにより筋強直性ジストロフィーのショウジョウバエモデルを生成されます。モデル ハエのアップ開催羽' 典型的な表現型と飛べないしていた深刻な筋萎縮の間 (図 2 b)。私たちの研究室で実行前の研究では、間の筋肉領域の決定は、これらモデル ハエ7筋萎縮のさまざまな化学物質や遺伝的修飾キーの効果を定量化する信頼性の高い方法を示しています。例として 250 CTG を表現するハエの C は筋肉で繰り返される Mbl アイソ フォームの発現は、隔離で Mbl 枯渇は DM1 病態8 (図 2) でトリガーの要因として筋地域の救助を達成しました。Abp1、実績のある反 DM1 活動9 (図 2 D) ヘキサペプチドとハエの DM モデルを供給した後が筋面積も助かった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> 図 2。大人の thoraces を樹脂包埋の卵割のセクションの定量化。関連遺伝子多型の指定されたショウジョウバエ(A ~ D) 間接飛翔筋。(A) 制御は飛ぶ (和田) です。(250 以外のコーディング CTG の式 B) を繰り返す筋肉で (UAS-CTG(250)x)コントロール ハエと比較して DLMs の筋面積の減少を引き起こした。(C) この筋萎縮の表現型は muscleblind だった (MblC) の過剰発現によって救出された (UA CTG (250) UAS MblC x) (D) を供給 (UA CTG (250) x Abp1) ヘキサペプチド Abp1 にモデル ハエ。すべての画像では、背側は上です。遺伝子が筋肉のミオシン重鎖プロモーター (Mhc) を使用してに追い込まれた-Gal4。(E) 定量制御ハエを基準として筋肉の割合の差が認められたことを確認しました。ヒストグラムを示しています意味 ± S.E.M. * *p< 0.01 と * p < 0.05 (Student´s t-テスト)。スケール バー: 200 μ m.<a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ここで報告する方法は、筋肉の発達、メンテナンスと高齢化、病の病理、薬物検査筋肉組織が内因性および外部要因に応答する方法についての信頼できる情報を提供に焦点を当て研究者に興味になります。

<table><tbody><tr><td>Image-J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Bright field technique.</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>resin (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Dangerous.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Harmful.</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxic.</td></tr></tbody></table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

筋肉を無駄に、筋萎縮症として知られている神経筋症ショウジョウバエモデルの共通の表現型であります。我々 は異なった遺伝の原因によってもたらされる萎縮性表現型測定対象実験として背縦走筋 (DLM) では、具体的には、ハエの間接飛翔筋 (間) を使用しています。このプロトコルで半薄い断面のフライの胸部筋肉を埋め込む方法、筋と周囲の組織との間の良好なコントラストの入手方法、定量データの半自動獲得のための光学顕微鏡画像を処理する方法を述べると解析。方法論のパイプラインの 3 つの特定のアプリケーションについて述べる。まず、筋強直性ジストロフィー飛ぶモデルで筋変性を定量化する方法を適用する方法を示す第二に、筋断面積の測定を促進または筋萎縮や筋変性を防ぐ遺伝子を識別するために助けることができます。第三に、このプロトコルを適用して、候補化合物が病気を引き起こす突然変異による与えられた萎縮性表現型を大幅に変更することができるかどうかを判断できますまたは環境トリガーによって。

MblC の過剰発現または Abp1 の管理は筋強直性ジストロフィーのフライ モデルの萎縮性の表現型効果をもたらしたかどうかを定量化するには、間 (図 1) の一部である Dlm に着目。我々 はミオシン重鎖プロモーター (Mhc) によって駆動される筋肉全体で 250 以外のコーディング CTG の繰り返しを表現するモデルが飛ぶことを決定-Gal4、いたハエを...

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

キイロショウジョウバエ成虫の間接飛翔筋の光学断面筋決定

ショウジョウバエ大人の筋肉量を決定するための間接的な手法である筋面積を定量化する手法を報告する.筋筋強直性ジストロフィー症ショウジョウバエモデルの間接飛翔を分析することによって私たちの方法論の適用を示します。

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K ビュー.  University of Valencia. ショウジョウバエ大人の筋肉量を決定するための間接的な手法である筋面積を定量化する手法を報告する.筋筋強直性ジストロフィー症ショウジョウバエモデルの間接飛翔を分析することによって私たちの方法論の適用を示します。

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Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

遺伝学

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

発生生物学

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

生物学

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

ショウジョウバエにおける単一mRNA分子の検出と定量(英語)

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

著者スポットライト:ショウジョウバエの筋肉組織におけるmRNA空間分布の調査 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

神経科学

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

キイロショウジョウバエ成虫の間接飛翔筋の光学断面筋決定

要約

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この動画の章

オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出するショウジョウバエ成脚の解剖と免疫染色

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

キイロショウジョウバエ成虫の間接飛翔筋の光学断面筋決定

要約

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オミクスアプローチに対するショウジョウバエメラノガスター飛行筋肉の解剖

生体内でショウジョウバエの蛹の筋腱の形態形成の観察

のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内イメージングショウジョウバエ

ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

ショウジョウバエの1分子スケールでの筋肉転写ダイナミクスの研究

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出する ショウジョウバエ 成脚の解剖と免疫染色

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング（OCM）

認識された運動ニューロンの神経筋接合部における変化を検出するショウジョウバエ成脚の解剖と免疫染色