Die Autoren möchten Mitglieder der translationalen Genomik-Gruppe und Kathryn J Hanson für die Rückmeldung und die Verbesserungen auf dieses Protokoll zu danken. Dieses Projekt erfolgte mit Forschungsstipendium SAF2015-64500-R, die europäischen Fonds für regionale Entwicklung, verliehen durch das Ministerio de Economia y Competitividad R.A umfasst.

(1) Fixierung und Harz einbetten
<ol><li>Die fliegen mit Kohlendioxid (CO2) oder via Hypothermie mit einem Eisblock zu betäuben. Verwenden Sie einen sezierenden Mikroskop (mit geringer Vergrößerung zu sehen, die ganze Fliege) und Schere um zu entfernen, die Beine, Flügel, Kopf und terminal Teil des Abdomens, das Eindringen der Fixativ zu erleichtern. Schonung der Kadaver ist erforderlich bei diesem Schritt um die Verformung des Brustkorbs zu vermeiden. Hinweis: Starten Sie mit mindestens 12 fliegen pro Genotyp um eine ausreichende Anzahl von richtig verarbeitete Individuen am Ende des Verfahrens.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kadaver auf eine 1,5 mL-Tube auf Eis (Platzieren von maximal 6 Personen pro Röhre) mit 200 µL Lösung 1. Hinweis: Die Kadaver nicht in Lösung 1 für mehr als 20 min bleiben.<ol>
<li>Mix für Lösung 1, Komponenten in diesen Volumen Proportionen: ¼ 4 % Paraformaldehyd, ¼ 8 % Glutaraldehyd, ¼ 0,2 M Na2HPO4 und ¼ 0,2 M NaH2PO4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.<ol>
<li>Lösung 2: Mix Lösung 1 und OsO4 im Verhältnis 1:1 (V/V). Achtung: OsO4 ist extrem giftig. In einer Abzugshaube mit geeigneten Maßnahmen für Sicherheit und Entsorgung zu manipulieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Flüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie 200 µL Lösung 2 und inkubieren Sie für 1-2 h auf Eis.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung und entwässern die Proben durch eine abgestufte Ethanol-Reihe wie folgt: einmal in 30 %, 50 %, 70 %, 90 %, und zweimal in absoluten Ethanol; 5 min. Fügen Sie 1 mL Ethanol um die Proben zu decken. Hinweis: Wenn das Gewebe in 90 % Ethanol platziert ist, können die nachfolgenden Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt werden.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Proben zweimal in Propylenoxid für 10 min jeden Inkubation. Achtung: Propylenoxid ist giftig, in einer Dampfhaube verwenden.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Propylenoxid durch ein 1:1 (V/V) Mischung aus Epoxy-Harz und Propylen Oxid und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren. Achtung: Das Harz ist im flüssigen Zustand extrem giftig. Das Harz ist als ein Satz von vier Komponenten (A, B, C und D) zur Verfügung.<ol>
<li>Fügen Sie für Epoxidharz in eine Einweg-Becher 54 g Harz (A), 44,5 g härter (B), 2,5 g des Beschleunigers (C) und 10 g Weichmacher (D). Kombinieren Sie die Harz-Komponenten unter einem Abzug. Speichern Sie das Harz in Aliquote bei-20 ° C (für bis zu 6 Monate) oder bei-80 ° C (für mehrere Jahre).</li>
		<li>Um das Harz zu verwerfen, Backen Sie bei 70 ° C für 24 h weil Festharz nicht toxisch ist. Alle bisherigen Lösungen in der Gruppe der Schwermetalle nach geeigneten internationalen Verfahren, zu verwerfen, da Lösungen können Spuren von OsO enthalten4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ersetzen Sie die bisherigen Mischung mit 100 % Harz und inkubieren Sie die Proben für 4 h.</li>
	<li>Übertragen Sie die Kadaver auf Kunststoffformen, enthält neue Harz (ein Kadaver in jede Vertiefung der Form). Verwenden Sie einen angespitzten Holzstab oder Nadel zu übertragen und die Kadaver in den Brunnen zu orientieren und das Harz über Nacht im Backofen bei 70 ° c Pasteur polymerisieren zu verlassen Hinweis: Um entsprechende Orientierung der Schlachtkörper für hintere trimmen und schneiden zu gewährleisten, sollten die Kadaver an ihrer Längsseite mit dem vorderen Teil des Korpus sehr nahe an den Rand des Brunnens liegen.</li>
</ol>2. Trimmen und Schneiden von Blöcken
<ol><li>Entfernen Sie die polymerisierten Harz-Blöcke aus den Formen. Verwenden Sie Rasierklingen schneiden Sie das Harz, eine trapezförmige form rund um die Karkasse und geben entsprechende Orientierung im Mikrotom. Starten Sie schneiden die Kadaver nach der transversalen Naht um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Hinweis: Der Schnitt muss senkrecht zur Achse des DLMs Probe richtig trimmen Anteroposterior sein ( Abbildung 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> Abbildung 3 . Dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet, myotonische Dystrophie Modell fliegen. (A) war das Trimmen der Probe nicht richtig, da war der Teil im dorsalen rechten Teil des Bildes nicht vollständig transversalen zu den Muskeln. Folglich scheinen die drei Muskelbündel auf der oberen rechten Seite größer als die der linken Seite. Dieser Fehler führt zu einer Überschätzung des Bereichs Muskel. (B) Abschnitt aus einem Block korrekt getrimmte Harz. Maßstabsleiste: 200 µm.
<ol><li>Schnitt 1,5 µm dicke Schichten mit einer regungsloses und übertragen Sie die Abschnitte in Wassertropfen über verkleisterte Folien.<ol>
<li>Erhalten Sie die Abschnitte aus dem Mesothorax Segment für alle Proben um vergleichbare Ergebnisse zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die Folien mit den Abschnitten auf einem Heizblock bei 70-80 ° C bis H2O verdampft. An dieser Stelle können die Proben mit dem OsO4 Kontrast (Abb. 4A) beobachtet werden.</li>
</ol>3. Färbung IFM Abschnitte
<ol><li>Sollte in den Kapiteln mit genügend Toluidin blau für ca. 30 s auf dem Heizblock.<ol>
<li>Toluidin blauer Lösung lösen Sie auf, 1 % der Toluidin blau und 1 % Borax in H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Spülen mit H2O und lassen Sie die Folien auf einem warmen Teller um das Wasser zu verdampfen. Wiederholen Sie die Färbung mit Toluidin blau wenn der Kontrast sein muss (Abbildung 4 b) erweitert.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> Abbildung 4 . Dorsoventral Abschnitte der Harz eingebettet adult Thoraces mit verschiedenen Kontrast Keramikschalen. Beide Platten zeigen Bilder der DM1 Modell fliegen mit Abp1 wie in Abb. 2Dgefüttert. (A) Bild eines Abschnitts mit dem OsO4 Kontrast. (B) Abschnitt gebeizt mit Toluidin Blau ermöglicht bessere Visualisierung der Muskelbündel. Maßstabsleiste: 200 µm.
4. Montage IFM Abschnitte
<ol><li>Trocknen Sie die Folien mit den Heizblock bis H2O verdampft.</li>
	<li>1 oder 2 Tropfen Eindeckmittel auf den Abschnitten und einem Deckgläschen auflegen. Achtung: Führen Sie diesen Schritt in einer Dampfhaube weil das Eindeckmittel giftig ist.</li>
</ol>5. Erwerb von Bildern und Quantifizierung der Muskelgebiet
<ol><li>Nehmen Sie die Bilder bei kleiner Vergrößerung, so dass das ganze Set der DLM Muskeln im Fokus ist. Wir verwenden normalerweise 10 X.<ol>
<li>Für die statistische Analyse mindestens 5 serielle Bilder pro Fliege nehmen und mindestens 5 fliegen pro Versuchsgruppe zu analysieren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wählen Sie das Bild mit der gesamten Muskulatur (Abb. 5A). Überprüfen Sie die Achse oder die Ausrichtung des Abschnitts und entsorgen Sie die Proben mit unangemessenen Orientierung, die die Ergebnisse verfälschen würde (Vergleiche Abbildungen 3A / 3 b zu stark unterscheiden und gut orientierte Abschnitte bzw.).</li>
	<li>Verwenden Sie ImageJ-Software, um einen Bereich (in Pixel), enthält nur die DLMs (Abbildung 5A/5B) auswählen. Für den Vergleich zwischen verschiedenen Versuchsgruppen wäre der Referenzbereich zu verwendenden immer die Fliege mit den größten Muskeln. In den Bildern der verschiedenen Genotypen zu vergleichen, wählen einen Bereich mit DLMs gleichen Abmessungen zu den Referenzbereich (Abb. 5 b).</li>
	<li>Vollständig die Bilder mit dem Befehl Bild-J: Prozess/Binary/Make binäre und löschen Sie die Bereiche oder Pixel, die nicht zu den Muskeln des Interesses (Abbildung 5) entsprechen.<ol>
<li>Löschen Sie in dem Fall, den artifizielle schwarze Flecken in anderen Bereichen als Muskel angezeigt werden sie mit dem Befehl Zeichenwerkzeuge und wählen Sie das Radiergummi-Symbol.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> Abbildung 5 . Analyseverfahren für Muskel Bereich Bestimmung Bild. (A) transversaler Abschnitt myotonische Dystrophie Typ 1 Modell fliegen Thorax mit ein Rechteck mit der DLM. (B) ausgewählte Bereich mit nur die indirekten Flugmuskeln und den Darm (*). (C) Binarized Bild. Die schwarzen Bereiche entsprechen den Muskeln von Interesse. Der Darm ist für eine genaue Quantifizierung der Muskelgebiet gelöscht. Maßstabsleiste: 200 µm.
<ol start="5"><li>Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt mit dem Befehl zu quantifizieren: Analyse/Messung und wählen Sie die Option Bereich Bruchteil. Dieser Prozentsatz des Bereichs ist eine Abschätzung der DLM Muskelmasse jede Fliege.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Es hat sich gezeigt, dass Drosophila Melanogaster eine nützliche Modell zur menschlichen neuromuskulären Erkrankungen7,10,11, einschließlich myotonische Dystrophien, charakterisiert durch das Auftreten von Muskelatrophie. Das Protokoll hier vorgestellten ist ein nützliches Instrument zur Quantifizierung der Muskeldegeneration durch das auftreten oder Fortschreiten einer bestimmten Krankheit in einem Fly Modell verur...

Der Thorax der Fruchtfliege enthält zwei verschiedene Klassen von Flugmuskeln, die funktionell, physiologisch und anatomisch unterscheiden. Diese Muskeln sind: die indirekten Flugmuskeln (IFM), die von dorsal längs (DLM) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (Abbildung 1) und die synchrone Flug bestehen Steuern Muskeln1,2. Diese Muskeln erzeugen zusammen die erhöhte mechanische Leistung für Flug benötigt. Die Größe, Verteilung und Rostro-kaudalen Disposition der die Schnittstellenmodule ermöglichen eine einfache Orientierung für transversale Stationspunkte3 (Abbildung 2A). Aus diesem Grund haben wir diese Muskeln, Muskelatrophie in Drosophila Melanogasterstudieren ausgewählt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> Abbildung 1: Diagramm des Thorax der Fruchtfliege zeigen die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) Anordnung. (Links) stellt eine seitliche Ansicht und (rechts) repräsentiert einen Querschnitt des Thorax. Die Schnittstellenmodule bestehen der dorsal längs (DLM) Muskeln (in rot) und dorsal-Ventral (DVM) Muskeln (in grün).
Erhaltung der Gewebestruktur und die Kontrolle über dorsal-Ventral Achsenausrichtung der histologischen Abschnitte sind entscheidend für die richtige Beurteilung der Muskel Querschnittsfläche gewährleisten zu können. Muskelstruktur erhalten wir eine Fixierung Mischung geändert von Tomlinson Et Al. verwendet 4 . Weil Muskeln inneren Geweben, ist die Dichtheit der DrosophilaExoskelett übrigens ein Problem als Fixierung, die Mischungen auf das Zielgewebe nicht durchdringen können. Um dieses Problem zu umgehen, entfernen wir fliegen Kopf, Beine, Flügel und die letzten beiden Segmente des Abdomens Bohrungen erstellen, die die Fixierung Mischung geben darf. Im Rahmen des Protokolls Fixierung wir Behandlung mit Osmium ausgefällt (OsO4)5, die ausgiebig wegen seiner Fähigkeit verwendet wird enthalten, um Fette zu beheben, einschließlich der Triglyceride. OsO4 bewahrt die meisten Strukturen sehr gut, vor allem auf die zytologische Ebene und zur gleichen Zeit bietet einen Kontrast zu dem Bild. Nach der Fixierung waren Drosophila Thoraces im Harz für transversale semi-dünne Stationspunkte (1,5 µm) eingebettet. Für verbesserten Kontrast kann Gewebe zusätzlich mit Toluidin blau gefärbt werden. Bilder der kompletten Thoraces wurden bei 10 X und Muskelgebiet wurde durch binarizing Bilder (mit gleichen Abmessungen) und Quantifizierung der Prozentsatz der Pixel, die Muskelgewebe (schwarze Pixel) von insgesamt, mit ImageJ Software quantifiziert.
Veränderungen auf die Gewebe Vorbereitung und Fixierung Mischungen, wie der Anstieg der Konzentration von OsO4 und Glutaraldehyd-Lösung eingeführt, die in diesem Protokoll erlaubt einzigartige Erhaltung von Muskelgewebe. Und zwar deshalb, weil das Protokoll der Abbau und die Verformung des Gewebes, machen die hintere Analyse der Proben selbst in stark atrophischen Bedingungen im Zusammenhang mit neuromuskulären degenerativen Erkrankungen wie z. B. myotonische Dystrophie (DM) zuverlässiger vermeidet. In seiner häufigsten Form, DM Typ 1, ist diese seltene genetische Erkrankung durch erweiterte CUG Wiederholungen im myotonische Dystrophie Proteinkinase (DMPK) Abschriften herbeigeführt. Mutierte DMPK RNA Aggregate Form Ribonuclear Herde, die absondern Muscleblind-wie nukleare RNA-bindende Proteine (MBNL1-3; Muscleblind (Mbl) in Drosophila)6. Wir generiert eine Drosophila -Modell myotonische Dystrophie 250 CTG Wiederholungen unter den muskulösen Myosin schwere Kette Projektträger (Mhc-Gal4) zum Ausdruck zu bringen. Modell fliegen waren flugunfähige mit einem typischen "Up statt Flügel" Phänotyp und schweren Muskel Atrophie in ihre Schnittstellenmodule (Abb. 2 b). Frühere Studien, die in unserem Labor durchgeführt haben gezeigt, dass die Bestimmung des Gebiets Muskel Schnittstellenmodule ist eine zuverlässige Methode zur Quantifizierung der Auswirkungen von verschiedenen chemischen oder genetische Modifikatoren der Muskelatrophie in diese Modell fliegen7. Als Beispiel erreicht Überexpression des Mbl-Isoform C fliegen mit dem Ausdruck der 250 CTG im Muskel, Wiederholungen eine Rettung Muskelgebiet, Mbl Erschöpfung durch Sequestrierung ist der auslösende Faktor in DM1 Pathogenese8 (Abbildung 2). Muskelgebiet wurde auch gerettet, nach Fütterung der DM-Modell mit Abp1, ein Hexapeptid mit bewährten Anti-DM1 Aktivität9 (Abb. 2D) fliegt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> Abbildung 2: Quantifizierung der dorsoventral Abschnitte des Erwachsenen Thoraces Harz eingebettet. (A-D) indirekten Flugmuskeln von Drosophila Melanogaster mit der angegebenen relevanten Genotypen. (A) Kontrolle fliegt (Yw). (B) Ausdruck von 250 nicht-kodierenden CTG wiederholt in der Muskulatur (UAS-CTG(250)x) verursacht eine Verringerung der Muskelgebiet im DLMs im Vergleich zur Kontrolle fliegen. (C) diese Muskel-Atrophie-Phänotyp wurde gerettet durch Überexpression des Muscleblind (MblC) (FH-CTG (250) x UAS-MblC) und (D) Fütterung die Modell-fliegen mit dem Hexapeptid Abp1 (FH-CTG (250) x Abp1). In allen Bildern ist die dorsale Seite oben. Transgene Muscle Myosin Heavy Chain Förderer (Mhc) mit vertrieben wurden-Gal4. (E) Quantifizierung der Prozentsatz der Muskelgebiet bezogen auf die Kontrolle fliegen bestätigt, dass die Unterschiede signifikant waren. Das Histogramm zeigt Mittel ± S.E.M **p< 0,01 und * p < 0,05 (Student t-Test). Maßstabsleiste: 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Die Methode, die hier berichtet wird von Interesse für Forscher mit Schwerpunkt auf Muskel-Entwicklung, Wartung und Altern, Krankheit Pathologie und Drogentests wie es zuverlässige Informationen liefert über wie Muskelgewebe auf endogene und externe Faktoren reagiert.

<table><tbody><tr><td>Image-J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Bright field technique.</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>resin (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Dangerous.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Harmful.</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxic.</td></tr></tbody></table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

Muskelmasse zu verlieren, ist bekannt als Muskelatrophie, einen gemeinsamen Phänotyp in Drosophila -Modellen der neuromuskulären Erkrankungen. Wir haben die indirekten Flugmuskeln (Schnittstellenmodule) fliegen, speziell der dorsal-Längsmuskeln (DLM), als die experimentelle gegen die verwendet, die atrophische Phänotyp durch unterschiedliche genetische Ursachen herbeigeführt. In diesem Protokoll beschreiben wir fliegen Thorax Muskeln für halb dünn schneiden einbetten, das einen guten Kontrast zwischen Muskel und das umgebende Gewebe zu erhalten und das optische Mikroskopbilder für halbautomatische Erfassung von quantifizierbaren Daten verarbeiten und Analyse. Wir beschreiben drei spezifische Anwendungen der methodischen Pipeline. Zunächst zeigen wir, wie die Methode angewendet werden kann, um Muskeldegeneration in einem myotonische Dystrophie Fly Modell zu quantifizieren; Zweitens helfen Messung der Muskel Querschnittsfläche, um Gene zu identifizieren, die entweder zu fördern oder zu, Muskelatrophie und/oder Muskeldegeneration verhindern; Drittens kann dieses Protokoll angewendet werden, um festzustellen, ob eine Kandidatenverbindung in der Lage, einen bestimmten atrophischen Phänotyp, induziert durch eine ursächliche Mutation wesentlich zu ändern istoder durch ein Umwelt-Trigger.

Um zu bestimmen ob die Überexpression von MblC oder die Verwaltung von Abp1 keine Wirkung in der atrophischen Phänotyp des Modells myotonische Dystrophie fliegen hatte konzentrierten wir uns auf die DLMs, die Schnittstellenmodule (Abbildung 1) gehören. Wir festgestellt, dass das Modell fliegt die express 250 nicht-kodierenden CTG Wiederholungen in der Muskulatur, angetrieben durch den Projektträger Myosin Heavy Chain (Mhc),-Gal4, hatte eine Ermä...

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Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K Aufrufe.  University of Valencia. Wir berichten über eine Methode, um Muskelgebiet, zu quantifizieren, ist eine indirekte Methode Muskelmasse bei Drosophila Erwachsenen bestimmen. Wir demonstrieren die Anwendung unserer Methode durch die Analyse des indirekten Flugs in einem Drosophila -Modell myotonische Dystrophie Krankheit Muskeln.

Serie: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Forschung

Genetik

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Entwicklungsbiologie

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Biologie

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Nachweis und Quantifizierung einzelner mRNA-Moleküle in Drosophila

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der räumlichen Verteilung von mRNA im Muskelgewebe von Drosophila 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Neurowissenschaften

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Optische Cross-sectional Muskel Bereich Bestimmung von Drosophila Melanogaster Erwachsenen indirekten Flugmuskeln

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Dissektion von Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Mesoscopic Fluoreszenz-Tomographie für In-vivo Imaging der Entwicklungsländer Drosophila

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Paraffin-Embedded-und Gefrierschnitte von Drosophila Adult Muskeln

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Untersuchung der Transkriptionsdynamik von Muskeln auf Einzelmolekülskalen in Drosophila

Dissektion und Immunhistochemie des Drosophila Adult Leg zur Erkennung von Veränderungen an der neuromuskulären Verbindung für ein identifiziertes Motoneuron

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)