저자는이 프로토콜에 피드 백 및 개선에 대 한 변환 유전체학 그룹과 캐서린 J 핸 슨의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 이 프로젝트는 연구 그랜트 SAF2015-64500-R, 유럽 지역 개발 기금, R.A 정부의 드 Economia y Competitividad에 의해 수 여를 포함 실시 했다.

1. 고정 및 수 지 포함
<ol><li>이산화탄소 (CO2) 또는 저체온증 얼음 블록을 사용 하 여 통해 파리 anesthetize (전체 비행을 보고 낮은 확대)와 함께 해 현미경과가 위를 사용 하 여 다리, 날개, 머리와 복 부는 정착 액의 침투를 촉진 하기 위하여의 터미널 부분을 제거 하. 시체의 신중한 처리는 흉부의 변형 방지 하려면이 단계에서 필요 합니다. 참고: 프로시저의 끝에서 제대로 처리 된 개인의 충분 한 숫자를 보장 하기 위해 유전자 당 최소 12 파리와 시작.</li>
	<li>솔루션 1의 얼음 (관 당 6 개인의 최대 배치) 포함 200 µ L에 1.5 mL 튜브에 시체를 전송. 참고: 시체 20 분 이상에 대 한 솔루션 1에에서 남아 있을 수 없습니다.<ol>
<li>솔루션 1에 대 한 혼합이 볼륨 비율 구성 요소: ¼ 4 %paraformaldehyde, ¼ 8%도, ¼ 0.2 M 나2HPO4 및 ¼ 0.2 M NaH2포4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 30 분 동안 얼음에 품 어.<ol>
<li>해결 방법 2: 솔루션 1과 1:1 (v/v) 비율에 OsO4 혼합. 주의: OsO4 매우 독성이 있다. 적절 한 안전 및 폐기 조치 증기 두건에서 그것을 조작 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>모든 액체를 제거 합니다. 솔루션 2의 200 µ L을 추가 하 고 1-2 h에 대 한 얼음에 품 어.</li>
	<li>솔루션을 제거 하 고 다음과 같이 등급된 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수: 한 번에 30%, 50%, 70%, 90%, 그리고 두 번에 절대 에타 놀; 5 분 각입니다. 샘플을 커버 하는 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 참고: 지금까지 조직 90% 에탄올에 배치 되 면에 후속 단계에서 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>각 인큐베이션 10 분에 대 한 프로필 렌 산화물에 두 번 샘플을 품 어. 주의: 프로필 렌 산화물 독성, 증기 두건에서 그것을 사용 하 여.</li>
	<li>1:1 (v/v) 혼합 에폭시 수 지 및 프로필 렌 산화물의 프로필 렌 산화물을 대체 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어. 주의: 수 지는 액체 상태에서 매우 독성이 있다. 수 지는 4 개의 구성 요소 (A, B, C, D)의 집합으로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>에폭시 수 지에 대 한 추가 일회용 비 커의 수 지 (A), 경화제의 44.5 g 54 g (B), 가속기의 (C)와 가소제의 10 g 2.5 g (D). 증기 두건에 모든 수 지 구성 요소를 결합 합니다. Aliquots (최대 6 개월) 동안-20 ° C 또는-80 ° C에서 (몇 년)에 수 지를 저장 합니다.</li>
		<li>수 지 폐기, 구워 그것 24 h 70 ° C에서 고체 수 지는 독성이 있기 때문에. 솔루션 OsO의 흔적을 포함 될 수 있으므로 적절 한 국제 절차에 따라 중 금속 그룹에 모든 이전 솔루션을 삭제4.
</li>
	</ol>
</li>
	<li>100% 수 지, 이전 혼합물을 장착 하 고 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>새로운 수 지 (금형의 각 우물에서 한 시체)를 포함 하는 플라스틱 금형에 시체를 전송. 날카롭게 나무 막대기 또는 바늘을 전송 하 고 우물에 시체를 방향을 두고 하룻밤 70 ° c.에 파스퇴르 오븐에 유해를 수 지 사용 참고: 후부 트리밍 및 단면 시체의 적절 한 방향을 위해 시체 해야 거짓말 그들의 긴 측에 우물의 가장자리 가까이 매우 시체의 앞쪽 부분.</li>
</ol>2. 정돈 하 고 블록의 단면
<ol><li>금형에서 생산 수 지 블록을 제거 합니다. 면도날을 사용 하 여 수 지를 떨어져 트림 하 고 시체를 둘러싼 사다리꼴 모양을 형성 하 고는 톰에 적절 한 방향 제공. 비교 결과 얻으려면 가로 봉합 후 모든 시체를 단면 시작 합니다. 참고: 섹션은 샘플을 제대로 트림 DLMs의 anteroposterior 축에 수직 해야 합니다. ( 그림 3).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig3.jpg"> 그림 3 . Myotonic 영양 장애의 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 모델 파리. (A), 샘플의 트리밍 섹션 이미지의 오른쪽 지 느 러 미 부분에는 근육을 완전히 횡단 잘못 되었습니다. 결과적으로, 오른쪽 상단에 3 개의 근육 뭉치는 왼쪽의 것 들 보다 더 큰 것. 이 실수 근육 영역의 귀 착될 것 이다. (B)는 제대로 트림된 수 지 블록에서 섹션. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol><li>1.5 µ m는 ultramicrotome 두꺼운 섹션 잘라내어 gelatinized 슬라이드 위에 물 방울으로 섹션을 전송.<ol>
<li>비교 결과 얻기 위해 모든 샘플 mesothorax 세그먼트에서 섹션을 가져옵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 증발 될 때까지 70-80 ° C에가 열 블록에 대 한 섹션을 포함 하는 슬라이드를 놓습니다. 이 시점에서, 샘플 OsO4 대조 (그림 4A)와 함께 관찰할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 얼룩 IFM 섹션
<ol><li>충분 한 톨루이 약 30 블루와 섹션 커버 열 블록에 s.<ol>
<li>톨루이 블루 솔루션에 대 한 해산 톨루이 블루의 1%와 1% 붕 사 H2o.</li>
	</ol>
</li>
	<li>H2O 헹 구 고 물을 증발 하는 따뜻한 접시에 슬라이드를 두고. 반복 하는 얼룩 톨루이와 블루 대비 해야 하는 경우 향상 된 (그림 4B).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig4.jpg"> 그림 4 . 다른 대비 stainings와 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션. 두 패널 그림 2D로 Abp1를 품고 DM1 모델의 이미지를 표시 합니다. (A) 섹션 OsO4 대조의 이미지. (B) 섹션 톨루이 블루 물 근육 번들의 더 나은 시각화 수 있습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
4. 장착 IFM 섹션
<ol><li>H2O 증발 될 때까지 난방 블록 슬라이드를 건조.</li>
	<li>섹션에 장착 매체의 1 또는 2 방울을 넣고는 coverslip에 넣어. 주의: 설치 매체는 독성 때문에 증기 두건에서이 단계를 실시 합니다.</li>
</ol>5. 이미지와 근육의 부 량 인수
<ol><li>DLM 근육의 전체 세트 초점에 되도록 낮은 확대에서 이미지를 받아. 우리는 일반적으로 10 배를 사용합니다.<ol>
<li>통계 분석에 대 한 비행 당 적어도 5 직렬 이미지 하 고 분석 하는 실험 그룹 당 적어도 5 파리.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 근육 (그림 5A)를 포함 하는 이미지를 선택 합니다. 축 또는 섹션의 방향을 확인 하 고 결과 왜곡할 것 이다 부적 절 한 방향으로 샘플을 삭제 (비교 그림 3A / 3B 심하게 구분 하 고 잘 지향된 섹션, 각각).</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 선택 영역 (픽셀) DLMs (그림 5A/5B)를 포함 하. 다른 실험적인 그룹 간의 비교에 대 한 참조 영역을 사용할 수 항상 큰 근육과 비행 것입니다. 비교할 다른 genotypes의 모든 이미지에 DLMs 동일한 치수 참조 영역 (그림 5B)를의 포함 하는 영역을 선택 합니다.</li>
	<li>이미지-J 명령으로 이미지를 binarize: 프로세스/이진/확인 이진 분야 또는 관심 (그림 5C)의 근육에 일치 하지 않는 픽셀 삭제.<ol>
<li>Artefactual 검은 반점 근육 이외의 지역에 나타나는 경우, 명령 그리기 도구 와 그들을 삭제 하 고 지우개 기호를 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig5.jpg"> 그림 5 . 근육 지역 결정을 위한 분석 절차 이미지. (A) 횡단 부분의 Myotonic 영양 장애 유형 1 모델은 DLM을 포함 하는 사각형으로 흉부 비행. (만 간접 비행 근육과 내장 (*)와 B) 선택 된 영역입니다. (C) Binarized 이미지입니다. 검정 영역은 관심의 근육에 해당합니다. 소장이 근육의 정확한 정량화에 대 한 삭제 되었습니다. 눈금 막대: 200 µ m.
<ol start="5"><li>근육 조직 (검은 픽셀) 명령으로 총 중에 해당 하는 픽셀의 비율 계량: 분석/측정 및 선택 옵션 영역 분수. 지역의이 비율은 각의 DLM 근육 질량의 추정 이다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fernandes, J., Bate, M., Vijayraghavan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+indirect+flight+muscles+of+Drosophila.">Development of the indirect flight muscles of Drosophila.</a> Development. 113, 67-77 (1991).</li><li>Fernandes, J. J., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+the+dorsal+longitudinal+flight+muscles+(DLM)+of+Drosophila:+insights+from+the+ablation+of+larval+scaffolds.">Patterning the dorsal longitudinal flight muscles (DLM) of Drosophila: insights from the ablation of larval scaffolds.</a> Development. 122, 3755-3763 (1996).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+Drosophila+Development.">Atlas of Drosophila Development.</a> Atlas Drosoph. Dev. , 1-57 (1993).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+in+the+Drosophila+ommatidium.">Cell fate in the Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 123, 264-275 (1987).</li><li>Griffith, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmium+Tetroxide+And+Its+Applications.">Osmium Tetroxide And Its Applications.</a> Platin Met Rev. 18, 94-96 (1974).</li><li>Bird, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myotonic+Dystrophy+Type+1.">Myotonic Dystrophy Type 1.</a> GeneReviews. 1, 1-23 (1993).</li><li>Bargiela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+autophagy+and+apoptosis+contribute+to+muscle+atrophy+in+a+myotonic+dystrophy+type+1+Drosophila+model.">Increased autophagy and apoptosis contribute to muscle atrophy in a myotonic dystrophy type 1 Drosophila model.</a> Dis Model Mech. 8, 679-690 (2015).</li><li>Llamusi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscleblind,+BSF+and+TBPH+are+mislocalized+in+the+muscle+sarcomere+of+a+Drosophila+myotonic+dystrophy+model.">Muscleblind, BSF and TBPH are mislocalized in the muscle sarcomere of a Drosophila myotonic dystrophy model.</a> Dis. Model. Mech. 6, 184-196 (2012).</li><li>Garc&#237;a-L&#243;pez, A., Llamus&#237;, B., Orz&#225;ez, M., P&#233;rez-Pay&#225;, E., Artero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+discovery+of+a+peptide+that+prevents+CUG-RNA+hairpin+formation+and+reverses+RNA+toxicity+in+myotonic+dystrophy+models.">In vivo discovery of a peptide that prevents CUG-RNA hairpin formation and reverses RNA toxicity in myotonic dystrophy models.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11866-11871 (2011).</li><li>van der Plas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Dystrophin+is+required+for+integrity+of+the+musculature.">Drosophila Dystrophin is required for integrity of the musculature.</a> Mech. Dev. 124, 617-630 (2007).</li><li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flightless+flies:+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease.">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann New York Acad Sci. , 1184 (2010).</li><li>Babcock, D. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+accurate+and+rapid+measurement+of+flight+performance+in+Drosophila.">An improved method for accurate and rapid measurement of flight performance in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e51223 (2014).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언.

초파리 melanogaster 인간의 신경 근육 학 질병7,,1011, Myotonic Dystrophies의 모양으로 특징을 포함 하 여 연구에 유용한 모델 임을 입증 되었습니다. 근육 위축입니다. 여기에 제시 된 프로토콜 발병 또는 플라이 모델에서 특정 질병의 진행으로 인 한 근육 퇴보를 측정을 위한 유용한 도구입니다. 예를 들어 따라 다양 한 연령대?...

과일 파리의 흉부 비행 근육, 기능, 생리학 및 해부학 적 구분의 두 개의 서로 다른 클래스를 포함 합니다. 이 근육은: dorso 경도 (DLM)와 (DVM) dorso-복 부 근육 (그림 1), 및 동기 비행으로 구성 된 간접 비행 근육 (IFM), 제어 근육1,2. 이 근육은 함께 비행에 필요한 높은 기계적인 힘을 생성 합니다. 크기, 분포 및 rostro 꼬리 처리는 IFMs의 횡단 단면3 (그림 2A)에 대 한 쉬운 방향을 허용. 이러한 이유로, 우리는 이러한 근육 근육 위축 초파리 melanogaster에서 공부 하를 선택 했습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig1.jpg"> 그림 1입니다. 보여주는 간접적인 비행 근육 (IFMs) 배열 하는 과일 파리의 흉부의 도표. (왼쪽) 측면 보기 나타내고 (오른쪽) 가슴의 크로스 섹션을 나타냅니다. IFMs (레드)에서 Dorso 경도 (DLM) 근육의 구성 그리고 Dorso-복 부 (DVM) (녹색)에 근육.
조직 구조 및 조직학 섹션의 dorso 복 부 축 방향 제어할 보존 근육 단면적의 적절 한 평가 위해 중요 하다. 근육 구조를 유지 하기 위해 사용 하는 톰 린 슨 외 에서 수정 고정 혼합물 4 . 또한, 근육 내부 조직 이기 때문에, 초파리의 외 골격의 불 침투성 혼합물 대상 조직에 침투 수 없습니다 고정으로 문제를 이다. 이 문제를 회피, 비행 머리, 다리, 날개와 고정 혼합 입력을 허용 하는 구멍을 만드는 복 부의 마지막 2 개의 세그먼트를 제거 했습니다. 우리는 오스뮴 tetroxide (OsO4)5, 광범위 하 게 사용 되는 기능 지방을 수정 하는 치료를 포함 하는 고정 프로토콜의 일환으로 트리 글리세라이드를 포함 하 여. OsO4 cytological 수준에서 특히 매우 잘 대부분의 구조를 유지 하 고 동시에 이미지에 대 한 대비를 제공 합니다. 고정, 후 초파리 thoraces 횡단 반 얇은 단면 (1.5 µ m)에 대 한 수 지에 포함 했다. 향상 된 대비에 대 한 조직의 수 또한 얼룩이 질 톨루이와 블루. 완전 한 thoraces의 이미지 10 배에서 찍은 하 고 근육 지역 binarizing (같은 크기)의 이미지와 총 ImageJ 소프트웨어와 함께 근육 조직 (검은 픽셀)에 해당 하는 픽셀의 비율을 측정 하 여 계량 했다.
OsO4 와 솔루션 도입이 프로토콜의 농도의 증가 조직 준비 및 고정 혼합물에 수정 허용 근육 조직의 고유 보존. 이 프로토콜 저하 및 Myotonic 영양 장애 (DM) 등 신경 근육 퇴행 성 질환과 관련 된 매우 위축 한 조건에도 더 신뢰할 수 있는 샘플의 사후 분석을 만드는 조직의 변형 방지 때문입니다. 더 일반적인 형태로 DM 타입-1,이 희귀 한 유전적 장애 myotonic 영양 단백질 키 니 아 제 (DMPK) 성적표에 확장된 CUG 반복에 대 한 가져온입니다. 돌연변이 DMPK RNA 격리 Muscleblind 같은 핵 RNA 의무적인 단백질 (MBNL1-3; 폼 ribonuclear foci 집계 초파리에서 Muscleblind (Mbl))6. 근육 myosin 무거운 체인 발기인 (Mhc-Gal4)에서 250 CTG 반복 표현 하 여 Myotonic 영양의 초파리 모델을 생성 했습니다. 모델 파리 전형적인 최대 개최 '날개' 형으로 날지 되었고 심각한 근육 그들의 IFMs (그림 2B)에서 쇠 약 했다. 우리 연구실에서 수행 하는 이전 연구는 IFMs의 근육 영역의 결정이 모델 파리7근육 위축 증의 다른 화학 또는 유전 한정자의 효과 계량 하는 신뢰할 수 있는 방법을 나타났습니다. 예를 들어, C 250 CTG를 표현 하는 파리에는 근육에 반복 하는 Mbl isoform의 overexpression 격리 하 여 Mbl 고갈 DM1 pathogenesis8 (그림 2C) 트리거 요인으로, 근육의 구조를 달성. Abp1, 입증 된 안티-DM1 활동9 (그림 2D) hexapeptide와 파리 DM 모델 먹이 후에 근육 영역 구출 되었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56179/56179fig2.jpg"> 그림 2입니다. 수 지 포함 성인 thoraces의 dorsoventral 섹션 부 량이 고 (A-D) 표시 관련 genotypes 초파리 melanogaster 의 간접 비행 근육. (A) 제어 (영웅) 난다. (B) 비 코딩 CTG 250의 표정 근육에 반복 (UAS-CTG(250)x) 제어 파리에 비해 DLMs에서 근육의 감소를 발생. (C)이 근육 위축 형 Muscleblind (MblC)의 overexpression에 의해 구출 되었다 (UAS-CTG (250) UAS MblC x) 및 (D) 먹이 (UAS-CTG (250) x Abp1)에 hexapeptide Abp1와 모델의 파리. 모든 이미지에 지 면 위에. Transgenes는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)를 사용 하 여 근육을 주도 했다-Gal4. (E) 제어 파리에 상대적으로 근육의 비율의 정량화 차이가 상당한 했다 확인 했다. 히스토그램 표시 수단 ± S.E.M. * *p< 0.01와 * p < 0.05 (Student´s t-검정). 눈금 막대: 200 µ m. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56179/56179fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기 보고 방법은 근육 개발, 유지 보수 및 노화, 질병 병 리 및 마약 테스트 근육 조직 내 생 및 외부 요인에 응답 하는 방법에 대 한 신뢰할 수 있는 정보를 제공 하기 때문에 연구원에 게 관심이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Image-J software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica</td><td>Leica UC6</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Leica</td><td>Leica MZ6</td><td>Bright field technique.</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>World Precision World</td><td>14003</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Embedding molds</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70900</td><td>Several alternative providers exist.</td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fluka (Sigma)</td><td>49624</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Polyscience</td><td>0972A</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>Propylene oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82320-250ML</td><td>Extremely toxic.</td></tr><tr><td>resin (Durcupan)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44611-44614</td><td>Carcinogenic when it is unpolymerized.</td></tr><tr><td>Toluidine blue</td><td>Panreac</td><td>251176</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Mountant Medium (DPX)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>44581</td><td>Dangerous.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Harmful.</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>122507</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Panreac</td><td>121677</td><td>0.2 M dilution.</td></tr><tr><td>Borax</td><td>Panreac</td><td>3052</td><td>Toxic.</td></tr></tbody></table>

optical cross-sectional muscle area determination of drosophila melanogaster adult indirect flight muscles

근육 질량을 낭비 하 고, 근육 위축으로 알려진 신경 근육 학 질병의 초파리 모델에 일반적인 표현 형 이다. 우리는 파리, 특히 dorso 경도 근육 (DLM), 위축 형 다른 유전적 원인에 의해 초래 하는 측정 대상 실험으로 간접 비행 근육 (IFMs)를 사용 했습니다. 이 프로토콜에서 우리 반 얇은 단면에 대 한 비행 흉부 근육을 포함 하는 방법, 근육과 주위 조직 사이 좋은 대조를 방법 및 반자동 수집 가능한 데이터의 광학 현미경 이미지를 처리 하는 방법을 설명 하 고 분석입니다. 우리는 방법론 파이프라인의 세 가지 특정 응용 프로그램을 설명합니다. 첫째, 우리가 어떻게 방법 myotonic 영양 플라이 모델; 근육 퇴보를 계량에 적용할 수 있는 표시 둘째, 근육 단면적의 측정 홍보 하거나 근육 위축 및 근육 퇴보; 방지 유전자를 식별 하는 데 도움이 수 있습니다. 셋째,이 프로토콜 후보 화합물은 크게 질병 유발 돌연변이 의해 유도 된 주어진된 위축 한 표현 형을 수정할 수 있는지 여부를 결정에 적용할 수 있는또는 환경 방 아 쇠.

척도 MblC의 overexpression 또는 Abp1의 관리 Myotonic 영양 비행 모델의 위축 형에 어떤 영향을 미쳤다 여부를 우리가 IFMs (그림 1)의 일부인 DLMs에 집중 했다. 우리는 모델 파리는 Myosin 중 연쇄 발기인 (Mhc)에 의해 구동 하는 근육에 걸쳐 250 비 코딩 CTG 반복 표현 결정-Gal4, 파리 제어에 비해 근육의 50% 감소 했다. 반면, 동일한 드라이버 MblC 및 확장 된 CTG ...

Watch this Scientific Journal Video about Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles at JoVE.com

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

Muscle mass wasting, known as muscle atrophy, is a common phenotype in Drosophila models of neuromuscular diseases. We have used the indirect flight ...

optical-cross-sectional-muscle-area-determination-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

8.9K 조회수.  University of Valencia. 우리는 초파리 성인 근육 질량을 결정 하는 간접적인 방법 근육 영역을 측정 하는 방법을 보고 합니다. 간접 비행을 분석 하 여 우리의 방법론의 응용 근육 Myotonic 영양 질병의 초파리 모델에서 설명 합니다.

비디오: Optical Cross-Sectional Muscle Area Determination of Drosophila Melanogaster Adult Indirect Flight Muscles

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

연구

유전학

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from animals to humans. Therefore, the powerful Drosophila model system can be used to study concepts of muscle-tendon development that can also be applied to human muscle biology. Here, we describe in detail how morphogenesis of the adult muscle-tendon system can be easily imaged in living, developing Drosophila pupae. Hence, the method allows investigating proteins, cells and tissues in their physiological environment. In addition to a step-by-step protocol with helpful tips, we provide a comprehensive overview of fluorescently tagged marker proteins that are suitable for studying the muscle-tendon system. To highlight the versatile applications of the protocol, we show example movies ranging from visualization of long-term morphogenetic events &#8211; occurring on the time scale of hours and days &#8211; to visualization of short-term dynamic processes like muscle twitching occurring on time scale of seconds. Taken together, this protocol should enable the reader to design and perform live-imaging experiments for investigating muscle-tendon morphogenesis in the intact organism.

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Here, we present an easy-to-use and versatile method to perform live imaging of developmental processes in general and muscle-tendon morphogenesis in particular in living Drosophila pupae.

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

발생학

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

생물학

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Detection and Quantification of Single mRNA Molecules in Drosophila(초파리에서 단일 mRNA 분자의 검출 및 정량화)

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

저자 스포트라이트: Investigating mRNA Spatial Distribution in Drosophila Muscle Tissue 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

신경과학

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

초파리 Melanogaster 성인 간접 비행 근육의 광 단면 근육 면적 결정

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

오믹스 접근법에 대한 드로소필라 멜라노가스터 비행 근육의 해부

Vivo에서 근육-힘 줄 Morphogenesis 초파리 번데기에의 이미징

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내 이미징 Drosophila

초파리 배아에서 근육 수축의 라이브 이미징 및 분석

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

초파리 준비 및 빛 간섭 현미경을 사용하여 생체 내에서 심장 기능의 세로 이미징 (OCM)