Este método aborda cómo analizar los procesos de desarrollo como las contracciones musculares y el balanceo que se producen en el embrión de Drosophila. Algunas ventajas de esta técnica son que no es invasiva y bastante detallada, sin embargo, es relativamente fácil de realizar. Nuestro método se puede desarrollar aún más para el cribado basado en análisis de alto contenido para aislar y analizar nuevas mutaciones que afectan las contracciones musculares embrionarias y otros procesos de desarrollo.
Al visualizar las contracciones musculares, es importante cronoficializar correctamente las colecciones de embriones porque las contracciones comienzan solo en una etapa específica del desarrollo. La demostración visual paso a paso puede ayudar en gran medida en el análisis cuantitativo de los procesos de desarrollo. Para obtener imágenes en directo de embriones Drosophila montados, coloque los embriones en el escenario de un microscopio de epifluorescencia con una función timelapse y una cámara digital con filtros de emisión adecuados y seleccione una lente objetivo de inmersión de agua 10X.
A continuación, grabar vídeo en directo los embriones utilizando el software de grabación de microscopio adecuado durante aproximadamente una o dos horas con una tasa de adquisición de cuatro fotogramas por segundo. Al final del experimento, exporta el vídeo grabado directamente a ImageJ. Seleccione la imagen y el recorte para dibujar una caja alrededor de cada embrión individual para recortar las grabaciones de vídeo al tamaño de cada embrión.
Haga clic en Imagen, Transformar y Rotar para rotar las imágenes recortadas para lograr una posición vertical de la línea media del embrión en relación con la pantalla. Para establecer las mediciones de distancia en micrómetros, haga clic en Analizar y establecer escala y, a continuación, introduzca el factor de conversión de relación de píxel a micrón conocido para la configuración del microscopio. Todas las mediciones posteriores se notificarán en micrómetros.
Para analizar el laminación de embriones, primero marque la posición de una o ambas tráqueas de un embrión en el primer fotograma del vídeo a mitad de camino entre los extremos posterior y anterior y haga clic en Analizar, Herramientas y Región de Interest Manager. Dibuje una caja aproximada de siete micrómetros por siete micrómetros alrededor de la tráquea y haga clic en la tecla T del teclado para registrar esta posición como una coordenada XY. Marque la posición de la misma zona de la tráquea después de las contracciones peristálticas de interés y dibuje una línea que conecte los centros de cada caja haciendo clic en M en el teclado para medir la distancia desde la posición de pre-contracción hasta la posición post-contracción.
Para analizar las contracciones musculares embrionarias utilizando embriones que expresan marcadores musculares fluorescentes, utilice el registro de la lectura fluorescente para dibujar una región de interés centrada alrededor de los músculos fluorescentes de un segmento de interés corporal en particular. Seleccione la pestaña Agregar T en el Administrador de regiones de intereses para registrar la posición de la región de interés. Haga clic en Administrador de región de interés y Medir para registrar la intensidad fluorescente media de cada región de interés seleccionada para cada fotograma del vídeo.
Mueva el cuadro a los centros de otros segmentos de cuerpo de interés y haga clic en Agregar T para registrar sus posiciones y obtener regiones de interés de mismo tamaño en todos los segmentos de cuerpo que se analizarán. En el Administrador de regiones de interés, mantenga pulsada la tecla Control mientras selecciona todas las regiones de interés registradas como coordenadas XY. Haga clic en Más y Multi-Medida para medir la intensidad fluorescente media de cada región de interés para todos los fotogramas del vídeo.
Esto notificará cada medida en una tabla con cada región de interés como una columna de la tabla y cada fotograma como una fila. A continuación, transfiera la tabla a un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis. Trazar un gráfico con el número de fotograma en el eje X y la intensidad media de fluorescencia en el eje Y y convertir el número de fotograma en tiempo utilizando la velocidad de fotogramas de cuatro fotogramas por segundo.
Las contracciones musculares aumentan la intensidad de la GFP a medida que traen más GFP a las proximidades del área focal a medida que se introducen más músculos durante estas contracciones. Para determinar la amplitud de la contracción muscular, estime la intensidad de la PFG basal como la intensidad media de las regiones entre picos. A continuación, evalúe el aumento de la intensidad de fluorescencia de la GFP en relación con esta línea de base.
A continuación, divida cada región del valor de intensidad de interés por la intensidad de línea base para normalizar la intensidad de la PFN a la línea de base. Compare las intensidades de GFP normalizadas en los segmentos posterior, medial y anterior durante la onda de contracción muscular para examinar los cambios en la extensión de la contracción muscular a medida que la onda se propaga y para determinar la dirección de la onda. Para comparar las contracciones musculares en los lados izquierdo y derecho del embrión, analice las intensidades máximas de los mismos segmentos a ambos lados del embrión.
Utilice la amplitud de contracción y la sincronización de los picos para revelar las diferencias, si las hay, y la extensión y el tiempo de las ondas de contracción muscular peristáltica. Aquí se muestran contracciones musculares peristálticas normales en un embrión Drosophila de tipo salvaje. En este video de rodar en un embrión de tipo salvaje, tenga en cuenta que el apéndice dorsal no se mueve mientras que la tráquea lo hace indicando que el embrión ha rodado dentro de su caparazón.
En este análisis representativo, los picos de contracción muscular durante el período de tiempo de 165 a 178 segundos representan una sola onda hacia adelante. Para este embrión, no se midió ninguna diferencia en la amplitud y el tiempo de las contracciones musculares en los lados derecho e izquierdo del embrión. Una contracción peristáltica se designa como una onda de tipo uno hacia delante si su perfil tiene un pico que surge en la región posterior primero seguido de picos en las regiones media y anterior.
Una onda de tipo hacia atrás es un pico que primero surge en los segmentos anteriores y luego se propaga hacia las regiones posteriores. Las ondas tipo comienzan en un extremo del embrión y proceden hacia las regiones medias antes de regresar a su origen como una onda de barrido reiniciada en el extremo opuesto. Los embriones mutantes de postura corporal demuestran una frecuencia relativa anormal de tipo uno para escribir dos generaciones de ondas que resulta en una anomalía de la postura corporal designada como fenotipo de torsión o rotación del cuerpo.
Para utilizar la fluorescencia como lectura para los parámetros de contracción muscular, es esencial utilizar embriones con un reportero en el tejido muscular. Este método se puede utilizar para el registro simultáneo de las contracciones musculares de muchos embriones y para la evaluación de las respuestas a diversos estímulos, fármacos o cambios ambientales.
