Name: microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers at JoVE.com

Este trabajo está patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (21674018), el nacional clave de investigación y programa de desarrollo de China (2016YFA0201702 /2016YFA0201700) y el "programa de Shuguang" apoyado por el desarrollo de la educación de Shangai Comisión de Educación Municipal Fundación y Shanghai (15SG30), DHU distinguido joven profesor programa (A201302), los fondos de investigación para las universidades Central y el proyecto 111 (No.111-2-04).

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos seguridad del material pertinentes antes de su uso. Varios de los productos químicos utilizados en la preparación de la moldura están agudo tóxicos. Utilice equipo de protección personal (gafas, guantes, bata, pantalón largo y zapatos cerrados).
 1. microfluídicos Spinning de RSF solución acuosa <ol><li>Preparación de RSF acuosa spinning droga 4 , 15 , 16 <ol><li>Descrudado del gusano de seda capullo <ol><li>Degum capullos de Bombyx mori dos veces en Na 2 CO 3 acuosas (0,5% en peso en agua) a 100 ° C por 30 min y luego lavar la seda con agua desionizada para eliminar el sericina.</li>
		</ol></li> <li>Dissolving de capullo de gusano de seda degummed <ol><li>secar las sedas capullo desgomado en aire, disolver las sedas capullo desgomado en LiBr de 9,0 M solución acuosa con una proporción de 1:10 (p/v) a 40 ° C por 2 h. Por ejemplo, agregar 10 mL de LiBr por 1 gramo de seda ( Figura 1a).</li>
		</ol></li> <li>Centrifuging y filtrado <ol><li>diluir la solución de RSF 1.5 veces por agua desionizada. Centrífuga y filtro para quitar impurezas. Centrifugar la solución RSF en botellas de 250 mL a 4 ° C por 10 min a 1,234.8 x g. filtrar la solución RSF usando un filtro μm 20 y una bomba de vacío. Cama doble de papel de filtro es preferible considerar el efecto de la experimentación.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>dializarse la solución RSF en agua desionizada a 5 ° C por 3 días utilizando una membrana semipermeable de celulosa (MWCO: 14.000 ± 2.000). El volumen total de solución RSF es aproximadamente de 1 L, cargado en 4 bolsas de diálisis. Poner estas bolsas de diálisis en el cubo, que se llena con 10 L inversa ósmosis desionizada. 
			Nota: El valor de pH del agua desionizada debe ser superior a 6, para evitar la gelificación durante el proceso de concentración. El pH del agua desionizada no requieren ajuste de este protocolo.</li>
		</ol></li> <li>Concentración <ol><li>condensar la solución acuosa de RSF al 20% de peso por circulación de aire forzado en solución acuosa de 5 ° C. Añadir 3 M CaCl 2 en la solución RSF a 1,0 mmol/g concentración de Ca 2 + final; luego concentrado por aire forzado flujo a % en peso de 38-47.</li>
			<li>Pesar una gota de solución RSF sobre un portaobjetos de vidrio y luego secarla por 2 h en un horno a 105 ° C. 
			Nota: El peso por ciento de los restantes sólido en comparación con el peso de la gota antes de secado es la concentración total de proteína y CaCl 2. La concentración de RSF se deriva después de la deducción de la masa de CaCl 2. Por lo menos cuatro repitió las mediciones se realizaron. Nuestros estudios anteriores demostraron que la concentración de Ca 2 + afectado grandemente las propiedades reológicas y entallabilidad de las soluciones acuosas de RSF. Mientras tanto, la adición de Ca 2 + incitó la limitada formación de β-hoja y la agregación de RSF 17. En una droga nativa spinning, CaCl 2 se considera desempeñar un papel importante durante el almacenamiento de droga para evitar la congelación antes de giro de giro. 18</li></ol></li></ol></li> <li>preparación de chip microfluídico 8 , 19 <ol><li>preparación de fotomáscara <ol><li>diseñar el canal de micro en un Programa de CAD. Imprimir el archivo CAD para producir una alta resolución transparencia 19.</li>
		</ol></li> <li>Preparar el molde <ol><li>limpieza del portaobjetos de cristal <ol><li>en una campana química, hervir el portaobjetos de cristal en la solución mezclada de ácido sulfúrico concentrado y 30 vol % peróxido de hidrógeno solución (10:1) durante 20 min sobre una placa caliente. 
				PRECAUCIÓN: los vapores de ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno son extremadamente tóxicos.</li>
			</ol></li> <li>Lavar el portaobjetos de cristal <ol><li>lavar el portaobjetos de vidrio con agua desionizada y secarlo con nitrógeno de alta pureza.</li>
			</ol></li> <li>Película de la capa <ol><li>el photoresist SU-8 en la diapositiva de cristal por un dispositivo de capa a la medida con una separación de 100 μm entre la superficie inferior de la barra de capa y la superficie superior del vidrio de la capa.</li>
			</ol></li> <li>Capa de la vuelta <ol><li>extender el fotoprotector en lo portaobjetos de vidrio para formar una película uniforme con un recubridor spin a 40,3 x g por 30 s. El espesor de la película uniforme es el μm cerca de 85.</li>
			</ol></li> <li>Solidificación <ol><li>solidificar la fotoresistencia en un horno con una temperatura de control de programa. Elevar la temperatura de la temperatura ambiente hasta 65 ° C a 2 ° C/min y mantener a 65 ° C por 2 min continuar al calor para arriba de 65 ° C a 95° C y presionado a 95 ° C por 15 min vuelta apagado del horno y enfriar naturalmente a sala de temperatura en el horno.</li>
			</ol></li> <li>ULTRAVIOLETA exposición de luz <ol><li>exponer al lado de vidrio Deslice con la fotoprotección a la luz ultravioleta de 12 s utilizando la transparencia como un photomask por Fotolitografía 19. 
				Nota: La proporción de la luz ultravioleta es 365 nm y la energía de exposición es 273.6 mJ/cm 2. 
				PRECAUCIÓN: Toma medida de seguridad apropiada mientras se trabaja con luz UV y el horno.</li>
			</ol></li> <li>Solidificar la fotoresistencia como se describe en el paso 1.2.2.5.</li>
			<li>Desarrollo <ol><li>limpiar la fotoresistencia ultrasonidos en la solución de revelado para 30 s. lavar el portaobjeto por isopropanol y desarrollador, alternando entre los dos, hasta que no haya ninguna precipitación en el portaobjetos de cristal.</li>
			</ol></li> <li>Solidificar la fotoresistencia en un horno con una temperatura de control de programa. Elevar la temperatura de la temperatura a 170 ° C a 2 ° C/min y pulsado a 170 ° C durante 30 minutos a su vez fuera del horno y enfriar naturalmente a la temperatura en el horno.</li>
		</ol></li> <li>Litografía blanda <ol><li>Pour polímero antes de 8,8 g líquido polydimethylsiloxane (PDMS) sobre el molde y curación durante 30 min a 65 ° C y 15 min al polímero antes de 80 ° C. PDMS líquido consta de PDMS y agente de curado (normalmente en 10:1 (w/w)).</li>
		</ol></li> <li>Perforación <ol><li>perforar un agujero a través de la réplica PDMS al principio del canal con un taladro. El diámetro de la broca es de 1,2 mm.</li>
		</ol></li> <li>Sellado <ol><li>sello de la réplica PDMS con el canal a una capa PDMS plana sin patrón por un tratamiento de plasma de oxígeno en las superficies de las dos capas PDMS. 
			Nota: El proceso general de preparación de la viruta tiene unos 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Fabricación de RSF fibra <ol><li>inyección de spinning droga <ol><li>inyectar la RSF spinning droga en los microcanales de 2 μl/min por una bomba de jeringa.</li>
		</ol></li> <li>Reglamento de medio ambiente <ol><li>ajustar la humedad relativa a 40 ± 5% RH o 50 ± 5% RH usando un humidificador. A 40 hr ± 5%, como hilado fibra solidificó más rápido que 50 ± 5% RH.</li>
		</ol></li> <li>Fibra producción de RSF <ol><li>toque la gota RSF por un puntito a la salida del canal microfluídico, extraer fibra RSF en el aire, y luego la carrete sobre un rodillo a través de un boquete de aire de 10 cm a una velocidad de 3 cm/s ( Figura 1b ).</li>
		</ol></li> <li>Tienda las fibras de la RSF en un desecador sellado por 24 h.</li>
		<li>Tratamiento de post de fibra <ol><li>dibuja las fibras como girar 4 veces a 0.9m m s -1 en 80 vol % ethanol la solución por una máquina a la medida y luego mantenga la fibra dibujada fijo y sumerja las fibras en la solución durante 1 h. Debido a este tratamiento, la longitud de la fibra cambiada de originalmente 15 mm a 60 mm.</li>
		</ol></li> <li>Preparación de la muestra para la caracterización <ol><li>fijar las fibras post-tratadas en un marco de papel con una longitud de 10mm de calibre. Al menos 20 fibras son necesidad de medida, incluidos en el ensayo de tracción, SEM, FTIR y WAXS. Los diámetros de la gama de fibras post-dibujado de 5 a 10 μm. figura 1 muestra el esquema de la producción de la fibra y WAXD caracterización. Las propiedades mecánicas de las fibras RSF fueron examinadas por un sistema de prueba material (25 ± 2) ° C y (45 ± 5) % de humedad relativa. La extensión de la tarifa y medidor de longitud fueron de 2 mm/min y 1 cm, respectivamente.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. Radiación de sincrotrón caracterización de cristalina estructura de RSF fibra <ol><li>caracterización de la radiación del sincrotrón 4 , 13 , 17 <ol><li>ajuste de línea <ol><li>ajustar la longitud de onda de los rayos x y tamaño de punto a 0,07746 nm y 2 de 3 x 2 μm, respectivamente. 
			Nota: El protocolo se lleva a cabo mediante la línea de BL15U1 en las instalaciones de Radiación Sincrotrón Shanghai.</li>
		</ol></li> <li>Ubicación del punto de rayos x <ol><li>encontrar la ubicación del punto de rayos x. 
			Nota: La ubicación del punto de rayos x es ajustada por el técnico de laboratorio en las instalaciones de radiación sincrotrón.</li>
		</ol></li> <li>Pruebas de muestra estándar: dióxido del cerio (CeO 2) <ol><li>prueba un muestra estándar CeO 2 en polvo. El CeO 2 polvo fue caracterizado para calcular el centro del círculo y la distancia entre la muestra y el detector de.</li>
		</ol></li> <li>Preparación de la muestra <ol><li>fijar los filamentos RSF en paralelo entre sí en el marco de papel con una longitud de 10 mm de calibre. Pegar el marco de papel en la etapa de pruebas. 
			Nota: Mantenga la fibra horizontal.</li>
		</ol></li> <li>SR WAXD pruebas <ol><li>Abra el obturador <ol><li>cerrar la puerta de la estación de la línea después de asegurarse de que no hay ninguna persona en la habitación. Abra el obturador de la fuente del haz de rayos x.</li>
			</ol></li> <li>Enfoque <ol><li>mover la fibra ligeramente hasta que en el enfoque. Ajuste la ubicación de la fibra a lo largo de la x, y, dirección de z remotamente a través de un software ( figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Exposición de la muestra <ol><li>mover la fibra arriba y abajo remotamente mediante un software, hasta que en el lugar de rayos x. Presione el botón start en el software para exponer la fibra a la línea de rayos x por 20 s ( figura 1C).</li>
			</ol></li> <li>Fondo difracción <ol><li>la difracción del fondo del aire con el tiempo de exposición de 20 s. mueve la fibra de la lugar de rayos x remotamente a través de un software de prueba. Prensa el &#34; Inicio &#34; botón en el software para exponer la línea de rayos x para &#34; medio de aire &#34; para 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>Procesamiento de datos SR-WAXD 13 <ol><li>calibración del Software <ol><li>los datos WAXD usando FIT2D (V12.077). Calibrar el centro del círculo y la distancia de la muestra al detector utilizando los datos de la difracción del polvo CeO 2.</li>
		</ol></li> <li>Patrón de difracción 2-D <ol><li>restar el fondo de aire desde el patrón de difracción de fibra con FIT2D (V12.077).</li>
		</ol></li> <li>Tamaño de cristalinidad y cristalito <ol><li>integrar la intensidad de la difracción como una función de dispersión de ángulo 2θ. Realizar una deconvolución de la integración de la intensidad de pico automático separación software (versión 4.12) 12. Se estimó el grado de cristalinidad, x c, de la relación: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , donde yo c es la suma de las intensidades integradas de los picos de cristalinos y un es la intensidad integrada de los amorfos halo 4 , 11. La integración de los patrones WAXD demostró la anchura del pico de la [200], [020], [002] reflexiones. El FWHM de estos picos fueron utilizados para determinar el tamaño de cristalito a lo largo de la a, b y c ejes utilizando Scherrer &#39; fórmula s 4.</li>
		</ol></li> <li>Determinación de las orientaciones de cristalito <ol><li>calcular las orientaciones de los cristalitos y amorfa según azimuthal integraciones de (020) y (210) picos 11. La orientación cristalina puede calcularse cuantitativamente según Herman &#39; orientación s. Aquí, ambos (020) y picos (210) fueron equipados con dos funciones Gaussian. El más estrecho es de orientación cristalina y el otro más amplio es para el material amorfo orientada 13. Aquí, las orientaciones del cristalito de fibras RSF fueron comparadas usando todo el ancho en el medio máximo (FWHM) de los picos de integraciones azimutal (002).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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	<li>Asakura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+structure+and+function+of+the+spinning+apparatus+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori.</a> Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).</li><li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk.">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).</li><li>Zhou, G. Q., Shao, Z. Z., Knight, D. P., Yan, J. 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Los autores no tienen nada que revelar.

Durante la diálisis de la solución RSF, el valor del pH es fundamental para el proceso de concentración. Si el valor del pH del agua desionizado es menor que 6, la solución RSF será más fácil durante el proceso de concentración del gel. Para evitar la gelificación, CaCl2 se agrega a la solución RSF. La concentración de CaCl2 es de 1 mmol por peso de RSF.
Nuestro trabajo previo demostró la posibilidad de microfluidos seco-spinning de una solución acuosa de RSF...

Araña y el gusano de seda pueden producir fibra de seda pendiente de solución acuosa de proteína a temperatura y presión. Flujo extensional y corte puede inducir la formación de la textura de cristal líquido en la glándula de seda1. En los últimos años ha habido un gran interés en imitar el proceso de hilado de la araña para producir fibras artificiales de alta resistencia. Sin embargo, grandes cantidades de proteína de seda de araña pueden producir eficientemente y económicamente por agricultura arañas debido al canibalismo. Grandes cantidades de seda de gusano de seda pueden obtenerse fácilmente por cultivo. De lo contrario, el gusano de seda y la araña tienen una composición similar de proceso y del aminoácido de spinning. Por lo tanto, fibroína de seda de gusano de seda es seleccionada como un sustituto a hilar seda animal artificial por muchos investigadores.
Araña y el gusano de seda sacan solución proteica a través de su conducto de spinning en fibra en el aire. Las fuerzas de alta tensión generadas a lo largo del conducto de spinning más probable estiran las moléculas de fibroína de seda para una conformación más extendida de2. Seda artificial fibras han sido hiladas mediante hilatura convencional de húmedo y seco-spinning procesos3,4, que no toman en cuenta las fuerzas fluidas generadas en el conducto de spinning.
En primer lugar, se utilizaron enfoques de microfluidos para investigar el conjunto de proteínas de seda5,6. Entonces, microfluidos fabricación de RSF se estudió mediante el corte y extensional fuerzas7,8de modelado. Módulo de Young y diámetro de las fibras RSF pueden ajustarse por hilatura húmeda microfluídicos, pero resistencia a la tracción de la fibra dibujada era menos de 100 MPa7. Por último, fibras de alta resistencia RSF con éxito fueron preparadas utilizando el método de microfluidos seco-spinning, pero el diámetro de la fibra es sólo de 2 μm8. Recientemente, hilado húmedo microfluídicos fue utilizado con éxito en la producción de fibra de seda de araña recombinante de alta resistencia. El post-giro dibujo en el aire había mejorado los defectos superficiales e internos de fibra artificial9.
En este estudio, se introduce la microfluídica mejorada spinning proceso de fibra RSF. Su objetivo es imitar el proceso de hilado de seda de gusano de seda, como la droga de giro, fuerzas y proceso seco-que hace girar de la corte. Este método de spinning no sólo puede producir fibra de seda artificial de alta resistencia, pero también puede ajustar el diámetro de la fibra. En primer lugar, el RSF spinning droga fue cortado y alargado en un canal biomimic con un decaimiento exponencial de segundo orden. En segundo lugar, las influencias de la humedad relativa (HR) sobre la morfología de la fibra y propiedades fueron estudiadas en la microfluídica seco-spinning proceso10. En comparación con la hilera de hilatura convencional, nuestro sistema de microfluidos es altamente biomiméticos y puede ser utilizado para producir fibra de alta resistencia de las soluciones a temperatura ambiente por el seco o mojado método de giro.
Debido a la alta resolución, alto brillo y alta energía de la radiación del sincrotrón microfocus rayos x, puede ser utilizado para caracterizar la microestructura de una sola fibra con un diámetro de varios micrómetros4,11 , 12 , 13 , 14. aquí, SR WAXD técnica fue utilizada para calcular la cristalinidad, tamaño del cristalito y orientación cristalina de fibras RSF.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. mori&lt;/em&gt; Cocoons</td><td>Farmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Lithium bromide, 99.1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous, 96.0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, 99.7%</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China</td><td>10009218</td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Developing solution</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Concentrated sulfuric acid</td><td>Pinghu Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>30 vol% hydrogen peroxide</td><td>Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>&amp;nbsp;KD Scientific, USA</td><td></td><td>KDS 200P</td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>SEN electric</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driller</td><td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., China</td><td></td><td>bench drilling machine Z406c</td></tr><tr><td>Material testing system</td><td>Instron, USA</td><td></td><td>Model: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., USA</td><td></td><td>Version 4.12</td></tr></tbody></table>

microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers

El protocolo muestra un método para imitar el proceso de hilado del gusano de seda. En el proceso de hilado nativo, el contratante conducto de spinning permite las proteínas seda compacto y ordenado por las fuerzas de cizallamiento y el alargamiento. Aquí, un canal de microfluidos biomiméticos fue diseñado para imitar la geometría específica del conducto giro del gusano de seda. Giro regenerado fibroína de seda (RSF) dopado con alta concentración, se saca a través de microcanales a las fibras del seco-centrifugado a temperatura ambiente y presión. En el proceso de los tratados, las fibras de hilado como fueron dibujadas y almacenadas en la solución acuosa de etanol. Tecnología de difracción de rayos x de gran angular (SR-WAXD) radiación del sincrotrón fue utilizada para investigar la microestructura de solo fibras RSF, que fueron fijados a un soporte de muestra con el eje de la fibra RSF el microhaz de la radiografía normal. La cristalinidad, tamaño del cristalito y orientación cristalina de la fibra se calculan a partir los datos WAXD. Los arcos de difracción cerca del Ecuador del patrón bidimensional WAXD indican que la fibra post tratada de RSF tiene un grado alto de orientación.

Fibras de alta resistencia RSF fueron producidas con éxito usando el método de giro de microfluidos. Las curvas tensión-deformación e imágenes de SEM de las fibras estiradas de RSF C44R40 se muestran en la figura 2. Por lo menos 10 fibras fueron medidos en el ensayo de tracción. Curvas tensión-deformación fueron escogidas según el valor promedio de la última hora tensión y la tensión de las fibras. Los datos WAXD de las fibras se muestran en la <s...

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Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Seco de microfluidos-spinning y caracterización de las fibras regeneradas fibroína de seda

Se presenta un protocolo para el spinning de microfluidos y caracterización de la microestructura de monofilamento de fibroína de seda regenerado.

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

microfluidic-dry-spinning-characterization-regenerated-silk-fibroin

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K vistas.  Donghua University. Se presenta un protocolo para el spinning de microfluidos y caracterización de la microestructura de monofilamento de fibroína de seda regenerado.

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Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

Cine Cultura de la Seda del sistema para In vitro Análisis y Diseño de Biomateriales

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

Investigación

Bioingeniería

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

La producción de seda sintética araña a escala de laboratorio

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly repetitive protein has a molecular weight of 48kDa and is soluble in different solvents (hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid and aqueous buffers). eADF4(C16) provides a high potential for various technical applications when processed into morphologies such as films, capsules, particles, hydrogels, coatings, fibers and nonwoven meshes. Due to their chemical stability and controlled morphology, the latter can be used to improve filter materials. In this protocol, we present a procedure to enhance the efficiency of different air filter devices, by deposition of nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins. Electrospinning of eADF4(C16) dissolved in HFIP results in smooth fibers. Variation of the protein concentration (5-25% w/v) results in different fiber diameters (80-1,100 nm) and thus pore sizes of the nonwoven mesh.
Post-treatment of eADF4(C16) electrospun from HFIP is necessary since the protein displays a predominantly &alpha;-helical secondary structure in freshly spun fibers, and therefore the fibers are water soluble. Subsequent treatment with ethanol vapor induces formation of water resistant, stable &beta;-sheet structures, preserving the morphology of the silk fibers and meshes. Secondary structure analysis was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and subsequent Fourier self-deconvolution (FSD).
The primary goal was to improve the filter efficiency of existing filter substrates by adding silk nonwoven layers on top. To evaluate the influence of electrospinning duration and thus nonwoven layer thickness on the filter efficiency, we performed air permeability tests in combination with particle deposition measurements. The experiments were carried out according to standard protocols.

Spider silk fibers display extraordinary mechanical properties. Engineered Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) can be processed into nonwoven meshes using electrospinning. Here, the eADF4 nonwoven meshes are used to improve the performance of air filtering devices.

Filtro de aire dispositivos, incluyendo mallas tejidas de electrospun recombinantes Las proteínas de seda de araña

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

El diseño de proteínas de seda-seda aleaciones para aplicaciones biomédicas

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

Impresión reactiva de inyección de tinta y análisis de propulsión de microagitadores autopropulsados basados en la seda

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

Química

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups may be utilized to study material-biomarker interactions i.e. act as biosensors with potential as single molecule detectors. We have developed an effective approach for preparing functional polymers where the functionality has the capacity of specifically binding with a model protein. In our model system, the functional group is 2,4-dinitrophenyl (DNP) and the protein is anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). The functional polymer, &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), is prepared by anionic living polymerization. The difunctional initiator utilized in the polymerization was prepared by electron transfer reaction of &alpha;-methylstyrene and potassium (mirror) metal. The 2-methoxystyrene monomer was added first to the initiator, followed by the addition of the second monomer, ethylene oxide, and finally the living polymer was terminated by methanol. The &alpha;,&omega;-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] was reacted with N-2,4-DNP-&isin;-amino caproic acid, by DCC coupling, resulting in the formation of &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). The polymers were characterized by FT-IR, 1H NMR and Gel Permeation Chromatography (GPC). The molecular weight distributions of the polymers were narrow (1.1-1.2) and polymers with molecular weights greater than 50,000 was used in this study. The polymers were yellow powders and soluble in tetrahydrofuran. A water soluble CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimethoxyethylene glycol) complex binds and achieves steady state binding with solution IgE within a few seconds. Higher molecular weight (water insoluble i.e. around 50,000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymers, containing 1% single wall carbon nanotubes (SWCNT) were processed into electroactive nanofibers (100 nm to 500 nm in diameter) on silicon substrate. Fluorescence spectroscopy shows that anti-DNP IgE interacts with the nanofibers by binding with the DNP functional groups decorating the fibers. These observations suggest that appropriately functionalized nanofibers hold promise for developing biomarker detection device.

An efficient approach for preparing nanofibers decorated with functional groups capable of specifically interacting with proteins is described. The approach first requires the preparation of a polymer functionalized with the appropriate functional group. The functional polymer is fabricated into nanofibers by electrospinning. The effectiveness of the binding of the nanofibers with a protein is studied by confocal microscopy.

Procedimiento para la fabricación de nanofibras Biofuncionales

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

Biología

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Neurociencias

<meta charset="utf8"></head><body>Formación y fijación de membranas FN-Silk a insertos de cultivo celular

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Mejora de modelos de cultivo celular in vitro con membranas de seda de araña funcionalizadas recombinantes

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

Seco de microfluidos-spinning y caracterización de las fibras regeneradas fibroína de seda

Resumen

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En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida